2017, Vol. 37
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ZHANG Qinghua, E-mail:zqh_net@163.com
农业废弃物是指畜禽养殖业、农产品加工、农村居民生活和农业生产排放的有机物的总称, 主要包括纤维性废弃物和畜禽粪便两大类.在上述两类废弃物中, 水稻稻秆和猪粪是典型的代表, 根据农业统计年鉴推算, 我国每年的稻草产量达到1.8亿t, 猪粪产量则高达2.8亿t(毕于运等, 2011), 因缺乏合理有效的处置方式, 对环境造成了严重的污染.因此, 如何合理资源化利用农业废弃物成为了世界性亟待解决的问题.目前, 人们在农业废弃物的资源化利用技术方面已取得一定的进展, 纤维质类废弃物主要是进行肥料化(Qian et al., 2014)、饲料化(杨树林等, 2003)和能源化(Sarkar et al., 2012)等处理, 而畜禽粪便则主要集中在饲料、肥料加工和作为发酵生产沼气原料等方面(李建政等, 2004).在众多废弃物资源化利用技术中, 采用厌氧发酵可产生生物质能源沼气, 具有较强的应用前景.近年来, 已有学者针对农作物秸秆和畜禽粪便混合物厌氧发酵进行了研究, 如邢杰等(2014)将560 g羊粪与秸秆按照7:3的比例混合, 在总固型物为8%、35 ℃的条件下厌氧发酵了53 d, 其累计产气量可达9580 mL.宋籽霖等(2012)则对玉米秸秆和鸡粪混合厌氧发酵沼气产量的影响因子进行了研究, 发现对于沼气发酵影响的重要性来说, 温度＞初始发酵浓度＞配比.研究发现, 影响沼气发酵产气量及产气效率的最主要阶段就是水解产酸阶段, 故研究者们将目光放在原料预处理技术研究上, 如冯磊等(2009)利用微波酸化预处理秸秆, 发现其厌氧消化结束后, 累积甲烷产气量达到了245.4~303.4 mL·g-1, 甲烷体积分数约为64.5%, 而未被预处理的秸秆累积甲烷产气量只有186.1 mL·g-1, 甲烷体积分数约为52.1%.
相对于物理和化学预处理方法来说, 生物预处理方法因其无环境污染、条件温和、成本低等特点而深受广大学者青睐.袁旭峰等(2011)利用高效纤维素降解复合菌系MC1对玉米秸秆进行预处理, 发现该菌系处理玉米秸秆4 d后最适合甲烷发酵, 且与未经预处理的玉米秸秆相比, 产气量和甲烷含量分别提高了33.0%和58.1%.
影响生物预处理效果的主要因素是纤维素降解菌的降解能力, 而纤维素降解菌活性则受碳氮比、pH、料水比等因素的影响(杨艳红, 2003；习兴梅, 2007).对于碳氮比这一因素而言, 碳氮比过高, 会导致反应前期产酸过多而酸化, 而碳氮比过低则会使原料降解不彻底, 适宜的碳氮比是发酵过程顺利进行的保障.为此, 众多学者针对碳氮比对发酵效果的影响进行了研究, 如彭志连等(2012)研究了温度和碳氮比对木薯渣厌氧发酵产气量的影响, 李玉春等(2012)研究了碳氮比对稻秆厌氧发酵过程的影响.
目前大多数的研究仅讨论了碳氮比对废弃物厌氧发酵效果的影响, 而对于碳氮比对复合菌系预处理稻草和猪粪废弃物协同发酵影响的研究还鲜见报道.因稻草碳氮比较高, 猪粪碳氮比较低, 故将两种农业废弃物混合进行厌氧发酵, 不仅利于碳氮比的调节, 还可促进纤维素降解菌对底物的降解(高培基等, 1995).
本课题组前期从自然界中分离筛选得到了一组可在55 ℃静置培养条件下, 40 h内将滤纸完全崩解的高效纤维素降解复合菌系(Zhang et al., 2011).在此基础上, 本研究期望进一步以农业废弃物稻草和猪粪作为复合原料, 探讨纤维素降解复合菌系对上述废弃物的生物预处理及其后续的厌氧消化效果, 为农业废弃物的资源化转化提供理论依据.为此, 本文考察了不同碳氮比混合条件下农业废弃物稻草和猪粪的协同生物处置及厌氧消化效果, 通过分析厌氧发酵的甲烷产量、产甲烷速率及预处理液和厌氧发酵液中关键参数的变化情况, 确定复合菌系预处理稻草和猪粪的最适碳氮比, 以期提高农业废弃物稻草和猪粪的生物处置效果, 进而为其它种类的畜禽养殖和纤维质类废弃物的高效沼气资源化提供一定的技术支撑.
