1 引言(Introduction)

生物过滤法是处理挥发性有机物(VOCs)和恶臭气体的主要技术之一，由于其高效率、低成本、低二次污染等优点而受到广泛的研究和应用(Berenjian et al., 2012；席劲瑛等, 2006).填料是生物滤塔的重要组成成分，它对生物量的增长累积、气流流动和气液交换效率均有影响(席劲瑛等，2010)，是影响生物滤塔性能的重要因素.常见的填料有珍珠岩(Kibazohi et al., 2004)、火山岩(Langolf et al., 2006)、堆肥(Quinlan et al., 2011)等，目前的研究主要集中在填料对生物滤塔性能的影响，关于填料对生物滤塔微生物群落影响的研究较少.

另一方面，生物滤塔去除VOCs的主要途径是微生物的降解作用，研究生物滤塔中的微生物群落对生物滤塔的长期稳定运行和去除效率的提升具有重要的意义.目前文献报道中生物滤塔内的微生物主要分布于变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)(Babbitt et al., 2009; Estrada et al., 2012; Fu et al., 2011; Pérez et al., 2015)，典型的VOCs降解菌有假单胞菌属(Pseudomonas)(Roy et al., 2003; Saingam et al., 2016)、红球菌属(Rhodococcus)(Lee et al., 2010; Malhautier et al., 2014)等.但现有生物滤塔中的微生物群落研究多为微生物群落结构的研究，有关微生物群落代谢的报道较少，对微生物群落结构与代谢功能的关系也缺乏研究.

基于此，本研究以活性污泥作为接种物，以甲苯为唯一碳源，分别采用珍珠岩、玻璃珠和聚苯乙烯泡沫(EPS)3种填料搭建3个生物滤塔.采用Illumina MiSeq高通量测序技术研究生物滤塔中的微生物群落结构，采用Biolog技术研究生物滤塔中的微生物群落代谢功能，比较不同填料的甲苯生物滤塔中微生物群落异同，并对生物滤塔中微生物群落结构与代谢功能的关系进行探究.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 生物滤塔

实验装置为3个材质与结构完全相同的生物滤塔，具体如图 1所示.3个滤塔的填料分别为珍珠岩、玻璃珠和EPS.滤塔的高度为25 cm，内径为12 cm，填料层高度为15 cm，填料层体积约1.7 L，使用的填料的部分特性如表 1所示.实验中气体流量为2.2 L·min^-1，停留时间46 s，实验过程中温度保持在约25 ℃.

3个生物滤塔均采用北京某污水厂的活性污泥接种，接种量为1 L，循环喷淋2 h后完成生物滤塔的接种.3个生物滤塔同时运行，连续运行时间为42 d，期间甲苯的进气负荷为50~100 g·m^-3·h^-1，3个生物滤塔在同一时期的甲苯进气浓度一致.生物滤塔运行过程中定期喷淋营养盐溶液，营养盐成分为10 g·L^-1 NaNO₃、2.56 g·L^-1 Na₂HPO₃和1.66 g·L^-1 KH₂PO₃，总体积为800 mL，pH在6.5~7.2之间，营养盐采用循环喷淋方式喷淋，喷淋液每3 h喷淋1 min，每3~4 d更换1次.

2.2 实验方法

分别从接种物(0 d)、运行初期(17 d)生物滤塔和稳定运行期(42 d)生物滤塔中取样，每个生物滤塔每次取样包括填料层高度为0、7.5和15 cm 3个位置的样品，将3个位置的样品混匀后，再取混匀后的样品约10 mL置于50 mL离心管中，加入15 mL PBS，在漩涡振荡仪上(WIGGENS Vortex 3000) 以最大速度振荡10 s，静置1 min.底部悬浊液用于DNA提取，上清液用于Biolog实验.

DNA提取：采用MP试剂盒(MP Biomedicals, Fast DNA SPIN Kit for Soil, Canada)进行DNA提取.提取的DNA由诺禾致源公司的Illumina MiSeq测序平台进行测序，采用的引物为位于16S rRNA基因V4区的515F(5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′).

