环境科学学报  2017, Vol. 37 Issue (11): 4444-4448
引用本文
张玫, 赵利芳, 王影, 等. 2017. 大气细颗粒物亚慢性染毒对大鼠肺内质网应激相关因子表达的影响[J]. 环境科学学报, 37(11): 4444-4448.
Zhang M, Zhao L F, Wang Y, et al. 2017. Effects of subchronic exposure of ambient fine particulate matter on gene expressions of endoplasmic reticulum stress-related genes in lungs of rats[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 37(11): 4444-4448.
大气细颗粒物亚慢性染毒对大鼠肺内质网应激相关因子表达的影响    [PDF全文]
张玫1 , 赵利芳1 , 王影1 , 苏瑞军2 , 刘小娜2 , 李卓玉2 , 李瑞金1     
1. 山西大学环境科学研究所, 太原 030006;
2. 山西大学生物技术研究所, 太原 030006
收稿日期: 2017-03-13; 修回日期: 2017-05-25; 录用日期: 2017-05-27
基金项目: 国家自然科学基金（No.91543202）
作者简介: 张玫(1992—), 女, E-mail:2522092236@qq.com
通讯作者（责任作者）: 李瑞金(1967—), 山西大学环境科学研究所教授, 研究方向为环境与健康, E-mail:lirj@sxu.edu.cn
摘要: 采集冬、夏季太原市大气细颗粒物（PM2.5），并制备PM2.5生理盐水混悬液.将35只雄性SD大鼠随机分为7组：对照组、3个不同剂量夏季PM2.5染毒组（0.2、0.6、1.5 mg·kg-1体重）及3个不同剂量冬季PM2.5染毒组（0.3、1.5、2.7 mg·kg-1体重），每组5只，气道滴注法染毒，每隔2 d染毒1次，共60 d.采用荧光实时定量PCR、Western blot、ELISA方法检测大鼠肺内质网应激指标——葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、活化转录因子6（ATF6）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（Caspase12）及血红素氧合酶-1（HO-1）的mRNA和蛋白表达变化.结果表明，与对照组相比，冬季中、高剂量PM2.5染毒组大鼠肺组织GRP78、ATF6、CHOP、Caspase12、HO-1 mRNA和蛋白表达显著增加，夏季高剂量PM2.5染毒组大鼠肺组织这5个基因mRNA和蛋白表达显著增加.冬季和夏季PM2.5组大鼠肺上述5个基因表达有剂量-效应关系.结果表明，太原市PM2.5亚慢性染毒可诱导大鼠肺内质网应激相关基因GRP78/ATF6/CHOP/HO-1表达，说明肺内质网应激反应加强；而CHOP和Caspase-12上调，提示与细胞凋亡关联的内质网相关性死亡途径被激活.冬季和夏季PM2.5引起内质网应激相关因子表达上调的效应没有显著差别.
关键词: PM2.5     大鼠     内质网应激     肺     亚慢性染毒    
Effects of subchronic exposure of ambient fine particulate matter on gene expressions of endoplasmic reticulum stress-related genes in lungs of rats
ZHANG Mei1, ZHAO Lifang1, WANG Ying1, SU Ruijun2, LIU Xiaona2, LI Zhuoyu2, LI Ruijin1    
1. Institute of Environmental Science, Shanxi University, Taiyuan 030006;
2. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006
Received 13 March 2017; received in revised from 25 May 2017; accepted 27 May 2017
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 91543202)
Biography: ZHANG Mei (1992—), female, E-mail:2522092236@qq.com
*Corresponding author: LI Ruijin, E-mail:lirj@sxu.edu.cn
Abstract: Ambient fine particulate matter (PM2.5) was sampled from Taiyuan during winter and summer, and the PM2.5 physiological saline solutions were prepared. Thirty-five male SD rats were randomly divided into 7 groups: control group, three different doses of summertime PM2.5 groups (0.2, 0.6, 1.5 mg·kg-1 body weight) and three doses of wintertime PM2.5 groups (0.3, 1.5, 2.7 mg·kg-1 body weight) with five animals for each group. The rats were administered using PM2.5 solutions by intratracheal instillation respectively every three days for 60 days. And then the mRNA and protein expressions of the markers related to endoplasmic reticulum stress (ERS), including glucose-regulated protein 78 (GRP78), activated transcription factor 6 (ATF6), C/EBP homologous protein (CHOP), cysteine aspartic protease 12 (Caspase12) and heme oxygenase-1 (HO-1), were measured using real-time quantitative PCR, Western blot and ELISA in rat lungs after PM2.5 exposure. The results showed that the mRNA and protein expressions of GRP78, ATF6, CHOP, Caspase12, HO-1 in the lung tissues in medium-and high-dose PM2.5 groups in winter were significantly increased compared with the control group, while the expressions of the above 5 genes were significantly elevated in the high-dose PM2.5 group in summer compared to the control. There were dose-dependent effects of the expression increases of the above 5 genes in the winter or summer PM2.5 groups. These results suggest that the enhancement of ERS in the presence of PM2.5 from Taiyuan may be mediated by activating the ERS-related genes such as GRP78, ATF6, CHOP and HO-1, and that the up-regulation of CHOP and Caspase-12 might activate endoplasmic reticulum associated degradation pathway. In addition, no significant differences of mRNA and protein expressions of the ERS-related genes were observed in rat lungs between winter and summer PM2.5 groups.
Key words: PM2.5     rat     endoplasmic reticulum stress     lung     subchronic exposure    
1 引言(Introduction)