2 材料及方法(Materials and methods) 2.1 材料 2.1.1 原材料与厌氧污泥猪粪取自江西农业大学动物科学技术学院生猪养殖厂, 水稻秸秆取自江西农业大学周边的农家, 厌氧污泥取自江西省新余市沼气站.
2.1.2 培养基活化培养基(g·L-1)：NaCl 5.0、滤纸5.0、CaCO3 0.9、酵母粉1.0、胰蛋白胨5.0、猪粪1.8、初始pH 7.6.发酵培养基：猪粪、稻秆(按一定比例添加), 控制料水比为11%进行配料.
2.2 试验方法 2.2.1 纤维素降解复合菌系的活化将纤维素降解复合菌液按照10%(V/V)的接种量接种于活化培养基中, 于55 ℃静置培养36 h.
2.2.2 生物预处理按照碳氮比为25:1、30:1、35:1和40:1的比例分别加入一定量的猪粪和稻秆, 控制两种废弃物最终的总加入量为9.9 g, 具体添加量如表 1所示.设定料水比为11%, 调节pH为7.6后, 按10%(V/V)的接种量接入活化好的纤维素降解复合菌系, 于55 ℃静置培养30 h, 上述预处理过程均设置3组平行试验.
| 表 1 稻草和猪粪添加量及其TS、VS含量 Table 1 The dosage of rice straw and pig manure and their TS and VS contents |
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将稻草和猪粪生物处理物(包括预处理液及残渣)加入到装有300 mL厌氧污泥的蓝口瓶中, 调节pH至7.2, 随后通入氮气2~3 min以去除反应器中的氧气, 密封后静置于(35±1) ℃的恒温水浴锅中静置发酵, 每隔12 h手动摇晃一次(每次1 min)以确保反应液混合均匀, 通过排氢氧化钠集气法测定其甲烷产量(Zhang et al., 2011).发酵结束后, 测定发酵液COD、碱度、还原糖、氨氮、pH、有机酸等参数, 上述厌氧发酵均以相同步骤进行两组平行实验.
2.3 分析方法总有机碳的测定采用马弗炉灰化法(习兴梅, 2007)；纤维素、半纤维素、木质素的测定采用范式洗涤法(习兴梅, 2007)；残渣质量的测定采用醋酸硝酸洗涤法(Updegraff, 1969); 滤纸酶活和羧甲基纤维素酶(CMC酶)酶活的测定见参考文献(Zhang et al., 2011)；有机酸的测定采用比色法(任南琪等, 2011)；pH的测定采用酸度计；氨氮的测定采用靛酚蓝反应(常景玲, 2012)；还原糖的测定采用DNS法(常景玲, 2012)；可溶性糖的测定采用硫酸-苯酚法(郑朋朋等, 2016)；COD的测定参照APHA法(American Public Health Association, 1995)；碱度的测定采用溴甲酚绿-甲基红指示剂滴定法(贺延龄, 1998)；总氮(TN)的测定采用凯氏定氮法(国家环境保护总局, 2002).
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 农业废弃物稻草和猪粪的成分分析稻草、猪粪和厌氧污泥的主要成分如表 2所示.由表 2可见, 猪粪中的碳源和氮源含量仅分别为7.96%和1.03%, 且其碳氮比较低仅为7.7:1；反之, 稻草中碳源和氮源含量分别为40.07%和0.47%, 其碳氮比却高达85.3:1.同时, 稻草中纤维素、半纤维素、木质素成分更为丰富.碳氮比过高, 可能会导致氮源含量太低, 从而影响微生物生长；碳氮比过低, 则会导致反应系统内氨氮含量过高, 出现氨抑制现象.为此, 可将两种农业废弃物协同发酵达到调节碳氮比的效果, 从而解决单独利用稻草或猪粪进行发酵时出现的因碳氮比不适宜而造成发酵效果不好的问题.此外, 由表 2还可见, 厌氧污泥中总固体(TS)含量为10.4%, 挥发性固体(VS)含量为5.49%, VS/TS为52.8%.