Biolog实验：首先测定上清液的OD₆₀₀值，然后用PBS稀释到OD₆₀₀=0.05，取稀释后的悬浊液注入Biolog ECO板，每孔注入150 μL.将Biolog ECO板置于培养箱中，30 ℃下培养，每隔3~8 h使用酶标仪(Tecan Infinite F50，Austria)测定OD₆₀₀值，连续测定80 h.

2.3 分析方法

微生物群落结构分析：测序完成后根据Barcode序列和引物序列使用FLASH进行拼接，使用QIIME软件进行质量控制，使用Uchime软件去除嵌合体序列，得到最终的有效数据，在97%的相似度水平下聚类得到OTU数据.QIIME软件分析微生物群落结构门、属水平变化，SPSS22.0软件进行微生物群落结构主成分分析.

微生物群落代谢分析：使用平均色度(AWCD)表征微生物对碳源的整体代谢能力，AWCD的计算参照文献(王灿等，2010)方法：

(1)

式中，A_i为第i种碳源的平均吸光度，A₀为空白孔的平均吸光度.

微生物群落结构与代谢功能多样性分析：采用Shanon指数(H′)、Simpson指数(1/D)和Pielou指数(J)来表征微生物群落结构与功能的多样性(杜萍等，2012; 赵艳等，2011)，各指数的计算公式分别见式(2)~(4).

(2)

(3)

(4)

式中，p_i为某物种个体总数与群落个体总数的比值，n_i为某物种个体总数，N为群落个体总数，S为群落的总物种数；在代谢功能多样性分析中，p_i为第i种碳源平均吸光度与所有碳源平均吸光度之和的比值，n_i为第i种碳源的平均吸光度，N为所有碳源平均吸光度之和，S为碳源利用种类总数.使用SPSS22.0中的独立样本T检验分析微生物群落碳源利用的差异性.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 微生物群落结构α-多样性

对OTU数据进行分析，得到生物滤塔中微生物群落结构多样性变化.Shannon指数反映了微生物群落的种类多样性，值越高说明群落中的微生物种类越丰富；Simpson指数反映了微生物群落优势物种的优势度，值越高说明群落中优势物种的优势度越低；Pielou指数反映了微生物群落的均匀度，值越高说明微生物群落的均匀度越高.

由表 2可知，在3个生物滤塔中随着生物滤塔的运行，3种多样性指数都在降低，说明3个生物滤塔中的微生物群落物种多样性和均匀度都在降低，优势种群的优势越来越明显.在第17 d时，EPS生物滤塔中多样性指数远高于珍珠岩和玻璃珠生物滤塔，表明EPS生物滤塔的微生物群落物种多样性和均匀度最高，优势物种的优势最不明显.在42 d时，3个生物滤塔的各个指数的差异性变小，微生物群落物种多样性、均匀度、优势物种优势度由高到低均为珍珠岩>EPS>玻璃珠.

3.2 微生物群落结构组成

在门的分类水平上共测出38个门，具体如图 2a所示.3个生物滤塔的优势菌门均为Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes，其余菌门在生物滤塔中的相对丰度均较低(低于1%)，这是因为具有降解VOCs能力的细菌多数属于这些门(Babbitt et al., 2009; Estrada et al., 2012; Fu et al., 2011; Pérez et al., 2015)，在甲苯作为唯一碳源时，属于这些门的细菌能更好地生长和增殖，从而成为优势菌. Proteobacteria在接种物中的相对丰度为51.5%，生物滤塔运行初期(17 d)在珍珠岩、玻璃珠、EPS生物滤塔中的相对丰度分别为67.5%、52.0%、54.1%，在第42 d时相对丰度略有下降，分别为36.1%、40.7%、49.0%.可见Proteobacteria在3个生物滤塔中始终保持很高的相对丰度. Actinobacteria在接种物中的相对丰度为3.7%，17 d时在珍珠岩生物滤塔和玻璃珠生物滤塔中，相对丰度分别为15.5%和22.0%，而在EPS生物滤塔中相对丰度最低，只有4.3%，第42 d时Actinobacteria的相对丰度继续升高，在珍珠岩、玻璃珠、EPS生物滤塔中分别为43.4%、39.6%、32.0%.可见珍珠岩和玻璃珠生物滤塔中Actinobacteria的相对丰度增长较快，在EPS生物滤塔中增长速度相对较慢.Firmicutes在接种物中的相对丰度为5.1%，17 d时在珍珠岩生物滤塔中相对丰度下降为3.0%，玻璃珠和EPS生物滤塔中升高为16.4%和9.9%，在42 d时珍珠岩、玻璃珠、EPS生物滤塔中相对丰度分别为3.9%、4.8%、3.8%.Bacteroidetes在接种物中的相对丰度为8.9%，17 d时珍珠岩和玻璃珠生物滤塔中相对丰度分别下降到4.9%和1.9%，EPS生物滤塔中上升到10.2%，42 d时相对丰度分别为6.2%、6.4%、8.4%.可见Proteobacteria和Actinobacteria在3个生物滤塔中都是占据绝对优势的门，Firmicutes和Bacteroidetes也是优势菌门但相对丰度要低于Proteobacteria和Actinobacteria.