细颗粒物(PM2.5)是常见的大气污染物, 其粒径小, 富含大量有毒有害物质且在大气中停留时间长, 输送距离远, 对人体健康和大气环境质量影响极大.研究表明, 长期吸入PM2.5污染的空气, 可造成呼吸系统和心脑血管系统结构和功能的损害, 且PM2.5与肺癌、心血管疾病和神经退行性疾病的发病有关(Vinikoor et al., 2011; Lippmann, 2014; Kioumourtzoglou et al., 2016).毒理学研究发现, PM2.5对肺组织有毒性作用, 主要表现为氧化应激、酶活性改变、炎症因子产生、免疫功能调节紊乱及对遗传物质损害等(Lin et al., 2009; Riva et al., 2011).

文献显示, 慢性阻塞性肺疾病、肺癌、高氧肺损伤等肺部疾病的发生均与内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)有关(高楚楚等, 2012).ERS是指多种细胞内、外应激因素引起细胞内质网功能障碍, 导致内质网内蛋白错误折叠、未折叠蛋白大量累积和钙离子平衡紊乱, 细胞为恢复内质网功能而进行的一系列调节反应(苏建禄等, 2013).它是细胞的一种重要自我防御机制, 而强烈持久的ERS亦可引起细胞凋亡(刘秀华, 2007).虽然有研究表明PM2.5急性暴露通过ERS介导大鼠肺细胞凋亡(薛丹, 2016), 但PM2.5亚慢性染毒对肺ERS的影响尚不清楚.鉴于此, 本研究采用气道滴注方式对雄性SD大鼠进行冬季和夏季PM2.5暴露染毒, 建立动物亚慢性染毒模型, 选择ERS相关指标葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、活化转录因子6(ATF6)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase12)及血红素氧合酶-1(HO-1), 旨在探讨太原市不同季节大气PM2.5污染对大鼠肺ERS相关因子mRNA和蛋白表达变化, 揭示PM2.5对肺ERS影响及机制.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 颗粒物的采集与制备

采用大气颗粒物采样器于山西大学环境与资源学院楼顶收集冬、夏季PM2.5.将PM2.5石英采样膜剪成小块浸入超纯水中, 超声处理, 经纱布过滤, 收集PM2.5溶液, 真空冷冻干燥获得PM2.5干粉, 以灭菌生理盐水配制成不同浓度的PM2.5混悬液.

2.2 实验动物分组与染毒方法

健康清洁级雄性SD大鼠购于北京中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心, 体重为220~240 g, 饲养于本研究所动物房内.将35只大鼠随机分为7组, 分别为对照组(C组)、3个不同剂量夏季PM2.5染毒组(0.2、0.6、1.5 mg·kg-1体重, 分别记为S1、S2、S3组)及3个不同剂量冬季PM2.5染毒组(0.3、1.5、2.7 mg·kg-1体重, 分别记为W1、W2、W3组), 每组5只.采取气道滴注法, 隔2 d对大鼠染毒1次, 时间为60 d.染毒前后测定并记录大鼠体重.