| 表 2 猪粪、稻秆和厌氧污泥的主要成分 Table 2 The main components of pig manure, rice straw and anaerobic sludge |
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在不同碳氮比条件下, 经过纤维素降解复合菌系预处理后的稻草和猪粪降解液中, 滤纸酶活和CMC酶酶活的变化情况分别如图 1a和1b所示.目前, 多数研究(Guo et al., 2000)均用纤维素酶活性来评估微生物分解木质纤维素的能力, 其中, 滤纸酶活表示总木质纤维素的转化能力, CMC酶酶活表示微生物对纤维素的利用能力.由图 1可见, 随着碳氮比的升高, 滤纸酶活和CMC酶酶活的变化趋势基本一致, 均随着碳氮比的升高而呈先上升再下降的趋势.当碳氮比为30:1时, 预处理后的降解液中滤纸酶活和CMC酶酶活均可达到2.18和2.31 IU的最高值, 表明在此碳氮比预处理条件下, 有利于纤维素降解复合菌系中关键酶(滤纸酶和CMC酶)的分泌.碳氮比是影响生物酶合成的重要因素, 过高或过低都不利于菌系分泌相关的酶类.其中, 碳氮比低, 则氮源含量高, 微生物生长旺盛, 不利于酶的合成分泌；碳氮比高, 则氮源含量少, 微生物生长缓慢, 也不利于酶的合成.
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| 图 1 不同碳氮比条件下滤纸酶活(a)、CMC酶酶活(b)和失重率(c)变化情况 Fig. 1 Change of the key enzymatic activities and weight loss rate in the pretreatment conditions with different carbon to nitrogen ratios |
此外, 不同碳氮比预处理条件下稻草和猪粪混合物失重率的变化趋势如图 1c所示.随着碳氮比的升高, 失重率呈先上升后下降的趋势, 且在碳氮比为30:1时, 失重率达到41.69%的最高值, 碳氮比过高或过低都不利于底物的降解.失重率高表明在此碳氮比条件下, 经纤维素降解复合菌系预处理后的废弃物稻草和猪粪的降解量高, 大分子物质被分解成可溶性的小分子有机物, 从而在后续厌氧消化过程更容易被消耗利用.
3.3 不同碳氮比对稻草和猪粪降解液pH的影响不同碳氮比条件下稻草和猪粪降解液中pH的变化情况如图 2所示.经纤维素降解复合菌系预处理后, 不同碳氮比条件下稻草和猪粪降解液(即预处理组)中的pH均维持在6.5左右的较低水平；而经厌氧发酵后, 经复合菌系预处理(实验组)和未经复合菌系预处理(对照组)的厌氧消化液的pH可达到7.8~8.0左右的水平.适宜的pH是微生物正常生长的必要条件, pH可影响微生物的生长及关键酶的活性, 有研究表明, 微生物水解酶活性达到最高时的pH为6.0左右(Zhang et al., 2009).经复合菌系预处理后, 在产酸菌的作用下, 预处理液中形成了较多有机酸, 故pH较低；当厌氧发酵完成后, 有机酸被厌氧发酵过程中的产甲烷菌大量消耗而产生沼气, 与此同时, 随着反应的进行, 发酵液中氨氮含量会上升, 从而导致厌氧发酵后期pH的升高.据相关资料报道, 产甲烷菌的最适pH范围在6.5~8.5之间(张全国, 2005)本研究中各碳氮比条件下预处理液中的pH均在此范围内, 表明经复合菌系预处理之后的稻草和猪粪混合物比较适宜于后续的厌氧沼气发酵.
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| 图 2 不同碳氮比预处理条件下的pH对比 Fig. 2 Comparison of pH under the pretreatment conditions with different carbon to nitrogen ratios |
不同碳氮比条件下稻草和猪粪降解液中还原糖和可溶性碳水化合物含量的变化如图 3所示.由图 3a可知, 随着碳氮比的提高, 预处理液中还原糖的含量呈先上升后下降的趋势.当碳氮比为30:1时, 预处理液中还原糖含量最高, 为1218.09 mg·L-1, 表明在此条件下, 稻草和猪粪混合物中的纤维质类物质被分解的效果较好.还原糖是厌氧发酵阶段厌氧微生物所利用的关键物质之一, 还原糖含量高, 厌氧微生物利用其产生的乙酸等物质就多, 从而提高后续的厌氧消化效果, 同时也可降低因还原糖积累所引起的对纤维素酶的抑制作用(杨声莲, 2002).在厌氧发酵完成后, 除碳氮比为25:1的实验组和对照组外, 其他组的还原糖含量均较预处理组有所下降.其中, 碳氮比为30:1的实验组和对照组下降幅度较大, 表明在此碳氮比条件下预处理后产生的还原糖极易被后续的厌氧菌所消耗利用, 从而提高其产甲烷效率.碳氮比为25:1的实验组和对照组还原糖含量略有升高, 说明还原糖被利用的速率小于产生速率, 可能是由于该碳氮比条件下, 在厌氧发酵后期产甲烷菌的活性有所降低, 从图 5b也可看出, 后期在该碳氮比条件下对照组和实验组日甲烷产量均处于较低水平.此外, 由图 3b可见, 预处理液中的可溶性碳水化合物含量随着碳氮比的升高而升高, 而在厌氧发酵结束后, 各碳氮比预处理条件下的厌氧消化实验组和对照组中可溶性碳水化合物含量均大幅度下降.