整体来看，由于甲苯是唯一碳源，因此，生物滤塔中的微生物群落门水平结构与接种物差别较大；在17 d时，填料表面性质的差异性使得3个生物滤塔中的群落结构演变速度不同，因此，在门水平上3个生物滤塔的群落结构差异显著；而在经过42 d的运行后，生物滤塔已经进入稳定运行阶段，微生物群落都向适于处理甲苯的方向演变，因此，3个生物滤塔在42 d时的门水平群落结构相似.

图 2b列出了在属的分类水平上生物滤塔中相对丰度较高的15种菌属.15个属在接种物中的总相对丰度低于20%，在第17 d时在3个生物滤塔中的总相对丰度分别达到60.5%、66.4%、35.8%，在第42 d的总相对丰度分别为64.4%、72.1%、74.7%，这说明在连续通入甲苯的过程中，生物滤塔属水平的微生物群落结构组成发生了变化，优势菌属所占比例逐步升高，这一结果与微生物群落结构Simpson指数的变化是一致的.分析3个滤塔中各菌属的变化趋势发现，Rhodococcus和Pseudomonas在3个生物滤塔中始终保持较高的相对丰度，这与文献报道的Rhodococcus和Pseudomonas都具有较强的甲苯降解能力，在生物滤塔中丰度较高的结论吻合(Lee et al., 2010; Malhautier et al., 2014;Roy et al., 2003; Saingam et al., 2016).Rhodococcus在接种物中的相对丰度为1.1%，42 d时在珍珠岩、玻璃珠、EPS生物滤塔中的相对丰度分别增长到35.3%、38.5%、30.9%；Pseudomonas在17 d时相对丰度从4.0%分别增长到了25.3%、17.8%、16.0%，在42 d时珍珠岩生物滤塔中的Pseudomonas相对丰度下降到5.9%，玻璃珠生物滤塔中基本不变(18.4%)，在EPS生物滤塔中继增长(24.5%).

生物滤塔间相对丰度较高且差异较大的菌属有5个，分别为Devosia、Gordonia、Rhizobiales_E、Chromatiaceae_A和Fluviicola.其中，Devosia、Gordonia和Rhizobiales_E在珍珠岩生物滤塔中相对丰度更高，42d时在珍珠岩生物滤塔中的相对丰度分别为8.3%、7.0%、1.8%，远高于玻璃珠生物滤塔和EPS生物滤塔；Chromatiaceae_A、Fluviicola在玻璃珠和EPS生物滤塔中的相对丰度更高，42 d时Chromatiaceae_A在珍珠岩、玻璃珠、EPS生物滤塔中的相对丰度分别为0.5%、3.7%、6.6%，Fluviicola的相对丰度分别为0.3%、3.5%、5.7%. 5种菌属在不同生物滤塔中相对丰度的差异性可能与菌属的甲苯降解能力、附着能力、填料的附着性能及填料的含水率等有关.Devosia和Gordonia能够在富集VOCs的环境中生长(Kristiansen et al., 2011; Verma et al., 2009)，Rhizobiales_E属于具有反硝化能力的根瘤菌目(Li et al., 2016)，能够利用生物滤塔中的NO₃^-，因此，它们成为相对丰度较高的物种. Devosia、Gordonia和Rhizobiales_E的附着能力要低于Chromatiaceae_A和Fluviicola；珍珠岩颗粒具有很多微孔，易于附着，亲水性使得其对营养盐的保持能力更强，因此, 降解能力强但附着能力差的Devosia和Gordonia在珍珠岩生物滤塔中相对丰度更高.