2.3 测定指标及分析方法

最后一次滴注后24 h麻醉处死大鼠, 取肺组织, 迅速冻于液氮, 随后在-80 ℃中贮存, 备用.取一部分肺组织, 用Trizol提取总RNA, 采用反转录试剂盒(北京全式金生物科技)形成第一链成cDNA, 然后于荧光定量PCR仪进行qPCR分析.mRNA表达量以GADPH为内参.实验所用的引物分别为：GADPH(F:5′-ATGTATCCGTTGTGGATCTGAC-3′; R:5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′, 78bp)\GRP78(F:5′-CCTGTTGCTGGACTCTGTGA-3′; R:5′-GAAT ACACCGACGCAGGAAT-3′, 204bp)\ATF6(F:5′-GCAGGTGTATTACGCTTCG-3′; R:5′-TTCGGTCTT GTGGTCTTGTT-3′, 144bp)\CHOP(F:5′-CCTCGCTC TCCAGATTCCA-3′; R:5′-CTCATTCTCCTGCTCCTT CTCC-3′, 147bp)\Caspase12(F:5′-GCTGCCAAG AGAACACATGA-3′; R:5′-GGTTCTCAGCTTTGCTCA GG-3′, 169bp)\HO-1(F:5′-GTCAAGCACAGGGTGA CAGA-3′; R:5′-ATCACCTGCAGCTCCTCAAA-3′, 77bp), 引物由上海生工公司设计合成.同时, 另取一部分肺组织匀浆, 提取总蛋白；然后将变性蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离, 蛋白印迹转移至硝酸纤维素膜上, 室温下用封闭液处理1.5 h.将封闭液吸去, 加特异性一抗4 ℃孵育过夜(检测蛋白抗体均为多克隆兔抗大鼠的一抗, GRP78和CHOP一抗购自Cell Signaling Technology公司；ATF6一抗购自Abcam公司, actin一抗购自上海生工公司).磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗3次后, 加入二抗(山羊抗兔的AlexaFlor 680标记二抗购自上海前尘公司)孵育1.5 h, 然后用PBST漂洗4次, 用奥德赛红外荧光成像仪检测GRP78、ATF6、CHOP蛋白印迹, 扫描后保存图像, 并分析灰度值.

采用ELISA试剂盒(上海西唐生物科技)测定大鼠肺组织匀浆液中Caspase12、HO-1的水平, 具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行.

2.4 数据的统计学处理

实验数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示, 应用SPSS19.0软件对数据结果进行单因素方差分析-最小显著性差异法(LSD)检验.以p＜0.05为差异有统计学意义.

3 结果(Results)

本研究中, PM2.5染毒结束后, 对照组大鼠体重平均增加216 g, 夏季各PM2.5染毒组大鼠体重平均增加174、175、204 g, 冬季各PM2.5染毒组大鼠体重平均增加178、199、212 g.但PM2.5暴露后各组大鼠的体重变化与对照组相比无显著性差异.

3.1 PM2.5对大鼠肺组织ATF6、GRP78 mRNA和蛋白表达影响

不同浓度冬、夏季PM2.5处理大鼠后, 肺中ATF6、GRP78 mRNA和蛋白表达变化如图 1所示.由图 1可知, 冬季低剂量及夏季中、低剂量PM2.5处理后的大鼠肺组织中的ATF6、GRP78表达虽均有增加, 但与对照组相比没有统计学意义(p>0.05).冬季中、高剂量组及夏季高剂量组PM2.5处理后大鼠肺中上述基因表达水平均显著上升, 与对照组相比有显著性或极显著差异(p＜0.05或p＜0.01)；且ATF6、GRP78基因表达有剂量-效应关系(R2>0.95)(图 1).

图 1 PM2.5对大鼠肺组织ATF6、GRP78mRNA(a)和蛋白(b、c)表达的影响 (与对照组相比, *p＜0.05, **p＜0.01) Fig. 1 Effect of PM2.5 on ATF6 and GRP78 mRNA (a) and protein (b, c) expression in rat lungs (Compared with the control, *p < 0.05, **p < 0.01)
3.2 PM2.5对大鼠肺组织HO-1 mRNA和蛋白表达影响

由图 2可知, 与对照组相比, 只有冬季中、高剂量及夏季高剂量PM2.5处理后大鼠肺中HO-1 mRNA表达显著增加, 且有统计学意义(p＜0.05).冬季高剂量PM2.5处理后, 大鼠肺中HO-1蛋白表达比对照组显著增加(p＜0.05), 而其他组HO-1蛋白表达与对照组相比无显著性差异.冬季和夏季PM2.5处理后, HO-1 mRNA和蛋白表达随着剂量的增加而增加(R2>0.90).

图 2 PM2.5对大鼠肺组织HO-1 mRNA和蛋白表达的影响 (与对照组相比, *p＜0.05) Fig. 2 Effect of PM2.5 on HO-1 mRNA and protein expression in rat lungs (Compared with the control, *p < 0.05)
3.3 PM2.5对大鼠肺组织CHOP和Caspase12 mRNA和蛋白表达影响

不同浓度的冬、夏季PM2.5暴露后, 大鼠肺中CHOP和Caspase12 mRNA和蛋白表达情况如图 3所示.与对照组相比, 冬季中、高剂量及夏季高剂量PM2.5组处理后大鼠肺中CHOP和Caspase12mRNA和蛋白基因表达均明显升高, 且有统计学差异(p＜0.05或p＜0.01)；且冬季和夏季PM2.5染毒后CHOP、Caspase12基因表达有剂量-效应关系(R2=0.70~0.90)(图 3).

