2017, Vol. 37
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2. 中国农业科学院研究生院, 北京 100081
2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081
磷是地球生命系统中的主要营养元素之一，是生命体中多种生物大分子如DNA、RNA、ATP、磷脂的组分元素，参与光合、呼吸等重要生命过程，在能量贮存、迁移和转化过程中起关键性作用(Marschner，1995).土壤中磷素形态转化及其有效性影响作物生长发育与产量品质的提升，磷也可通过地表径流、土壤侵蚀进入到水体环境中，导致面源污染(Weld，2002).
同位素示踪技术是定量跟踪农田生态系统中磷的形态转化与有效性的重要工具.磷同位素共有23种，包括24P 至46P，放射性同位素32P和33P半衰期分别为14.3 d和25.3 d，广泛用于磷示踪研究，但半衰期短，存在放射性风险，难以应用于空间尺度大、周期长的试验以及开放性环境研究.31P是磷在自然界中唯一丰度100%的稳定同位素，因此无法直接采用稳定性磷同位素开展标记试验.磷的电负性为2.1，是一个亲氧元素，自然界中磷酸盐多以磷原子与4个氧原子紧密相联形式存在(褚群，2012；Blake et al.，2005；Liang and Blake，2007).磷酸盐中的P-O键的键能较强，可以抵抗自然条件中物理过程的破坏，在自然温度和pH 条件下十分稳定，沉淀溶解、吸附解吸等过程中P-O键也不易断裂，磷酸盐中氧原子和水中氧原子交换过程缓慢，所带来的同位素分馏效应很小(<1‰)(Blake et al.，2005).氧有3种稳定同位素，16O、17O、18O，在地球圈分别占99.759%、0.037%和0.204%(Ayliffe et al.，1992；et al.，2005)，选择16O和18O来间接示踪生态环境中磷的来源和循环转化过程开始被关注.样品氧同位素丰度组成用δ18O表示，定义为
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式中，Rsample为样品18O/16O原子丰度比值，RVSMOW 是维也纳标准平均海洋水(Vienna standard mean ocean water)的18O/16O原子丰度比值.
磷酸盐氧同位素δ18O-P用来示踪研究水体中磷循环转化已有报道(Mclaulghlin，2004; 2006a;2006b;2006c).自然环境条件下，微生物、磷酸酶催化等生物反应，使磷酸盐与周边水中氧发生交换，导致磷酸盐中氧同位素(δ18 O-P)出现同位素分馏.Longinelli等(1973)最先发表了磷酸盐和周围水体间氧同位素交换平衡分馏系数与温度的关系式：T=111.4-4.3(δ18O-P-δ18O-H2O)，式中T代表海水温度，δ18O-P和δ18O-H2O分别代表磷灰石中磷酸盐和磷灰石形成时周围水分子的氧同位素组成.根据实测温度和水δ18O-H2O，计算出磷酸盐δ18O-P的预测平衡值.若磷酸盐δ18O-P的实测值和计算值越接近，说明磷酸盐和周围水分子间氧同位素越接近平衡分馏，即生物对磷的利用效率越高；反之，若实测值与计算值相差越远，说明偏离平衡分馏，即生物对磷的利用效率越低.McLaughlin等(Mclaulghlin，2004; 2006a;2006b;2006c)利用磷酸盐氧同位素示踪技术定量研究在水生生态系统的磷动态变化：采用Mg(OH)2-PO4共沉淀(MAGIC共沉淀法)来富集水体中的磷酸盐，通过形成CePO4沉淀分离净化，然后通过阳离子树脂去除铈离子，再加入硝酸银溶液，最终得到磷酸银沉淀用元素分析仪-稳定性同位素比例质谱仪测试样品中氧同位素.
