1 引言(Introduction)

厌氧氨氧化脱氮工艺在厌氧条件下能以较低的运行费用同时高效去除氨氮和亚硝氮, 污泥产率低, 被普遍认为是可持续性强的、适用于高浓度氮污染去除的环境友好型脱氮工艺(Ali et al., 2013).目前, 学术界普遍认可的Anammox反应方程式如式(1)所示(Strous et al., 1998).在Anammox反应中NH₄⁺-N与NO₂^--N的去除量和NO₃^--N的产生量之间的理论比值为1:1.32:0.26.当Anammox菌群中存在异养型亚硝酸盐氧化菌或反硝化菌时, 这些微生物能利用细胞死亡产生的COD进行反应消耗部分NO₂^- (Udert et al., 2008; Yu and Jin, 2012), 使NO₂^--N/NH₄⁺-N去除比(R_R)大于1g.32, 即系统中NH₄⁺-N的实际去除量会比以Anammox理论比值计算所得的NH₄⁺-N消耗量小.然而有许多研究发现R_R小于1.32(Thuan et al., 2004; Ali et al., 2013; 刘倩等, 2012), 即系统中NH₄⁺-N的消耗量比Anammox理论NH₄⁺-N消耗量大, 即常常存在氨氮的“超量去除”.

(1)

刘福鑫(2014)在研究SO₄^2-代替NO₂^-作为电子受体进行厌氧氨氧化的研究中发现SO₄^2-一直未被去除, 而部分NH₄⁺以某种未知的电子受体却得到良好去除, 表明该Anammox系统在只提供NH₄⁺时就能长期进行氨的厌氧脱除.这种Anammox系统在无NO₂^-供应时的氨的脱除, 与厌氧条件下同时供给NO₂^-和NH₄⁺时发生的典型Anammox反应中氨氮的“超量去除”之间有何内在联系, 尚不清楚.进水基质比(NO₂^--N/NH₄⁺-N, R_I)对Anammox反应器中氨氮的“超量去除”的影响, 也有待研究.

生物反应器的运行和对污染物的去除依赖于其中的功能性微生物.自然环境中绝大部分微生物不能获得纯培养(Pace, 1997).基于细菌16S rDNA基因的高通量测序技术因其具有分析结果精准、数据量庞大、测序速度快、高自动化等独特优点, 可以对活性污泥中的全细菌进行鉴定, 在环境微生物鉴定领域得到广泛运用(户海燕等, 2016).该技术能得到比传统分子生物学技术(PCR-DGGE等)更广泛、全面的微生物结构信息, 在厌氧氨氧化微生物菌群分析方面也得到较好的应用(Cao et al., 2016; Connan et al., 2016; 陈重军等, 2016; 闫媛等, 2015), 这些研究中同时检测到厌氧氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌3种脱氮微生物共存.胡宝兰(2005)认为在Anammox系统中同时存在厌氧氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌, 并推测这3类微生物可能都与厌氧氨氧化有关.Anammox系统在无NO₂^-供应时, 反应器还能实现氨的厌氧脱除, 那么NH₄⁺首先需要在厌氧条件下被某些微生物作用先进行氨氧化反应, 结合系统中微生物群落变化情况可以对此实验现象辅以解释.

本研究采用UASB反应器, 对Anammox反应器中的氨氮“超量去除”现象进行研究, 探究长期停供和恢复供给亚硝氮及不同R_I进水下Anammox反应器中氨氮去除特性, 旨在进一步揭示Anammox反应器脱氮的机理以及氨氮“超量去除”的机制.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验装置及模拟废水组成

实验装置采用图 1所示的有效容积为6.3 L的UASB反应器, 反应器外有厚度为10 mm的水浴保温层, 利用温控装置控制反应器温度为33 ℃.反应器外壁包裹黑布以防止光照对厌氧氨氧化微生物产生不利影响.在实验开始前, 反应器是以市政污水处理厂(A²/O工艺)回流污泥为接种污泥、启动Anammox反应并稳定运行了149 d, 反应器脱氮效果良好, 对总氮的去除负荷达到了714 mg·L^-1·d^-1, 对总氮的去除率为81.59%.

实验采用人工废水, 废水组成为：KHCO₃ 1000 mg·L^-1；KH₂PO₄ 27 mg·L^-1；CaCl₂ 5.6 mg·L^-1；MgSO₄·7H₂O 200 mg·L^-1；NH₄⁺-N和NO₂^--N分别以(NH₄)₂SO₄和NaNO₂的形式按需添加；微量元素Ⅰ和Ⅱ(Graa et al., 1996)各1 mL.

