2017, Vol. 37
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直接染料是一类能够直接让纤维及其他物质着色的染料，也是最为常见的染料种类之一(刘转年等, 2007; 马俊等, 2011).但在直接染料使用过程中约有10%的染料被排放到水中，造成严重的水环境污染(Revankar et al., 2007; Forgacs et al., 2004; Levin et al., 2004).另外，由于直接染料具有较强的亲水性，导致直接染料废水很难达到较好的处理效果，因此，研究直接染料废水处理技术对于未来直接染料的持续应用具有重要的意义.
目前，针对染料废水的处置方法主要包括物理、化学和生物法(梁宏等，2003).其中，物理和化学法虽然具有较好的脱色效果，但存在COD去除率低、成本高、产生二次污染等特点，严重阻碍了染料废水处理技术的推广和应用(任南琪等, 2013).而生物法处理染料废水具有持续性降解、环境友好且对环境产生的二次污染更小等特点(张旭等, 2009).目前在染料废水治理方面应用较多的微生物主要包括细菌、白腐真菌、放线菌和藻类等.其中，白腐真菌凭借其广谱、高效、低耗、适用性强的生物降解能力，对多种结构的染料具有明显的脱色能力(金敏等, 2003; 王慧等, 2008).自20世纪80年代初，Glenn和Gold首次发现黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)可以对部分聚合染料脱色降解以来(Glenn et al., 1983)，人们陆续开展了P. chrysosporium对偶氮、蒽醌、三苯甲烷等不同类型染料降解的研究(王慧等, 2009).近年来，具有脱色能力的白腐真菌被不断挖掘，如彩绒革盖菌(Coriolus versicolor)、变色栓菌(Trametes versicolr)、灵芝(Ganoderma sp.)、粗皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、一色齿毛菌(Cerrena unicolor)等(王慧等, 2009; 于存等, 2017).目前，人们对白腐真菌降解染料的研究已经深入到分子水平，对其降解机理有了一定的了解.但由于白腐真菌发挥降解功能受碳源、氮源、pH、金属离子、盐度、温度等因素的影响，因此，白腐真菌在染料废水治理方面的工业化应用仍存在着诸多问题需要解决.
因此，本研究以直接大红染料为研究对象，在进行菌株CB1鉴定的基础上，采用单因素及正交试验探究菌株CB1脱色直接大红染料的优化条件，以期为菌株CB1在直接染料废水治理方面的应用奠定基础.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料 2.1.1 供试菌株菌株CB1由本实验室人员分离于野外朽木上，菌丝体保存于贵州大学林学院森林保护学科实验室.
2.1.2 染料直接黑CT、直接金黄2GT、直接大红4BS、直接嫩黄5GL、直接兰B2RL等染料及其他化学试剂均购自上海生物工程技术有限公司.
2.1.3 培养基PDA培养基：称取去皮新鲜马铃薯200 g，加入适量水煮沸20 min后，用4层纱布过滤，取滤液依次加入葡萄糖20 g、琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1 L，pH自然；PDB培养基：PDA培养基制作过程中不加入琼脂粉所得液体发酵液；染料发酵液：PDB培养基制作过程中向培养基中加入直接大红染料，使染料终浓度为50 mg·L-1.
2.1.4 试剂盒DNAquick快捷型植物基因组非离心柱型试剂盒(TIANGEN).
2.2 方法 2.2.1 菌株CB1的鉴定挑取PDA斜面菌株CB1的菌丝接种于PDA平皿中央，28 ℃下暗培养7 d，分别于接种后的第1、3、5、7 d观察菌丝生长状况及颜色变化等.同时于第7 d，挑取培养皿中尖端菌丝进行显微结构的观察，完成菌株的形态学鉴定；刮取5皿新活化的菌株CB1菌丝，利用DNAquick快捷型植物基因组非离心柱型试剂盒(TIANGEN)提取菌株CB1的基因组DNA.以基因组DNA为模板，利用ITS1和ITS4真菌通用引物扩增菌株CB1的ITS序列.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后送上海生物工程有限公司测序，序列校正无误后，提交至NCBI的Genbank，并将该序列与Blast比对结果中的序列进行比对分析.同时选取一株偏肿栓菌(Trametes gibbosa)的ITS序列作为外源基因，利用Clust2.0进行序列比对分析，利用MEGA5.0软件的Neighbor-joining法构建系统发育树.
