1 引言(Introduction)

随着工业化和城市化的快速推进, 土壤Cd污染和酸雨污染日益加剧, 已成为当今世界备受关注的两大环境问题.土壤Cd污染主要来源于矿产开发、金属冶炼、工业废水废渣的排放及含镉农药的大量使用(张敏等, 2015; 李虹颖等, 2012), 2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》(环境保护部和国土资源部, 2014)显示, 全国土壤Cd污染点位超标率达7%, 占八大无机污染物之首.同时, 我国是世界三大酸雨区之一, 全国约40%的土地受到酸雨污染, 且酸雨频率和覆盖面积呈增长和扩大之势(俞飞等, 2016).目前, 我国部分城市和地区同时面临酸雨和Cd污染问题(Sun et al., 2012), 工矿区的复合污染尤为严重, 生态环境问题亟待改善.

苦楝(Melia azedarach L.)又名苦苓、翠树和金铃子等, 为楝科(Meliaceae)楝属(Melia)落叶乔木, 产于我国黄河以南各省市, 广布于亚洲热带、亚热带和部分温带地区；其材质优良, 树形俊美, 耐烟尘, 耐瘠薄, 生长迅速, 观赏性强, 提取物具有广谱性杀虫作用(刘佳敏等, 2014; 朱虹等, 2010), 还具有抗病毒(Andrei et al., 1986)、抗真菌(Carpinella et al., 2003)、驱肠虫(Szewczuk et al., 2006)等多种生物学效应, 是一种综合利用价值较高的乡土树种.前人对苦楝的研究主要集中在化学组分分析(白成科, 2008; Akihisa et al., 2013; Orhan et al., 2012)、药理应用(Won et al., 2016; Rutkauskis et al., 2015)和遗传多样性分析(陈丽君等, 2016; 王芳等, 2016; 陈丽君等, 2015)等方面, 逆境胁迫下的相关研究尚不多见, 酸雨和镉(Cd)复合胁迫下其响应情况未见报道.苦楝作为一种生长迅速、生物量大、适应性强、可吸收SO₂的多功能树种, 具有土壤重金属污染修复能力和酸雨污染控制能力, 但其能否在Cd污染的酸雨区正常生长及其耐受酸雨和Cd复合污染的阈值尚待明确.探究Cd和酸雨胁迫下苦楝的生长和生理响应, 对Cd污染酸雨区域绿化美化和植被修复树种的选择具有重要指导意义.因此, 本研究通过盆栽试验, 探究Cd和模拟酸雨处理下苦楝幼苗的生物量、质膜透性和渗透调节物质含量变化, 以期为苦楝在土壤Cd污染酸雨区域的综合应用提供理论基础和参考依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料

2014年年底于四川温江7~8龄苦楝母株上采集树种, 2015年3月上旬筛选饱满籽粒, 播种至上口径15 cm、高15 cm的塑料盆中, 播种基质由园土、草炭土和河沙按5:3:2(体积比)混合而成, 于大棚内培养, 该试验大棚中透光率为80%, 棚内温度为(25±3) ℃, 相对湿度为70%.

自然土壤采自四川农业大学附近园林苗圃内紫色土, 采样深度为土壤表层0~20 cm, 将自然土壤风干、捣碎、剔除杂物、研磨, 与草炭土按5:1(体积比)混合均匀后过5 mm钢筛, 再用800倍多菌灵消毒, 堆积静置3 d后, 按每盆7 kg的标准装入带托盘的花盆(口径25 cm, 高20 cm)中, 用去离子水控制其土壤含水量为田间持水量的60%左右.种植土中有机质、全氮、全磷、全钾含量分别为43.05、0.47、0.69、3.72 g·kg^-1, Cd²⁺含量为1.8 mg·kg^-1.参照国家土壤环境质量标准和四川盆地Cd污染概况(刘柿良等, 2015), 设置Cd处理(按纯Cd²⁺计, 不包括种植土中Cd²⁺背景值)剂量梯度为0、30、60、90、120、150、180 mg·kg^-1, 用由分析纯CdCl₂·2.5H₂O配制而成的约500 mL溶液均匀浇灌盆土, 渗出液反复回浇, 直到Cd²⁺与土壤混合均匀, 在室内稳定15 d后用于试验(苏明洁等, 2016).