磷酸盐氧同位素示踪技术也开始被用于追踪研究土壤-植物系统中磷转化过程，但土壤中磷酸盐δ18O-P的研究报道还较为有限，不同实验室采用的土壤磷酸提取分离纯化方法往往不同(张晗等，2015a；Tamburini et al.，2014).Zohar等(2010)利用H2O、NaHCO3、NaOH和HCl对土壤中磷酸盐进行形态分级，并将每步提取的无机磷酸盐分别沉淀为Ag3PO4，分析土壤不同形态磷酸盐的δ18O-P值.Weiner等(2011)使用饱和碳酸氢根交换性树脂提取土壤中易被植物吸收的无机磷，然后用将磷酸盐从膜中洗脱下来，用DAX-8大孔树脂去除有机物，按照McLaughlin(2004)方法得到纯净磷酸银沉淀，测定土壤树脂浸提磷酸盐的δ18O-P值.Tamburini等(2010)采用APM-MAP多步沉淀法即以磷酸钼铵和磷酸铵镁先后沉淀-溶解-沉淀的方法得到纯净Ag3PO4.对HCl浸提的土壤磷酸盐氧同位素进行分析.张晗等(2015b)采用APM-MAP多步沉淀法，即以磷酸钼铵和磷酸铵镁先后沉淀-溶解-沉淀的方法，对土壤中HCl浸提的无机磷酸盐进行分离纯化，通过H2O2漂洗去除有机质后，辅助氨水重结晶去除Ag3PO4中夹杂的Ag2O和Ag等杂质，测定厦门集美地区森林、公园和农田土壤HCl提取磷酸盐δ18O-P值为15.2‰~19.5‰.土壤中含氧化合物较多，如碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐及有机物，氧同位素来源复杂，土壤磷酸盐氧同位素提取分离较为困难；另外磷酸盐提取与分离过程中，土壤中焦磷酸盐、有机磷酸盐水解或氧交换可能会带来非磷酸盐中氧同位素(张晗等，2015a；Tamburini et al.，2014)；磷酸盐沉淀过程会吸附其它含氧化合物造成δ18O-P值失真(O′Neil et al.，2003).
0.5 mol·L-1碳酸氢钠(NaHCO3)提取剂被广泛用于浸提土壤有效磷.利用NaHCO3提取的土壤中无机磷酸盐(Olsen-P)主要是吸附在土壤胶体表面和土壤溶液中的磷酸盐，被认为是土壤中可被植物吸收利用的磷组分(鲍士旦，2004)，测定NaHCO3提取的土壤磷酸盐δ18O-P对于深入研究土壤中有效磷转化与溯源具有重要意义.
本文选择潮土和黑土2种土壤，采用0.5 mol·L-1 NaHCO3(pH为8.5)提取土壤有效磷，通过对样品中的无机磷酸盐进行富集、纯化，获得Ag3PO4，利用元素分析仪-稳定性同位素比例质谱仪(Elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers，EA-IRMS)测定其中的δ18 O-P值，对磷酸盐分离纯化过程氧同位素值分馏的影响进行评估，建立NaHCO3提取的土壤无机磷酸盐中氧同位素分析技术.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 供试土壤潮土采自山东省聊城市高唐县，土壤pH为8.04(水土体积质量比为5 mL/1 g)、有机质6.84 g·kg-1、全氮1.14 g·kg-1、Olsen-P 21.28 mg·kg-1.黑土采自黑龙江省哈尔滨市民主乡，土壤pH为6.47、有机质26.8 g·kg-1、全氮1.65 g·kg-1、Olsen-P 75.18 mg·kg-1.
2.2 仪器与试剂仪器：X射线衍射仪型号：Empyrean(PANalytical 公司)、元素分析仪-稳定性同位素比例质谱仪型号：vario PYRO cube-IsoPrime100(Elementar Analysensysteme GmbH).
试剂：六水硝酸镁、硝酸铈、硝酸银(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；DAX-8大孔树脂(40~60目，Sigma-Aldrich公司)；Ag3PO4标准参考品(δ18O=21.7‰±0.3‰，Elemental Microanalysis Ltd公司).
2.3 土壤磷酸盐提取、富集与纯化步骤1磷酸盐提取：准确称取16.00 g过2 mm筛土壤样品于塑料瓶中，加入160 mL 0.5 mol·L-1 NaHCO3溶液(pH 8.5)，于25 ℃下以200 r·min-1速度振荡16 h，离心收集上清液，加入1 g无磷活性炭，振荡30 min，滤纸过滤，滤液用3 mol·L-1 HNO3调节pH到1.0，用涡旋仪振荡去除溶液中HCO3-.
步骤2 MAGIC共沉淀法富集磷酸盐：参照McLaughlin等(2004)方法，用1 mol·L-1 NaOH调节溶液pH至12，加入Mg(NO3)2·6H2O，静置过夜，离心弃去上清液，用1 mol·L-1 HNO3溶解沉淀，用2 mol·L-1 CH3COONa调节pH到5.5；加入8 g DAX-8大孔树脂，振荡过夜，吸附除去样品中的有机物，滤纸过滤，使树脂与样品溶液分离.