3.3 微生物群落结构PCoA分析

采用PCoA方法对3个滤塔中的微生物群落结构的相似性进行分析，结果如图 3所示.PC1和PC2的贡献率分别为57.61%和21.19%.初始3个生物滤塔的接种物都是活性污泥，在运行17 d后，生物滤塔运行初步稳定，微生物群落结构存在较大的差异.42 d时3个生物滤塔中的微生物群落的结构相似性提高，并且与接种物的微生物群落结构存在较大差异.这一结果与微生物群落的α-多样性变化是一致的.

3.4 微生物群落代谢活性

通过测定Biolog ECO板上微孔的吸光度变化来观察微生物群落对碳源利用能力的变化，采用平均吸光度值(AWCD)表示微生物群落对碳源的整体代谢能力.图 4为接种物和42 d时3个生物滤塔微生物群落的AWCD曲线.可以发现，3个生物滤塔的AWCD值明显低于接种物，接种物具有最大的碳源利用能力.这是因为在生物滤塔运行过程中会产生不具备代谢活性的惰性微生物，使得代谢活性高的活性微生物的比例降低，从而使得微生物群落的代谢活性下降(席劲瑛等, 2005).3个生物滤塔的AWCD值从高到低为EPS>玻璃珠>珍珠岩，这可能是因为EPS生物滤塔中的惰性微生物含量较少，珍珠岩生物滤塔中的惰性微生物含量较高.

10~40 h是AWCD快速增长的时期，以此期间的AWCD变化速率表征微生物群落的代谢活性(王灿等, 2010)，接种物代谢活性为0.032 cm^-1·h^-1，珍珠岩、玻璃珠和EPS生物滤塔中的微生物群落代谢活性分别为0.015、0.017、0.018 cm^-1·h^-1.可以看出，填料种类对微生物群落代谢活性的影响并不显著；相比接种物，生物滤塔中的微生物群落代谢活性显著下降，这与微生物群落结构多样性的变化趋势是相同的.

Biolog板上的31种碳源可分为聚合物、酯类、胺类、醇类、氨基酸类、糖类和羧酸类7大类(Kong et al., 2013).在AWCD达到最大值时(70~80 h)，不同填料生物滤塔中的微生物对各大类碳源的相对利用率如图 5所示.可见不同填料生物滤塔中的微生物对碳源的利用结构相似，相对利用率分为3个水平，相对利用率最高的为氨基酸类、糖类和羧酸类(20%~28%)，其次是聚合物(10%~17%)，相对利用率最低的是酯类、胺类和醇类(3%~9%).与接种物相比，3个生物滤塔中的微生物对氨基酸类、糖类和羧酸类的相对利用率波动不大，对聚合物的相对利用率上升，对醇类和胺类的相对利用率下降，珍珠岩和玻璃珠生物滤塔中的微生物对酯类的利用率不变，EPS生物滤塔中的微生物对酯类的利用率显著上升.

3.5 微生物群落代谢多样性

从上面的分析可知，在30 h时AWCD增长速度较快，选取这一时间的Biolog数据进行微生物群落代谢多样性的分析，结果如表 3所示.可以发现，相比接种物，3个生物滤塔中的Shannon指数升高，说明微生物群落碳源代谢多样性升高，生物滤塔能够代谢的碳源种类更多样；Simpson指数升高，说明代谢最为充分的碳源的优势度降低；Pielou均匀度升高，说明生物滤塔中微生物群落对碳源的代谢能力更为平均.对42 d时3个生物滤塔的多样性进行比较，发现多样性指数排序为珍珠岩>EPS>玻璃珠.独立样本T检验结果表明，接种物与生物滤塔的微生物群落碳源代谢存在显著差异(p＞0.05)，不同填料的生物滤塔之间微生物群落的碳源代谢没有显著性差异(p＜0.05).