我国西南地区酸雨类型为硫酸型酸雨(n(SO₄^2-)/n(NO₃^-)＞6), 主要离子成分为SO₄^2-、NO₃^-、F^-、Cl^-、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和NH₄⁺等(Wang et al., 2011), 模拟酸雨的化学组分应与自然雨水相近.因此, 参照郑有飞等(2011)的方法配置模拟酸雨, 先用0.10 mol·L^-1 NaF、0.15 mol·L^-1 NaCl、0.21 mol·L^-1 KCl、0.12 mol·L^-1 MgCl₂、0.15 mol·L^-1 CaCl₂和0.55 mol·L^-1 NH₄Cl配制原液, 后用硫酸和硝酸(n(SO₄^2-)/n(NO₃^-)＝5:1)混合液调节pH, 用酸度计(上海瑞仪仪器有限公司, S20K型)将pH值调至5.6、4.5和3.5, 分别代表临界酸雨、典型酸雨和强酸雨, 其中, pH=5.6溶液为蒸馏水与大气平衡后形成的溶液.

2.2 试验设计

本试验采用两因素完全随机实验设计, 酸雨3个水平(pH=5.6、4.5和3.5), Cd²⁺剂量7个水平(0、30、60、90、120、150、180 mg·kg^-1)(表 1), 以pH=5.6酸雨和Cd²⁺剂量0 mg·kg^-1处理为对照(CK), 共计21个处理, 每处理设5个重复.8月初选取生长旺盛、长势相近的苦楝幼苗, 剪去腐烂的根系, 将植株用清水冲洗干净后移栽至含Cd处理土壤的塑料盆中, 每盆1株, 共计105株, 移栽后第1周保证叶片不失水, 1周后正常管理, 试验处理期间植物不浇水.以成都市8—11月平均降雨量为参照(宋春林等, 2012), 确定每月模拟酸雨喷洒量并平均分配至每周, 采用喷雾法每周喷洒酸雨2~3次(俞飞等, 2016)；喷洒时不同处理间用塑料薄膜隔开, 防止相互干扰.处理60 d后测定生长和生理指标.

2.3 测定指标与方法

处理60 d后, 取植株第3~5片叶(从上到下)进行各项生理指标的测定, 再采用破坏性收获法采集植株.

2.3.1 株高与生物量测定

选取苦楝幼苗第1~3片叶, 拍照记录叶色和叶形；用卷尺测量所有植株基部到顶部的高度, 其平均值作为该处理的株高；收获所有植株, 用自来水洗净后, 再用蒸馏水冲洗3遍, 105 ℃下杀青30 min, 80 ℃烘干至恒重, 电子天平称重.

2.3.2 生理指标测定

叶绿素含量采用丙酮-乙醇浸提法测定；质膜透性采用相对电导率法(REC)测定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定；游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定.以上指标均参照熊庆娥(2003)的方法测定.

2.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2007进行数据处理和图表分析, 所有数据均为5次重复平均值, 并用SPSS 20.0统计软件建立一般线性模型(General Linear Model), 并进行单变量方差分析(Unvariate)和新复极差法(Duncan′s)多重比较.显著性水平设定α=0.05.

3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 Cd²⁺和酸雨对苦楝幼苗生长的影响

从图 1对幼苗叶片形态和颜色的观察可见, 单一酸雨处理下, 叶形和叶色均无明显差异；单一Cd²⁺处理下, 叶形无明显变化, 但叶色随Cd²⁺剂量增加而逐渐变浅.酸雨和Cd²⁺复合处理下, 随pH降低和Cd²⁺剂量增加, 叶色泛黄, 褪绿症状由叶基沿叶脉逐渐向上蔓延.在pH=3.5酸雨和180 mg·kg^-1Cd²⁺处理下, 叶缘枯萎, 叶片黄化, 伤害性状明显, 表明酸雨和Cd²⁺双重胁迫对苦楝幼苗的损伤加重.