步骤3 CePO4沉淀纯化： 在上述滤液中加入0.5 mol·L-1 Ce(NO3)3溶液，搅拌后，在4 ℃条件下静置过夜.6000 r·min-1下离心分离 CePO4沉淀，用0.5 mol·L-1 CH3COONa溶液洗涤沉淀并离心直至无Cl-检出(滴加AgNO3溶液检测洗涤液中有无Cl-).用1 mol·L-1 HNO3溶解CePO4沉淀，加入731型H+型阳离子交换树脂，振荡10 h，过滤.
步骤4形成Ag3PO4沉淀：在滤液中加入2滴溴百里酚蓝指示剂，用氨水和3 mol·L-1的HNO3调节溶液pH 8.0，加入0.5 mol·L-1 AgNO3溶液，得到Ag3PO4沉淀，低温下静置过夜，离心分离Ag3PO4并用超纯水洗涤数次，分离Ag3PO4沉淀干燥后遮光保存待测.
对上述步骤2~4中分别采集沉淀前溶液和沉淀后离心的上清液，利用磷钼蓝比色法测定其中的磷含量，通过差减计算每步沉淀过程中P回收率.
2.4 Ag3 PO4 中氧同位素测定称取0.5 mg左右Ag3PO4样品，包入银舟中，放入元素分析仪(EA)自动进样器中，样品在1450 ℃高温条件下裂解，释放O原子被玻璃碳和石墨转化为CO，CO 在He气(流速80 mL·min-1)吹扫下进入色谱柱，在85 ℃条件下与载气中痕量N2 分离，进入稳定性同位素比例质谱仪(IRMS)中电离，按照质量/电荷比进行分离测定.
EA工作条件：He气压力0.2 MPa，CO解吸温度110 ℃；IRMS工作条件：电压3.117 V，电流1.5 mA，CO参考气信号12.6 nA.采用纯Ag3PO4标准参考品作为实验室工作标准，质谱CO 参考气校准采用国际原子能机构提供的IAEA-601标准参照品Benzoic Acid(δ18O=23.3‰±0.3‰).
2.5 分离得到的Ag3PO4纯度测定参照Tamburini等(2010)和张晗等(2015b)方法，利用EA-IRMS分别测量Ag3PO4样品和标准品中氧元素含量，验证分离得到的Ag3PO4样品纯度.采用X射线衍射仪(XRD)测定分离纯化得到的Ag3PO4样品矿物结构，并与标准图谱比较，检验Ag3PO4样品纯度.XRD工作条件：电压40 kV，电流40 mA，粉末多晶衍射方式连续扫描模式，测量角度5.000°~65.0054°.
2.6 全流程氧同位素分馏检测按照 McLaughlin等(2004)和陈志刚(2010)方法，吸取10 mL 100 mg·L-1的KH2PO4溶液，直接加入过量AgNO3形成Ag3PO4沉淀.同时吸取10 mL上述KH2PO4溶液，按照2.3节土壤中磷酸盐富集与纯化步骤生成Ag3PO4沉淀，测定Ag3PO4的δ18O-P值，比较两者结果差异，检验磷酸盐分离流程中氧同位素是否出现分馏.
3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 提取纯化过程中磷回收率土壤碳酸氢钠浸提液中磷酸盐富集、分离与纯化流程中包括MAGIC共沉淀、磷酸铈沉淀及磷酸银沉淀等实验步骤，涉及到磷酸盐在固液相间转化.表 1结果表明：这3个实验步骤中P回收率均在93%以上，较高的磷酸盐回收率不仅可以减少土壤样品浸提需要量，也说明纯化分离过程中固液相之间磷酸盐转化较完全，减小了实验流程造成磷酸盐氧同位素分馏的可能.
| 表 1 土壤Olsen-P 氧同位素提取纯化过程中P回收率 Table 1 Recovery of inorganic phosphate during the process of extraction，purification and conversion of soil Olsen-P to Ag3PO4 |
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图 1A是本实验提取Ag3PO4 的XRD测定谱图，与Ag3PO4的标准谱图(谱库中编号02-070-0702)比较，2个谱图十分吻合，说明本实验得到的Ag3PO4样品纯净度较高.
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| 图 1 Ag3PO4X射线衍射谱图 Fig. 1 X-ray diffraction diagrams of Ag3PO4 |
本实验样品包裹在银舟中，在元素分析仪(EA)的裂解管中1450 ℃高温下发生裂解反应，释放O原子被玻璃碳和石墨转化为CO.图 2是裂解产生氧元素含量(以CO峰高计)与Ag3PO4样品量之间相关关系图.结果发现，Ag3PO4标准品和实验提取的Ag3PO4样品裂解产生的氧元素含量与样品量间呈良好的线性关系(R2=0.9968，n=12)，表明，本实验提取的Ag3PO4样品中氧元含量组成比例和Ag3PO4标准品吻合，进一步验证了提取的Ag3PO4样品纯度较高.