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| 图 3 不同碳氮比条件下还原糖(a)和可溶性碳水化合物(b)含量的对比 Fig. 3 Comparison of reducing sugar(a) and soluble carbohydrate(b) content under the pretreatment conditions with different carbon to nitrogen ratios |
此外, 不同碳氮比条件下稻草和猪粪降解及厌氧消化液中代谢产物的变化情况如图 4所示.由图 4a可知, 经纤维素降解复合菌系预处理后, 不同碳氮比预处理液中有机酸含量均很高, 且碳氮比为30:1时, 有机酸含量最高, 达到了1500 mg·L-1.纤维质类物质先被微生物分解产生糖等化合物, 再被产酸菌转化为有机酸, 从而作为产甲烷菌所利用的前体物质.有机酸含量低, 会导致反应系统产气缓慢；而有机酸含量过高, 则会对产甲烷微生物产生抑制作用.有研究表明, 当有机酸浓度达到10 g·L-1时, 厌氧消化过程便会停止(Vieitez et al., 1999).预处理液中有机酸含量高, 表明该碳氮比条件下复合菌系预处理效果好, 同时也有利于后续厌氧发酵阶段的进行, 故在发酵初期, 碳氮比为30:1的实验组更快进入产气高峰期, 高峰期持续时间也较长.厌氧发酵结束后, 各组的有机酸含量大幅降低, 且对照组内有机酸含量均大于实验组, 这表明前期预处理产生的有机酸在厌氧发酵过程中被有效的利用, 同时, 实验组中有机酸的利用效率高于对照组.其中, 碳氮比为30:1的实验组厌氧发酵前后的发酵液中有机酸含量相差最大, 表明在此碳氮比下, 沼气微生物对有机酸利用的效率最高, 其累计甲烷产量也是最高.
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| 图 4 不同碳氮比条件下降解液中有机酸(a)、碱度(b)、COD(c)、氨氮(d)的变化情况 Fig. 4 The change of the content of organic acid(a), alkalinity(b), COD (c) and ammonia nitrogen content (d) under different carbon to nitrogen ratios |
由图 4b可知, 各碳氮比条件下预处理液中的碱度相差不大, 均处于1500~2000 mg·L-1(以CaCO3计)之间, 而在厌氧发酵结束后, 实验组和对照组中的碱度大幅上升, 且实验组的碱度均低于对照组.碱度高可起到较好的缓冲作用, 从而避免厌氧发酵过程中产生过量的有机酸所引起的系统酸化.有研究表明(Borja et al., 2004), 在厌氧消化的过程中, 当有机酸/碱度的比值小于0.4时, 消化过程不会出现任何酸化风险.本研究发现, 经纤维素降解复合菌系预处理后的厌氧消化液中的有机酸/碱度值均维持在0.06左右的极低水平, 说明猪粪和稻草混合物经复合菌系预处理后再进行厌氧消化时的稳定性非常好.
在图 4c中, 预处理液中的COD在7000~8000 mg·L-1之间, 并且随着碳氮比的升高, COD呈先上升后下降的趋势.厌氧发酵结束后, 不同碳氮比条件下, 实验组和对照组中的COD均大幅降低, 这是由于在厌氧消化过程中, 大量有机物被沼气微生物所利用而产生甲烷.由图 4d可知, 不同碳氮比预处理条件下, 预处理液中的氨氮含量均处于200 mg·L-1以下, 而当厌氧发酵结束后, 各组氨氮含量明显上升, 并且对照组和实验组的氨氮变化趋势与碱度变化趋势一致.据相关报道, 当氨氮低于200 mg·L-1时, 可作为有效的氮源被厌氧微生物利用进行厌氧消化(Liu et al., 2002), 当氨氮含量过高时, 则会抑制产甲烷菌活性, 导致厌氧消化效果不佳.故随着氨氮含量的升高, 产甲烷菌活性降低, 各组日甲烷产量开始逐渐下降直至不产气.