由表 2可知, 单一酸雨胁迫下, 苦楝幼苗干重和株高均随pH降低而逐渐下降, 其中, pH=4.5酸雨处理下的干重与CK差异不显著(p＞0.05), 各pH酸雨处理的株高差异也不显著(p＞0.05), 而pH=3.5酸雨处理的干重显著低于CK(p＜0.05).单一Cd²⁺处理下, 干重随Cd²⁺剂量的增加而先升后降, Cd²⁺剂量为30 mg·kg^-1时达最大值, 较CK增加13.56%, Cd²⁺剂量为180 mg·kg^-1时较CK下降57.74%, 表明Cd²⁺对苦楝幼苗生物量的积累具有低促高抑效应, 株高随Cd²⁺剂量的增加而降低, 在Cd²⁺剂量≤120 mg·kg^-1处理下无明显变化(p＞0.05), Cd²⁺剂量为180 mg·kg^-1时较CK下降19.83%.对于酸雨和Cd²⁺复合处理, 除pH=4.5和Cd²⁺剂量为30 mg·kg^-1时, 干重和株高略高于CK外, 其余处理均低于CK；在pH=3.5和Cd²⁺剂量为180 mg·kg^-1时达最低值, 干重和株高分别较CK下降66.55%和31.74%, 下降幅度高于单一pH=3.5酸雨和单一Cd²⁺剂量180 mg·kg^-1处理, 表明酸雨和Cd²⁺复合处理显著降低了苦楝幼苗的干重和株高, 对苦楝幼苗生长的伤害作用具有协同效应.

3.2 Cd²⁺和酸雨对苦楝幼苗叶绿素含量的影响

表 3显示, 单一酸雨处理下, 叶绿素含量随pH降低缓慢下降, 各处理间差异不显著(p＞0.05)；单一Cd²⁺处理下, 叶绿素含量随Cd²⁺剂量的增加呈下降趋势, Cd²⁺剂量≤60 mg·kg^-1时, 叶绿素含量较CK差异不显著(p＞0.05), 而90~180 mg·kg^-1下显著低于CK(p＜0.05), 较CK的下降幅度为23.62%~39.16%；酸雨和Cd²⁺复合处理下, 叶绿素含量均低于CK, pH=3.5酸雨和180 mg·kg^-1 Cd²⁺处理, 叶绿素含量最低, 较CK下降54.5%.说明苦楝幼苗对酸雨和剂量≤60 mg·kg^-1Cd²⁺具有一定耐受性, 但强酸雨(pH=3.5)和高剂量(≥90 mg·kg^-1) Cd²⁺双重胁迫导致叶绿素大量降解, 含量急剧下降.

3.3 Cd²⁺和酸雨对苦楝幼苗质膜透性和丙二醛含量的影响

如图 2a所示, Cd²⁺和酸雨单一及复合胁迫下苦楝幼苗叶片细胞膜透性随pH值降低和Cd²⁺剂量增大而增大.单一酸雨处理下, pH=4.5和pH=3.5酸雨处理的相对电导率较CK分别增加11.29%和19.35%.单一Cd²⁺处理下, 相对电导率较CK的增幅为4.90%~51.61%.酸雨和Cd²⁺复合处理, 各处理相对电导率均显著高于CK(p＜0.05), pH=4.5与pH=5.6酸雨条件下, Cd²⁺剂量≥150 mg·kg^-1时, 各处理之间的相对电导率变化不显著(p＞0.05), pH=3.5酸雨和180 mg·kg^-1 Cd²⁺复合处理的相对电导率最大, 较CK增加74.19%, 细胞膜严重受损.

MDA含量在Cd²⁺和酸雨单一及复合处理下的变化趋势与相对电导率一致(图 2b), 单一酸雨处理, pH=4.5与pH=3.5酸雨处理下的MDA含量分别较CK增加47.06%和52.94%, 细胞膜脂过氧化明显；单一Cd²⁺处理, Cd²⁺剂量≤60 mg·kg^-1时, MDA含量较CK变化不显著(p＞0.05), 细胞膜无明显过氧化损伤, 90~180 mg·kg^-1时, MDA含量较CK增加35.29%~94.12%, 细胞膜脂过氧化程度逐渐加重；酸雨和Cd²⁺复合处理下, 各处理的MDA含量均显著高于CK(p＜0.05), pH=3.5和Cd²⁺剂量为180 mg·kg^-1时, MDA含量为CK的2.65倍, 细胞膜产生了严重的过氧化作用, 表明单一和双重胁迫均对细胞膜产生了伤害, 双重胁迫下苦楝幼苗细胞膜损伤加剧.