2.2.2 菌株CB1对5种直接染料的脱色在PDA培养基制作的过程中，向培养基中分别加入直接黑CT、直接金黄2GT、直接大红4BS、直接嫩黄5GL、直接兰B2RL染料，使染料终浓度为50 mg·L-1.培养基经121 ℃高温高压灭菌后，无菌条件下制作PDA平皿.截取直径8 mm新活化菌株CB1的菌丝块于平皿中央，28 ℃下暗培养10 d后，观察平皿脱色情况，以不接入菌丝、含相同浓度染料的PDA平皿作为对照.
2.2.3 菌株CB1对直接大红染料脱色的单因素优化碳源和氮源种类对菌株CB1脱色直接大红的影响：在染料发酵液制作过程中分别以20 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉作为碳源，分别向染料发酵液中加入1 g·L-1的硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素、蛋白胨作为氮源，分别取上述40 mL发酵液加入到100 mL三角瓶中，121 ℃高温高压灭菌后，分别向三角瓶中转入直径8 mm新活化的菌株CB1菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d；以染料发酵液中接入直径8 mm新活化的菌株CB1菌丝块3片作为对照，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应处理的染料脱色率.
pH对菌株CB1脱色直接大红的影响：在100 mL三角瓶中加入染料发酵液，分别调整液体培养基的pH为3、5、7、9、11，经121 ℃灭菌后，向三角瓶中接入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d，以pH自然，含有等量染料的发酵液作为对照，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应处理的染料脱色率.
金属离子对菌株CB1脱色直接大红的影响：在100 mL三角瓶中加入40 mL染料发酵液，分别向三角瓶中加入1 mmol·L-1的CuSO4、MnSO4、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeCl3，经121 ℃灭菌后，向三角瓶中接入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d；以染料发酵液接入直径8 mm新活化的菌丝块3片作为对照，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应的染料脱色率.
2.2.4 正交试验优化菌株CB1对直接大红的脱色在单因素试验得出的较优pH条件下，选择较优碳源(A)、氮源(B)、金属1离子浓度(C)和金属2离子浓度(D)设计四因素三水平L9(34)的正交试验，正交试验因素和水平见表 1.在100 mL三角瓶中加入40 mL染料发酵液，按L9(34)的正交表调整培养基中碳源浓度、氮源浓度和2种金属离子浓度进行9个不同处理的脱色试验，发酵液经121 ℃高温高压灭菌后，向三角瓶中加入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应处理的染料脱色率.
| 表 1 正交试验优化菌株CB1脱色直接大红染料的因素水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment in decolorizing direct red by strain CB1 |
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在正交试验的基础上，按正交试验最优条件配置含有50 mg·L-1直接大红染料的PDB液体培养基，121 ℃高温高压灭菌后，向三角瓶中加入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d，分别在第1~7 d测量吸光值，计算对应的染料脱色率.
2.2.6 染料吸光值的测定及脱色率的计算在菌株CB1液体发酵的过程中，分别于培养第1、2、3、4、5、6、7、8、9 d吸取1.2 mL发酵液，10000 r·min-1离心5 min，吸取上层发酵液1 mL，于直接大红4BS染料最大吸收波长λmax=495 nm下测定染料吸光值，以相同处理条件下不接菌的染料发酵液作为对照.测得对照吸光值为L0，不同时间处理吸光值为Lt，则染料脱色率R=(L0-Lt)/L0×100%.