2.2 分析方法

常规水质指标均按照《水和废水监测分析方法》(第四版)(国家环境保护总局, 2002)进行分析.NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法；NO₂^--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；NO₃^--N采用紫外分光光度法或离子色谱法；SO₄^2-采用离子色谱法；pH采用PHS-3E型pH计测定.

污泥微生物群落结构分析采用基于Illumina MiSeq测序平台的细菌16S rDNA高通量测序技术.测序污泥样品采集前先向反应器中泵入高纯氮气, 使污泥完全混合后取样, 以保证所取样品能很好的代表整个反应器微生物组成(保存条件-20 ℃).将污泥样品送生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量测序分析.DNA提取采用OMEGA试剂盒(E.Z.N.A^TM Mag-Bind Soil DNA Kit)并按使用说明进行.测序引物选取已经融合了MiSeq测序平台的细菌V3-V4区通用引物341F(5′-CCTACGG GNGGCWGCAG)和805R(5′-GACTACHVGG GTATCTAATCC).测序所得原始数据中原始序列平均长度460~466 bp, 质量控制(QC)之后序列平均长度421~428 bp.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 实验前期反应器运行情况

实验前期保持HRT为14 h, 反应器运行状况良好, 进出水氮浓度变化如图 2所示.在1~21 d时, R_I为1.00, 总氮平均去除速率为720.53 mg·L^-1·d^-1, 系统进、出水氮含量变化比值NH₄⁺-N/NO₂^--N/NO₃^--N稳定在1:1.14:0.22, R_R高于1.32, 即氨氮实际去除量高于Anammox理论氨氮去除量, 系统氨氮有“超量去除”现象, 氨氮“超量去除”量占氨氮总去除量的13.31%.在22 d时保持其他条件不变, 通过提高进水NO₂^--N浓度, 将R_I由1.00提高到1.11.结果发现, 总氮平均去除速率提高到767.88 mg·L^-1·d^-1, NH₄⁺-N/NO₂^--N/NO₃^--N变化比值稳定在1:1.19:0.24, 氨氮“超量去除”量占氨氮总去除量的比值降低到8.19%.若考虑进水中含有少量的DO, 若按8 mg·L^-1计算, NH₄⁺-N先被转化为NO₂^--N后再与NH₄⁺-N进行Anammox反应也仅能去除4 mg·L^-1左右的NH₄⁺-N, 小于系统“超量去除”的氨氮量.可见R_I对Anammox系统中氮去除比值R_R及氨氮的“超量去除”有较大影响.

3.2 间歇供给亚硝氮的Anammox反应器氨氮去除特性

从第35 d开始, 以交替进水方式向反应器供给两种不同进水(①NH₄⁺-N 200 mg·L^-1、NO₂^--N 200 mg·L^-1；②NH₄⁺-N 200 mg·L^-1、NO₂^--N 0 mg·L^-1), 每6 h改变进水种类.通过这种间歇性供给NO₂^-的办法, 研究了Anammox系统在间歇提供NO₂^-的情况下氮去除效果.

在连续运行的21 d内, 系统中氮素浓度及pH值等参数变化基本相同.图 3为第16 d时一个交替运行期间的情况.在交替进水过程中, 出水NH₄⁺-N、NO₃^--N浓度和反应器pH值呈现规律性对称性波动.当停止提供NO₂^--N时, 由于缺少电子受体, Anammox反应受到抑制, 出水NH₄⁺-N浓度缓慢上升, pH值下降, NO₃^--N由于进水稀释作用浓度下降；随后由于NO₂^--N的供给, 发生Anammox反应, 出水NH₄⁺-N又逐渐回落, pH值和NO₃^--N浓度升高.系统在交替进水运行过程中, 出水pH一直低于进水, 交替进水周期内无论供给或者不供给NO₂^-, 出水中都能检测到少量的NO₂^-.经过计算, 一个交替进水过程中, 平均进水NO₂^--N为100 mg·L^-1, 平均去除量为97.44 mg·L^-1, 按Anammox反应理论上能去除NH₄⁺-N 75.76 mg·L^-1.而实际NH₄⁺-N平均去除量达到105.29 mg·L^-1, 比理论去除量高(“超量”)29.53 mg·L^-1, “超量去除”的氨氮量占去除总量28.05%, 表明减少NO₂^-供应后, 氨氮“超量去除”现象会更加明显.