3.4 Cd²⁺和酸雨对苦楝幼苗渗透调节物质含量的影响

苦楝幼苗可溶性糖含量随酸雨pH降低和Cd²⁺剂量的增加而逐渐降低(图 3a), 单一酸雨处理中, pH=4.5酸雨处理的可溶性糖含量与CK差异不显著(p＞0.05), pH=3.5酸雨处理较CK下降4.44%；单一Cd²⁺胁迫下, 各处理的可溶性糖含量均显著低于CK(p＜0.05), Cd²⁺剂量为180 mg·kg^-1时有最小值, 较CK下降24.44%；酸雨和Cd²⁺复合处理, 各处理的可溶性糖含量均低于CK、单一酸雨和单一Cd处理, pH=3.5和Cd²⁺剂量为180 mg·kg^-1时, 可溶性糖含量较CK下降31.11%, 表明酸雨和Cd²⁺单一及复合胁迫下, 可溶性糖的渗透调节作用不明显.

可溶性蛋白含量随酸雨pH降低和Cd²⁺剂量的增加大致呈先升后降趋势(图 3b).单一酸雨处理下, pH=4.5时可溶性蛋白含量较CK增加6.67%, 而pH=3.5处理则较CK下降13.33%.单一Cd²⁺处理下, 可溶性蛋白含量的峰值出现在Cd²⁺剂量为30 mg·kg^-1时, 较CK上升20.00%, Cd²⁺剂量达120 mg·kg^-1时可溶性蛋白含量仍显著高于CK(p＜0.05), 180 mg·kg^-1 Cd²⁺处理的可溶性蛋白含量较CK下降26.67%.酸雨和Cd²⁺复合处理下, pH=4.5和Cd²⁺剂量为60 mg·kg^-1时, 可溶性蛋白含量最高, 较CK增加33.33%, 且Cd²⁺剂量≤120 mg·kg^-1时, 酸雨和Cd²⁺复合处理的可溶性蛋白含量均高于CK, 也高于单一酸雨和单一Cd²⁺处理.表明单一pH=4.5酸雨、单一Cd²⁺剂量≤120 mg·kg^-1处理及二者的复合处理在一定范围内(pH≥4.5和Cd²⁺剂量≤120 mg·kg^-1)可诱导可溶性蛋白含量增加, 从而维持酸雨和Cd²⁺胁迫下的渗透平衡, 但超过此范围, 可溶性蛋白失去调节功能.

游离脯氨酸含量随酸雨pH降低和Cd²⁺剂量的增加而先增后降(图 3c), 单一酸雨胁迫下, pH=4.5和pH=3.5酸雨处理的游离脯氨酸含量与CK差异不显著(p＞0.05)；单一Cd²⁺胁迫, 各剂量处理下游离脯氨酸含量均高于CK, Cd²⁺剂量为60 mg·kg^-1时达最大值, 为CK的1.22倍；酸雨和Cd²⁺复合处理, pH=4.5和Cd²⁺剂量为60 mg·kg^-1时, 游离脯氨酸含量最高, 较CK增加155.6%, 且pH=4.5的酸雨条件下, Cd²⁺剂量≤150 mg·kg^-1时, 游离脯氨酸含量均高于CK, 也高于单一酸雨和单一Cd²⁺处理；pH=3.5的酸雨条件下, Cd²⁺剂量≤90 mg·kg^-1时, 游离脯氨酸含量也均高于CK和单一酸雨处理.表明单一酸雨处理没有诱导游离脯氨酸的产生, 而单一Cd²⁺处理、pH=4.5酸雨和Cd²⁺剂量≤150 mg·kg^-1复合处理及pH=3.5酸雨和Cd²⁺剂量≤90 mg·kg^-1复合处理时, 游离脯氨酸含量均明显增加, 主动参与渗透调节.