3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 菌株CB1的鉴定菌株CB1生长很快，28 ℃下暗培养7 d后可铺满平皿(直径9 cm)，培养基无明显颜色变化；菌丝紧贴于琼脂培养基表面生长，成绒毛状白色菌落，表面平滑；平皿边缘菌丝为升起的羊毛状(图 1a)，这与由庆和何艳喜对变色栓菌(Trametes versicolor)的形态学鉴定结果相类似(何艳喜，2010; 由庆，2016).菌株CB1的ITS序列扩增得到一长度为643 bp的序列，该序列提交至NCBI数据库获得的Genbank号为KY949632.菌株CB1 ITS序列Blast比对的前100条结果中，该序列与Genbank号为AB811868.1和KJ528276.1的T. versicolor的ITS序列相似性高达100%，与Genbank号为AB811857.1、KC176306.1、FJ810146.1等70余株T. versicolor不同菌株的ITS序列相似性达99%.选取菌株CB1的ITS序列及其Blast比对结果中部分序列及一株T. gibbosa ITS序列共同构建的系统进化树见图 2.由图可知，菌株CB1与不同菌株来源的T. versicolor的ITS序列构成一个分支，分支内亲缘关系较近，而T. gibbosa的ITS序列单独作为一个分支，与菌株CB1及T. versicolor的ITS亲缘关系较远.因此，结合形态学与分子生物学的鉴定结果，将菌株CB1鉴定为变色栓菌，命名为Trametes versicolor CB1.
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| 图 1 菌株CB1形态学鉴定(a.菌株CB1菌落正面；b.菌株CB1菌落反面；c.菌株CB1菌丝显微结构，箭头指向为索状联合) Fig. 1 Morphological identification of strain CB1 (a. strain CB1 positive, b. strain CB1 colony negative, c. strain CB1 hyphal microstructure; arrow pointing to cable like combination) |
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| 图 2 菌株CB1 ITS序列的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain CB1 ITS sequence |
固体条件下，T. versicolor CB1对5种直接染料脱色10 d后的结果见图 3.由图可知，T. versicolor CB1对直接黑CT、直接金黄2GT、直接大红4BS、直接嫩黄5GL、直接兰B2RL 5种直接染料均有脱色能力.肉眼观察平皿颜色变化可发现，T. versicolor CB1对直接大红染料的脱色效果相对更明显，故在接下来的试验中以直接大红染料为研究对象，进行T. versicolor CB1对直接大红染料脱色条件的优化.
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| 图 3 菌株CB1对5种直接染料的固体脱色 Fig. 3 Decolorization of 5 direct dyes by strain CB1 on the solid medium |
不同碳源、氮源条件下，T. versicolor CB1对直接大红染料的脱色结果见图 4.由图 4a可知，与不添加碳源相比，几种碳源的添加均利于T. versicolor CB1对直接大红染料的脱色.其中，果糖与可溶性淀粉作为碳源的脱色效果更好，蔗糖、麦芽糖、葡萄糖作为碳源条件下的脱色效果依次减弱.由图 4b可知，与不添加氮源相比，添加蛋白胨、氯化铵、尿素作为氮源的脱色率反而更低，添加硫酸铵作为氮源与不填加氮源的脱色率相近，而硝酸铵作为氮源条件下的脱色率高于不添加氮源条件下的脱色率.由此确定最佳碳源为果糖，最佳氮源为硝酸铵.方差分析结果显示，Sig.值 < 0.05，表明不同碳源和不同氮源对T. versicolor CB1脱色直接大红染料的影响均显著.
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| 图 4 碳源(a)和氮源(b)种类对菌株CB1脱色直接大红的影响 Fig. 4 Effect of carbon(a) and nitrogen(b) source on decolorization of direct scarlet by strain CB1 |
不同pH条件下菌株CB1对直接大红9 d内的脱色效果见图 5.由图可知，与pH自然条件下的脱色率相比，pH=9、11、3条件下的脱色率相对较低且依次减弱.而pH=7和pH=5条件下的脱色率均高于pH自然条件下的脱色率，且pH=5更利于菌株对直接大红的脱色.由此可知，过酸和过碱的条件均不利于菌株CB1对直接大红的脱色，而中性偏酸的条件更适合菌株CB1对直接大红的脱色.方差分析结果显示，Sig.值 < 0.05，表明pH对T. versicolor CB1脱色直接大红染料的影响显著.
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| 图 5 pH对菌株CB1脱色直接大红的影响 Fig. 5 Effect of pH on decolorization of direct scarlet by strain CB1 |
添加不同金属离子条件下菌株CB1对直接大红9 d内的脱色率变化见图 6.由图可知，添加ZnSO4、MgSO4、MnSO4条件下的脱色率均低于对照条件下的脱色率，且脱色率依次减弱.而添加FeCl3、CaCl2、CuSO4条件下的脱色率总体高于对照条件下的脱色率，且脱色率依次增高.故选择CuSO4和CaCl2两种金属离子浓度作为2个因素进行后续的正交试验.方差分析结果显示，Sig.值 < 0.05，表明不同金属离子对T. versicolor CB1脱色直接大红染料的影响显著.