3.3 停供亚硝氮对Anammox系统中氨氮去除的影响

在间歇供给NO₂^-的试验中发现, 当减少NO₂^-供应后, 氨氮“超量去除”更加明显.那么如果进水完全不供应NO₂^-, 在厌氧条件下Anammox反应器中是否还能实现NH₄⁺的去除？随后向反应器中完全停止NO₂^-供应, 只提供NH₄⁺, 连续运行了151 d, 结果如图 4所示.从图 4中可以看出, 停止供应NO₂^-后, 系统中NH₄⁺一直有连续、稳定的去除.从反应器中可以观察到不断有少量的气泡产生.在第1~10 d时保持进水NH₄⁺-N浓度为200 mg·L^-1, 在此阶段内NH₄⁺-N的平均去除率为12.44%, 平均去除速率为36.8 mg·L^-1·d^-1.从第11 d开始, 每日配水均采用高纯氮气进行脱氧处理, 并将进水桶密封防止进水复氧, 而且反应器密封, 其中还有少量气体产物, 这样尽可能杜绝了空气中的O₂进入反应器, 力求反应器内形成一个更加严格的厌氧环境.从图 4中1~32 d的NH₄⁺-N变化情况来看, DO对NH₄⁺-N的去除几乎无影响.在第33 d降低进水NH₄⁺-N浓度到150 m·L^-1, 随着培养时间的增加, NH₄⁺-N去除速率缓慢上升, 到110 d时达到68.77 mg·L^-1·d^-1, 去除率最高能达到60.04%.即使在传统硝化-反硝化脱氮反应器中(SRT控制在10~30 d), 污泥通过同化作用去除的氮仅为8%~20%.考虑到厌氧自养微生物生长更加缓慢, 反应器运行以来都未曾排过污泥, 也未见污泥量有明显增长, 因此通过该UASB反应器中污泥同化作用去除的氮量应远小于前述比例.实际上本研究中总氮去除率最大达45.44%, 远高于同化作用摄取的氮量, 说明该去除不可能以同化作用为主.另外, 虽然污泥具有一定的吸附能力, 但吸附剂都有饱和量, 吸附饱和后就不会再继续吸附了.在本研究中, 也可以基本排除污泥吸附导致氨氮的“去除”.况且除分子筛、离子交换树脂和特殊沸石外, 活性污泥和活性炭等吸附剂对水中氨态氮的吸附量都不大, 所以去除的NH₄⁺绝大部分应归结于微生物之间的异化作用.在52~110 d时, 将进水pH由8左右调节到7.3左右, 系统整体表现为氨氧化脱氮, 是pH降低的过程, 出水pH由7.5左右降低到7左右, 出水NO₂^--N与NO₃^--N积累量有所增加.实验过程中通过检测进出水NH₄⁺-N变化情况适时改变HRT来调节运行负荷, 发现HRT的改变会引起NH₄⁺-N去除量的变化, 但系统总氮损失速率一直保持相对稳定状态.

虽然停供NO₂^-后仍有NH₄⁺去除, 但所利用的电子受体尚不明确.有研究(李祥等, 2012; 袁怡等, 2013; Rikmann et al., 2012)认为在厌氧无机环境条件下, Anammox系统中不供给NO₂^-时, SO₄^2-可以代替NO₂^-作为氨氧化的电子受体.但本反应器运行过程中, 始终未检测到SO₄^2-去除现象(图 4), 所以本反应器中的NH₄⁺并非因SO₄^2-还原作用而去除.有研究(Cabiscol et al., 2000; Dwyer et al., 2012)表明, 微生物代谢过程能够产生活性氧类物质, 形成超氧自由基(O₂^-)和羟基自由基(·OH), 并且Zhang等(2014)认为在缺乏NO₂^-的Anammox体系中, 微生物受到抑制或细胞降解过程能够产生诸如·OH等氧化物, 从而导致氨的厌氧氧化.

3.4 高通量测序结果分析

反应器中氮的去除是由微生物作用的结果, 为了更好的解释厌氧条件下停供NO₂^-后Anammox反应器中NH₄⁺的去除过程, 利用高通量测序技术对间歇供给NO₂^-实验之前(Y2)和停供NO₂^-运行110 d后(Y3)的污泥进行分析.两个污泥样品的Alpha多样性指标如表 1所示.两个样本中的Coverage值菌大于99%, 说明测序结果能非常好的代表样品的微生物组成.Shannon指数和Simpson指数等均表明停供NO₂^-后, 微生物多样性增加.这主要因为在停供NO₂^-后, 反应器中的NH₄⁺去除需要更多的微生物协同作用发生更为复杂的生化反应.