4 讨论(Discussion)

Cd不是植物生长发育的必需元素, 但具有较高的化学活性, 易被植物吸收, 从而抑制植物光合作用、呼吸作用和蒸腾作用等正常生理代谢活动(王欣欣等, 2016), 还能通过食物链富集, 威胁人体健康.酸雨导致土壤酸化, 引发Cd²⁺淋溶加强, 迁移性和生物可利用性增加, 进而加剧植物损伤(饶中秀等, 2013)；此外, 酸雨还可以通过直接作用地上部分来抑制植物正常生长.秦海峰和仪慧兰(2008)研究发现, 模拟酸雨与Cd单独或复合处理后, 小麦幼苗根长和苗高下降, 单粒萌根数减少, 生长发育受到显著抑制.本试验结果显示, pH=4.5的酸雨和30 mg·kg^-1Cd²⁺处理时, 苦楝幼苗干重和株高均高于CK, 具有一定促进作用, 与秦海峰等(2008)的研究结果不一致, 这可能与酸雨淋溶使土壤释放出大量金属阳离子(如Cd²⁺、Mg²⁺), 缓解了Cd²⁺对植物的损伤(Liao et al., 2005)相关.而pH=3.5酸雨和180 mg·kg^-1Cd²⁺处理时, 叶片黄化卷曲, 干重和株高显著下降且均低于单一酸雨和单一Cd²⁺处理, 表明强酸雨和高剂量Cd²⁺对苦楝生长的毒害作用具有协同效应.

叶绿素是植物进行光合作用的重要色素, 其含量高低与光合能力密切相关(刘柿良等, 2015).酸雨中包含的N和Mg²⁺是合成叶绿素的重要组成元素, 植物吸收N素和Mg²⁺后, 大量叶绿素被重新合成(汪赛等, 2014).而高剂量Cd²⁺与叶绿体中蛋白质的巯基(—SH—)结合, 会破坏叶绿体的结构和功能, 导致叶绿素含量下降(苏明洁等, 2016).Sun等(2012)研究发现, pH=4.5酸雨和15 μmol·L^-1 Cd²⁺处理, 大豆叶绿体结构完整；pH=3.0酸雨和100 μmol·L^-1 Cd²⁺处理时, 基粒片层溶解, 叶绿体结构严重受损, 叶绿素含量下降.强酸雨和高浓度Cd²⁺胁迫下, Cd²⁺引发叶绿体膜透性增大, 酸雨中过量的H⁺、SO₄^2-、NO₃^-进入叶绿体内, 诱导活性氧自由基生成, 致使叶绿体结构和功能损伤, 叶绿素合成受阻(刘建福等, 2013).本研究发现, 酸雨对苦楝幼苗叶绿素含量无显著影响, 这可能与酸雨中的N和Mg²⁺被苦楝吸收利用相关；而≥90 mg·kg^-1 Cd²⁺胁迫导致叶绿素含量显著降低, 可能是Cd²⁺破坏了叶绿体的结构和功能所致；强酸雨(pH=3.5)和高剂量(≥90 mg·kg^-1) Cd²⁺双重胁迫导致叶绿素含量急剧下降, 叶色褪绿泛黄, 可能与Cd²⁺和酸雨中的H⁺、SO₄^2-、NO₃^-协同作用, 致使叶绿体损伤加剧有关.

细胞膜是植物进行物质交换和能量运输的重要场所, 其结构的稳定性和完整性是植物细胞进行正常生理代谢的基础.逆境胁迫会诱导活性氧自由基(ROS)过量积累, 抗氧化酶保护系统功能紊乱, 进而引发膜脂过氧化, 导致细胞膜结构和功能损伤(张然然等, 2016).MDA是膜脂过氧化的最终产物, 其含量高低和细胞膜透性可以反映细胞膜的受损程度.本研究中, 低剂量Cd²⁺(≤60 mg·kg^-1)处理下, 苦楝幼苗叶片相对电导率和MDA含量较CK无明显变化, 表明此时ROS产生和清除过程维持着动态平衡状态；高剂量Cd²⁺(≥90 mg·kg^-1)及酸雨和Cd复合处理条件下, 细胞膜透性增大, MDA含量上升, 表明抗氧化酶保护系统平衡失调, 细胞膜结构和功能严重受损, 正常生理代谢活动受到影响.