3.5 不同碳氮比对甲烷产量的影响不同碳氮比条件下稻草和猪粪协同厌氧发酵后总甲烷产量的对比情况如图 5a所示.由图 5a可知, 实验组(经纤维素降解复合菌系预处理后的)厌氧发酵后的总甲烷产量明显比对照组(未经复合菌系预处理的)高, 且随着碳氮比的升高, 其总甲烷产量呈先上升后下降的趋势.其中, 当碳氮比为30:1时, 稻草和猪粪的总甲烷产量提升效果最为明显, 在此条件下, 实验组的总甲烷产量达到了1948 mL, 相对对照组的1412 mL提高了38%.同时, 该结果相对碳氮比为25:1、35:1和40:1实验组的总甲烷产量分别提高了8.5%、18.6%和19.1%.此外, 研究还发现, 当碳氮比为30:1时, 稻草和猪粪混合物的甲烷产率和产甲烷速率分别可达318.14 mL·g-1和10.61 mL·d-1·g-1；与此同时, 对照组甲烷产率和产甲烷速率则分别仅为230.4 mL·g-1和7.68 mL·d-1·g-1.
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| 图 5 不同碳氮比预处理条件下的总甲烷产量(a)和日甲烷产量(b) Fig. 5 Total methane yield(a) and daily methane yield(b) under the pretreatment conditions with different carbon to nitrogen ratios |
不同碳氮比条件下日甲烷产量的变化趋势如图 5b所示.由图 5b可知, 经复合菌系预处理后, 碳氮比为30:1的实验组在第1 d便进入产甲烷高峰期, 高峰期持续时间可达5 d, 且最大日甲烷产量可达196 mL；而未经复合菌系预处理, 碳氮比为30:1的对照组在第3 d才进入产甲烷高峰期, 高峰期只持续4 d, 且其最大日甲烷产量仅为174 mL.上述结果表明, 农业废弃物猪粪和稻草混合物经纤维素降解复合菌系预处理后其厌氧消化效率更高, 厌氧消化启动时间更短, 产甲烷高峰期维持时间更长.第6 d后, 各碳氮比条件下的实验组和对照组日甲烷产量开始下降, 但较其他组情况而言, 碳氮比为30:1的实验组日甲烷产量仍然保持在较高水平, 直到30 d以后, 各实验组和对照组均开始不产甲烷, 或只排出少量气体.刘战广等(2009)在研究稻草和猪粪混合比对产沼气效果的影响时发现, 在稻草和猪粪总质量为300 g, 草粪比为2:1的条件下, 第21 d日产气量达到峰值, 为685 mL·d-1, 总产气量为15715 mL.本研究仅加入总质量9.9 g的稻草和猪粪, 在碳氮比30:1的条件下经纤维素降解复合菌系处理后, 不仅厌氧消化启动时间提前, 总甲烷产量和日甲烷产量也分别能达到1948 mL和196 mL, 由此可见, 采用纤维素降解复合菌系对农业废弃物预处理后再进行厌氧消化, 可显著提高其厌氧消化效果.
此外, Hansen等(1989)的研究表明, 在厌氧发酵过程中, 微生物利用碳源的速度是氮源的20~30倍, 故发酵底物最适碳氮比应在20:1~30:1之间, 此条件下产气量最高, 本研究的结果与前人所得结论相符.同时, 据相关研究发现(李娟等, 2012；成喜雨等, 2014), 利用秸秆和猪粪混合产沼气的最佳碳氮比为25:1, 而本研究得到的结果略高于前人的研究, 可能是由于之前研究的秸秆绝大多数为玉米、小麦秸秆, 而本研究所用的为稻草秸秆, 且首次采用纤维素降解复合菌系生物处理后再进行厌氧消化, 从而导致最佳碳氮比略有不同, 但仍在理论范围之内.
4 结论(Conclusions)1) 碳氮比对稻草和猪粪混合物的生物预处理有一定的影响, 当控制碳氮比为30:1时, 稻草和猪粪混合物经纤维素降解复合菌系生物处置后, 其降解液中的滤纸酶活和CMC酶酶活分别可达到2.18和2.31 IU的较高水平, 底物失重率则高达41.69%.
2) 碳氮比可以显著影响稻草和猪粪混合物的厌氧消化效果, 在碳氮比为30:1的条件下, 经纤维素降解复合菌系生物处理后稻草和猪粪混合物的厌氧消化效果最佳, 在30 d的发酵周期内9.9 g稻草和猪粪混合物的总甲烷产量可高达1948 mL, 甲烷产率和产甲烷速率则可分别达到318.14 mL·g-1和10.61 mL·d-1·g-1的水平, 其甲烷产量可显著提高38%.另一方面, 在该碳氮比条件下, 稻草和猪粪混合物厌氧消化阶段的产甲烷高峰期提前, 其产甲烷高峰期可持续5 d, 且最大日甲烷产量高达196 mL.
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