比较表 2和表 3可以发现，微生物群落结构多样性与代谢多样性的变化趋势是相反的，可能的原因如下：① 在接种物中，某些微生物对部分碳源具有较高的利用程度，而群落结构多样性的降低意味着这些微生物在生物滤塔中相对丰度降低或消失，导致相应碳源的利用程度降低，如接种物中微生物对肝糖和D-纤维二糖的利用程度很高，在30 h时测得的吸光度分别为1.71和1.65，而3个生物滤塔中的微生物对肝糖、D-纤维二糖的利用程度较低，吸光度为0.26~0.60.② 接种物中微生物无法利用的某些碳源可能在生物滤塔中可以利用，但利用程度并不高，例如，接种物对D-木糖和α-丁酮酸几乎没有利用，但生物滤塔中的微生物对这两种碳源的利用能力提升，吸光度为0.06~0.32.在这两个原因的综合作用下，生物滤塔微生物群落结构多样性的降低及结构的差异使得生物滤塔微生物群落对碳源的代谢多样性升高.

3.6 微生物群落结构、代谢功能与生物滤塔运行性能的关系

珍珠岩、玻璃珠和聚苯乙烯泡沫生物滤塔在稳定运行阶段的甲苯平均去除率分别为50.7%、21.9%和19.8%，对应的平均去除负荷分别为54.0、27.5和24.5 g·m^-3·h^-1.可见珍珠岩生物滤塔的总体去除率高于玻璃珠生物滤塔和聚苯乙烯泡沫生物滤塔.

甲苯在生物滤塔中主要是由微生物的降解作用去除的，微生物群落结构、代谢功能与生物滤塔运行性能存在一定的相关关系.在3个生物滤塔中，微生物群落结构和代谢功能相近，去除甲苯的主要微生物相同，但甲苯的去除效果却不同，这是因为3个生物滤塔的生物量存在显著差异.珍珠岩生物滤塔中生物量从接种后持续增长，在0~20 d的平均增长速率为7.5 g·d^-1，在30 d以后生物量增长趋于平缓，最终测得的生物增长量约为170 g；而玻璃珠和聚苯乙烯生物滤塔的生物量则是先下降后上升，转折点分别出现在22 d和14 d，最大损失生物量分别为41.9 g和32.9 g，最终测得的生物量仍低于初始接种的生物量.

4 结论(Conclusions)

1) 填料种类的不同导致不同生物滤塔中微生物群落演变速度有所差异：3个生物滤塔中微生物群落结构在运行初期(17 d)差异较大，在稳定运行期(42 d)微生物群落结构相似并且与接种物存在较大差异；生物滤塔相比接种物的微生物群落结构多样性降低，优势种群更为突出，稳定运行期微生物群落结构多样性由高到低为珍珠岩>EPS>玻璃珠.

2) 在门水平上，3个生物滤塔中Proteobacteria(36.1%~67.5%)、Actinobacteria(4.3%~43.4%)、Firmicutes(3.0%~16.4%)和Bacteroidetes(1.9%~10.2%)均为优势菌门；属水平上，Rhodococcus(2.4%~38.5%)和Pseudomonas(5.9%~25.3%)均为优势菌属，Devosia、Gordonia和Rhizobiales_E在珍珠岩生物滤塔中相对丰度更高，Chromatiaceae_A和Fluviicola在玻璃珠和EPS生物滤塔中相对丰度更高.这说明处理甲苯的生物滤塔微生物群落结构具有相似性，填料种类的不同会使微生物群落有所差异.

3) 稳定运行期，珍珠岩、玻璃珠、EPS生物滤塔中微生物群落整体碳源代谢能力相似，相比接种物均显著下降；碳源代谢的多样性水平相比接种物升高，碳源代谢的多样性由高到低为珍珠岩＞EPS＞玻璃珠.