植物在遭遇酸雨、干旱、盐碱及重金属胁迫等逆境时, 会迅速积累可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、甜菜碱及有机酸等一系列渗透调节物质, 从而提高植物防御能力.可溶性糖能有效提高细胞渗透浓度, 降低水势, 增强植物吸水能力, 同时也是构成生物大分子的碳架和能量来源, 而高剂量Cd²⁺与叶绿体中蛋白质的巯基(—SH—)结合, 会破坏叶绿体的结构和功能, 导致植物光合过程受阻, 光合产物积累量下降(苏明洁等, 2016).本研究结果显示, Cd²⁺处理下, 苦楝幼苗可溶性糖含量较CK显著下降(p＜0.05), 可能与Cd²⁺干扰苦楝光合代谢有关；各Cd²⁺浓度下, pH=4.5与pH=5.6酸雨处理无显著差异(p＞0.05), 表明苦楝对典型酸雨具有一定适应能力, 且典型酸雨和Cd²⁺复合胁迫时, Cd²⁺是导致苦楝幼苗可溶性糖含量下降的主要原因, 同时表明可溶性糖没有参与酸雨和Cd²⁺胁迫下的防御性渗透调节生理.酸雨和Cd²⁺胁迫下, 可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈先升后降趋势, Cd²⁺剂量≤120 mg·kg^-1时, 酸雨和Cd²⁺复合处理的可溶性蛋白和脯氨酸含量均高于CK和单一酸雨、单一Cd²⁺处理, 且脯氨酸含量最高可达CK的2.56倍, 究其原因, 可能与Cd²⁺诱导植物形成了Cd结合蛋白(Cd-Bp), 如金属硫蛋白和类金属螯合蛋白等, 使可溶性蛋白含量上升有关；而酸雨中的N、S元素有利于植物合成蛋白质, 稳定蛋白的空间结构, 增强植物光合能力和抗逆能力(俞飞等, 2016)；N素还能对N源进行补充, 进而通过调节氮代谢提高蛋白质和脯氨酸的含量.可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加, 在一定程度上维持了细胞渗透压, 保持了细胞膜结构和功能的完整性, 有利于植物清除过量积累的ROS, 调节细胞氧化还原电势, 对提高植物逆境胁迫下的适应能力具有重要意义.

5 结论(Conclusions)

1) pH=4.5的酸雨和30 mg·kg^-1Cd²⁺处理, 对苦楝幼苗干重和株高具有一定促进作用, 植株生长良好, 表明苦楝幼苗对酸雨和Cd胁迫具有一定适应能力.

2) 强酸雨(pH=3.5)和高剂量(≥90 mg·kg^-1) Cd²⁺复合处理下, 叶片黄化卷曲, 干重、株高和叶绿素含量下降, 相对电导率和MDA含量上升, 可溶性蛋白含量减少, 且强酸雨和高剂量Cd²⁺对苦楝生长的毒害作用具有协同效应.

3) Cd²⁺剂量≤120 mg·kg^-1时, pH=4.5和pH=3.5的酸雨与Cd²⁺复合处理下, 可溶性蛋白和脯氨酸含量均高于CK, 也高于单一酸雨和单一Cd²⁺处理, 苦楝通过增加可溶性蛋白和游离脯氨酸含量来维持酸雨和Cd处理下的渗透平衡, 从一定程度上缓解了酸雨和Cd²⁺胁迫的毒害效应.

综上认为, 在Cd²⁺剂量≤60 mg·kg^-1、pH≥4.5的典型酸雨区, 苦楝可以正常生长且保持较大生物量, 即苦楝可以作为绿化和修复树种应用于Cd污染典型酸雨区, 在绿化美化环境的同时修复土壤Cd污染.