测序结果表明, 在停供NO₂^-培养前后样品中均检测到厌氧氨氧化菌、氨氧化菌、反硝化菌及少量的亚硝酸盐氧化菌.图 5对所检测到的主要脱氮微生物在属水平上进行了比较分析, 发现它们在整个菌群中所占的相对比例有较大的变化.长期停供NO₂^-培养前后, 系统中有大量的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)微生物得以增长, 它们为没有获得过纯培养的细菌(uncultured bacterium), 其占总细菌的比例由4.67%增加到22.03%.Y2和Y3样品来自厌氧自养环境中的污泥, 培养过程中对进水中溶解氧(DO)进行脱除处理并没对系统氮的去除产生影响, 说明系统中NH₄⁺的去除并不是由微量DO引起, 这些Nitrosomonas能在厌氧条件下大量生长繁殖, 并将水中的NH₄⁺-N转化为NO₂^--N, 因此Anammox反应器中常发现的NH₄⁺ “超量去除”的现象也是由此造成的.Schmidt(1997)与Bock(1995)等曾分别发现在厌氧条件下Nitrosomonas可以利用不同的电子受体进行氨氧化反应.

由于氨氧化菌将一部分NH₄⁺-N转化为NO₂^--N, 使得系统中存在Anammox菌生长所需基质, Anammox菌可以生长繁殖.样品中检测到Anammox菌有两个属, 其中Candidatus Jettenia属在停供NO₂^--N后有所增长, 其占总细菌的比例由2.48%增加到4.24%, Candidatus Brocadia属占总细菌比例由最初的0.84%减少到0.18%.说明Candidatus Jettenia菌属能够适应极低NO₂^--N环境, 并进行生长繁殖, 而此环境对Candidatus Brocadia属的生长不利, 逐渐被淘汰.

Anammox反应器在停供NO₂^-后, NH₄⁺的去除主要有氨氧化菌和Anammox菌之间的协同作用完成, 当调低进水pH时, 由于氨氧化作用使得系统pH更低, Anammox菌活性降低, 出水中积累的NO₂^--N浓度升高.氨氧化菌和Anammox菌的总量均有所增加, 导致反应器对NH₄⁺-N的去除速率有所增高.微生物系统中存在细胞的死亡, 会产生少量的有机物, 同时由于氨氧化和Anammox作用过程在系统中积累了少量的NO₃^-和NO₂^-, 可以被反硝化细菌利用进行生长, 检测到的反硝化菌主要以Denitratisoma属为主, 占总细菌比例由2.43%提高到了5.67%.两样品中检测到的亚硝酸盐氧化菌丰度菌很低, 主要有unclassified Nitrospinaceae属和硝化菌属(Nitrobacter), 它们占总细菌的总比例仅由0.21%增加到0.35%.

3.5 亚硝氮供给恢复后基质比对系统脱氮的影响

从3.1节可知, 在Anammox系统中, 以Anammox途径去除的NH₄⁺-N与实际去除的NH₄⁺-N之间有一定的差值, 该值受进水基质比例R_I的影响.在停供NO₂^-后, 亚硝化单胞菌和Anammox菌继续增殖, 通过协同作用也能在厌氧自养条件下实现部分NH₄⁺的去除.在停供NO₂^-实验结束后, 通过逐步增加进水NO₂^--N浓度的方式向反应器中重新供应NO₂^-, 反应器运行状况如图 6所示.经过23 d的恢复, 总氮去除速率达到749.65 mg·L^-1·d^-1, 之后继续通过控制进水浓度和HRT来改变进水NH₄⁺-N和NO₂^--N负荷, 获得很好的总氮去除效果.在进水比从0.17增大到1.30的过程中, NH₄⁺-N的去除率逐渐增大, 与黄国涛等(2012)研究不同R_I对NH₄⁺-N去除率的影响时发现的随着R_I的增加NH₄⁺-N去除率增加的变化趋势相似, 而NO₂^--N去除率随R_I增大有减小的趋势, 在R_I为1.14后, NH₄⁺-N去除率与NO₂^--N去除率相同.唐崇俭等(2009)认为NO₂^--N对Anammox菌有较强毒性, 当R_I大于1.32后, 易引发反应器脱氮效果降低的障碍.在第109 d时, R_I为1.50, 进水NO₂^--N负荷高达900 mg·L^-1·d^-1, 对反应器造成一定的毒性, 导致氮去除率同时下降.