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| 图 2 土壤Olsen-P分离纯化得到的Ag3PO4样品与Ag3PO4标准品产生的CO量线性图 Fig. 2 Relationship between the area of the CO peak for Ag3 PO4 standard and samples obtained from soil Olsen-P.All samples lie along the regression line defined by the pure Ag3PO4 standards，indicating pure Ag3PO4 |
本次实验利用EA-IRMS对Ag3PO4标准品进行了6次测量，结果为δ18O=21.7‰±0.2‰，标准品出售公司Elemental Microanalysis Ltd标定值为δ18O=21.7‰±0.3‰，说明本次实验EA-IRMS调试后工作条件稳定，满足测定δ18O-P需求.
3.4 实验流程中磷酸盐氧同位素分馏判断利用KH2PO4试剂配置溶液直接与AgNO3反应形成Ag3PO4沉淀，测定其δ18O-P值为6.82‰±0.26‰(n=4).KH2PO4溶液通过MAGIC共沉淀富集、磷酸铈沉淀及磷酸银沉淀等实验流程后形成Ag3PO4沉淀，δ18O-P值为6.67‰±0.31‰(n=4)，两者之差小于0.5‰，在方法误差接受范围之内，表明本实验土壤提取的磷酸盐在分离纯化全流程中没有产生氧同位素分馏.Tamburini等(2010)向土壤样品HCl提取液中加入18O标记水，全程示踪磷酸盐通过APM-MAP多步沉淀法得到磷酸银过程中是否发生氧同位素分馏，结果证明实验过程不会造成同位素分馏.
3.5 土壤样品δ18O-P测定结果由于土壤有机质含有氧，会影响磷酸盐δ18O测量值的准确度，土壤Olsen-P提取过程中加入无磷活性炭，用来吸附浸提液中的有机质(鲍士旦，2004).表 2结果表明，加入与未加入无磷活性炭，土壤Olsen-P的δ18O-P测量值有较大差异，未加入无磷活性炭潮土和黑土δ18O-P平均值为-3222.06‰和-1916.17‰，δ18O-P值出现明显偏离.
加入无磷活性炭，测定的潮土和黑土δ 18O-P值分别为17.64‰±1.03‰和18.20‰±0.83‰，2种土壤δ18O-P值差异不明显.Tamburini等(2010)报道瑞士与以色列2地不同施肥处理的土壤HCl提取磷酸盐δ18O-P为13.5‰~17.6‰，农田土壤中磷酸盐δ18O-P相对富集，为19‰左右.Zohar等(2010)用废水和肥水灌溉土壤样品1个月，测定了土壤中不同形态磷含量和δ18O-P，发现肥水灌溉后，水提取的土壤水溶性磷酸盐出现同位素平衡分馏特征，易受土壤中酶活动控制.NaHCO3提取磷易与水溶性磷酸盐发生交换，δ18O-P值在19.0‰~20.3‰.
Young等(2009)研究表明：以色列化学肥料中磷酸盐δ18O-P为17.2‰~22.3‰，法国农田化学肥料中δ18O-P为19.6‰~23.1‰.Mclaughlin等(2006a)报道：2种化学肥料中δ18O-P分别为19.4‰和20.5‰.本文测试2种农田土壤的δ18O-P结果在上述δ18O-P变化范围内，说明土壤有效磷供给主要来源于化学肥料.
| 表 2 潮土和黑土Olsen-P 的氧同位素δ18O-P值 Table 2 Isotopic oxygen composition(δ18O-P)of soil Olsen-P extracted from Fluvo aquic soil and Black soil |
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1) 利用0.5 mol·L-1 NaHCO3结合加入无磷活性炭提取土壤有效磷，对样品中磷酸盐通过MAGIC共沉淀、磷酸铈沉淀等过程进行分离纯化，获得磷酸银沉淀，3个关键过程中磷酸盐回收率均达到93%以上，磷酸盐损失较少.
2) XRD和氧含量测定表明，磷酸银沉淀纯化效果较好，分离纯化过程中未出现氧同位素分馏.
3) 加入无磷活性炭有效去除了有机质中氧同位素对土壤磷酸盐δ18O-P测定的影响.
4) 本研究建立了土壤碳酸氢钠提取无机磷酸盐中氧同位素分析测定方法，测定供试黑土和潮土δ18O-P分别为17.64‰±1.03‰和18.20‰±0.83‰，为农田土壤中磷的循环转化及其溯源研究提供技术支撑.
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