图 3 PM2.5对大鼠肺组织CHOP、Caspase12 mRNA(a)和蛋白(b、c)表达的影响 (与对照组相比, *p＜0.05, **p＜0.01) Fig. 3 Effect of PM2.5 on CHOP and Caspase12 mRNA(a) and protein (b, c) expression in rat lungs (Compared with the control, *p < 0.05, **p < 0.01)
4 讨论(Discussion)

大气PM2.5暴露能引起肺功能减弱及肺部组织结构改变、免疫系统功能下降、呼吸系统炎症、心血管系统发病率和死亡率增加, 并诱发癌症(Grahame et al., 2012；李万伟等, 2011).多种肺部疾病的发病机制与ERS有关(苏建禄等, 2013), 但PM2.5对肺ERS的影响及可能机制还不是很清楚.

内质网是细胞内最重要的细胞器之一.在正常生理状态下, 内质网中GRP78与ATF6处于结合状态, 形成稳定复合物, 处于未激活状态.外来物质作用下, 内质网中未折叠蛋白反应(UPR)活跃, 未折叠蛋白聚集, 引起ERS, 损伤内质网功能.GRP78/ATF6是ERS的标志蛋白分子和传感器蛋白, 其上调具有促进内质网内未折叠/误折叠蛋白质正确折叠和抵抗氧化应激等作用.外来刺激引起GRP78/ATF6上调有应激适应、预警和凋亡3种表现.发生ERS时, ATF6与GRP78解离, GRP78表达上调, 而解离后的ATF6由内质网膜转入高尔基体, 在S1P和S2P蛋白酶的作用下水解释放出一个有活性的ATF6片段(Tang et al., 2015), 由高尔基体转入细胞核, 激活相关因子转录, 减少未折叠蛋白和新生蛋白水平在内质网的堆积, 恢复内质网环境的稳态(Xiong et al., 2015).但过度的ERS将干扰蛋白质合成与分泌, 引起活性氧物质的生成和细胞凋亡(Wei et al., 2016).研究表明, PM2.5作用于大鼠肺组织会导致GRP78和ATF6显著增加(Laing et al., 2010; 薛丹, 2016), 这与我们的研究结果一致, 表明PM2.5暴露使得未折叠蛋白和新生蛋白水平的升高, 引起ERS, 这可能是PM2.5发挥其毒性的一个重要机制.

HO-1及其代谢产物参与体内多种生理和病理过程的调节, 是氧化应激反应蛋白, 也是ERS相关因子(林丽等, 2003).研究发现, CHOP激活是ERS的直接结果, 也是ERS促凋亡途径的特有产物(Gu et al., 2017).HO-1诱导表达可抑制CHOP表达引起ERS介导的细胞凋亡(Maamoun et al., 2017).本实验研究发现, PM2.5暴露引起大鼠肺HO-1表达显著增加, 表明PM2.5诱导大鼠肺ERS时, HO-1表达上调以降低ERS水平, 发挥细胞保护作用.

此外, ERS引起的细胞凋亡有一套自身的信号传递通路, 称为内质网相关性死亡(ER associated death, ERAD)途径.READ途径包含ERS诱导CHOP表达和Caspase-12蛋白水解酶的活化.CHOP是联系ERS与细胞凋亡的重要中间信号分子, Caspase-12蛋白水解酶是执行细胞凋亡作用的终末分子.CHOP和Caspase-12激活, 会促进细胞凋亡.研究显示CHOP敲除小鼠ERS诱导的细胞凋亡明显减少(Ji et al., 2005), 而Caspase12基因敲除的小鼠能明显抵抗ERS诱导的细胞凋亡(Nakagawa et al., 2000).本实验研究中, 随着PM2.5暴露浓度增加, CHOP及Caspase12的表达逐渐增强, 表明ERS可能激活READ, 增加细胞凋亡机会.PM2.5暴露后ERS介导肺细胞凋亡的机制还需深入研究.

5 结论(Conclusions)

1) 在本实验条件下, 较高浓度PM2.5(1.5、2.7 mg·kg-1体重)亚慢性暴露诱导大鼠肺ERS相关基因GRP78/ATF6/CHOP/HO-1表达上调, 引起ERS.

2) PM2.5上调CHOP和Caspase-12表达, 可能激活了内质网相关性死亡途径.

3) 虽然太原市冬季和夏季大气颗粒物成分和浓度有差异, 但在相同PM2.5暴露浓度(1.5 mg·kg-1体重)下, 冬季和夏季PM2.5引起ERS相关基因表达的增加没有显著性差异.

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