不同R_I下反应器中氨氮“超量去除”量占氨氮总去除量的百分比及R_R的变化情况如图 6d和6c所示.氨氮“超量去除”量占氨氮总去除量的百分比随着R_I的逐渐增大, 呈负相关关系(R²=0.9089).在R_I为0.17时, 进水NO₂^--N浓度为25.23 mg·L^-1, 而按Anammox途径理论消耗的NH₄⁺-N量为18.48 mg·L^-1, 实际检测到NH₄⁺-N减少了58.86 mg·L^-1, 因此“超量去除”的NH₄⁺-N量占总去除量的比例高达68.93%, “超量去除”的氨氮量相对于不供NO₂^-时去除的氨氮量只减少了4.40 mg·L^-1.随着进水比逐渐增加到1.00的过程中, 由于NO₂^-供给量增加, Anammox反应基质逐渐充足, Anammox菌活性得到充分发挥, NH₄⁺-N去除率在快速提高, 氨氮“超量去除”百分比也逐渐下降到15.71%, 但相较于3.1节中的“超量去除”百分比(13.31%)略有增加, 笔者认为这主要是因为系统内的亚硝化单胞菌得到大量增殖并与Anammox菌进行了协同脱除氨氮, 使得氨氮“超量去除”有所提高.在R_I小于1.32时, 氨氮“超量去除”百分比一直为正, 氨氧化作用一直在进行, 只是活性随R_I增大而降低.但当R_I达到1.50时, 氨氧化微生物活性受到严重抑制, 反硝化菌活性逐渐加强, 使得氨氮“超量去除”百分比呈现负值, 出现NO₂^--N去除“过量”现象.

R_R随R_I增大而增大(图 6c), 呈正相关关系(R²=0.91206).NH₄⁺是氨氧化菌和Anammox菌共同的基质, 系统中共存的这两种微生物对NH₄⁺有竞争作用, 当NO₂^-供给比例增加, Anammox基质足够充足促使Anammox活性逐渐加强, 而氨氧化作用受到NO₂^-抑制作用增强.在开始恢复NO₂^-供应时R_I为0.17, 由于氨氧化作用很强, 氨氮“超量去除”量较大, R_R较低, 为0.87；当R_I提高到1.14时, NO₂^--N和NH₄⁺-N去除率基本相同, R_R也为1.14, 在此进水比例下NH₄⁺与NO₂^-能同时得到最佳去除效果.R_I小于1.14时, R_R一直大于R_I, 但当R_I大于1.14后, R_R开始低于R_I.当R_I增加到1.50时, 氨氧化作用抑制加重, 反硝化菌竞争力增强并利用微生物死亡产生的少量有机物进行反硝化作用将少量NO₂^-反应掉, 使得NO₂^-出现过量去除, R_R达到1.35, 大于Anammox理论比值.

4 结论(Conclusions)

1) 在Anammox反应器中, 当进水NO₂^-供给相对不足时, 会出现明显的氨氮“超量去除”现象, “超量去除”量占总去除量的百分比与R_I呈负相关关系. R_R随R_I增加而有所提高, 呈正相关关系, R_I对Anammox反应器脱氮效果影响很大, 在R_I为1.14时, 反应器运行可达到最佳脱氮效果.

2) 在厌氧不提供NO₂^-的条件下, Anammox活性污泥依然能够对进水中的NH₄⁺-N实现一定的脱除.Anammox反应器在长期停供NO₂^-后, 其中微生物群落多样性还有所增加, Anammox菌、氨氧化菌、反硝化细菌的相对丰度有所增加.此环境中的氨氧化菌(Nitrosomonas)对NH₄⁺-N的氧化去除不依赖于溶解氧, 可以在厌氧状态下发生氨氧化反应生成NO₂^--N, Anammox菌与之协同作用实现氮的脱除.在低浓度NO₂^--N、高浓度NH₄⁺-N的环境中Anammox菌中的Candidatus Jettenia属能够适应并大量生长, 而Candidatus Brocadia属并不适应该环境, 其丰度降低.

3) Anammox反应器中氨氧化菌与Anammox之间同时存在协同作用与竞争作用, 这两种作用的强度受R_I影响, 在R_I由0逐渐增大到1.30的过程中, 氨氧化作用逐渐减弱, Anammox菌活性逐渐增强.