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| 图 6 金属离子对菌株CB1脱色直接大红的影响 Fig. 6 Effect of metal ions on decolorization of direct scarlet by strain CB1 |
在单因素试验的基础上，选取果糖浓度、硝酸铵浓度、CuSO4浓度、CaCl2浓度作为4个因素进行3水平的正交试验(表 1).正交试验脱色7 d后的脱色率及分析结果见表 2.通过表 2中各因素不同水平均值Ki的比较可得到每个因素的最大平均值，进而得出脱色的最优组合为A2B3C2D3，即果糖浓度10 g·L-1、NH4NO32 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl23 mmol·L-1.通过比较各因素不同水平的极差R可知RC>RA>RB>RD，即4个因素对染料脱色率的影响大小依次为：CuSO4浓度>果糖浓度>NH4NO3浓度>CaCl2浓度.正交试验方差分析结果显示，果糖浓度、硝酸铵浓度、CuSO4浓度、CaCl2浓度对T. versicolor CB1脱色直接大红染料的影响均显著，且各因素对脱色的影响程度排序与极差分析结果相同.
| 表 2 正交试验优化菌株CB1对直接大红的脱色 Table 2 Orthogonal test to optimize the decolorization of direct red by strain CB1 |
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按正交试验最优组合A2B3C2D3，即pH=5、果糖10 g·L-1、硝酸铵2 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl2 3 mmol·L-1，配置染料发酵液，取此发酵液40 mL装于100 mL三角瓶中，接种直径8 mm菌丝3片，28 ℃下培养7 d的脱色率变化见图 7.由图可知，优化组合1~7 d的脱色率均高于对照组脱色率，优化组合在第7 d时的脱色率为78.23%，比对照组第7 d时的脱色率(63.07%)提高了24.04%.另外，正交验证第7 d时的脱色率要高于正交试验中9个试验组合中的最高脱色率76.08%，表明正交试验得当，结果可靠.
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| 图 7 正交试验验证与对照脱色率 Fig. 7 The decolorization rate of orthogonal test validation and the control |
1) 本研究从野外朽木上分离得到一株可以有效降解直接染料的白腐真菌CB1，经形态学和分子生物学鉴定，菌株CB1被鉴定为变色栓菌(Trametes versicolor).
2) 为检测T. versicolo CB1对直接染料的脱色能力，进行了T. versicolo CB1脱色固体条件下5种直接染料，结果表明，T. versicolo CB1对5种直接染料均可脱色，其中对直接大红的脱色最为明显.
3) 利用单因素试验对T. versicolo CB1脱色直接大红的脱色条件进行优化，优化的结果为：碳源为果糖，氮源为硝酸铵，pH=5，金属离子为CuSO4和CaCl2.
4) 利用正交试验进行T. versicolo CB1脱色直接大红的优化，优化结果为：果糖10 g·L-1、硝酸铵2 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl23 mmol·L-1、pH=5，该条件下第7 d时的脱色率为78.23%，比优化前的脱色率提高了24.04%.
Forgacs E, Cserhati T, Oros G. 2004. Removal of synthetic dyes from wastewaters: A review[J]. Environment International, 30(7): 953–971.
DOI:10.1016/j.envint.2004.02.001
|
Glenn J K, Gold M H. 1983. Decolorization of several polymeric dyes by the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium[J]. Applied and Environmental Microbiology, 45(6): 1741–1747.
|
何艳喜. 2010. Trametes versicolor HN0511的鉴定及其产木聚糖酶的分离纯化、性质分析和基因的克隆[D]. 广州: 暨南大学
http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10559-2010124766.htm |
金敏, 李君文. 2003. 白腐菌处理染料废水的研究进展[J]. 环境污染治理技术与设备, 2003, 4(3): 54–58.
|
马俊, 梁彦秋, 孙小寒. 2011. 十六烷基三甲基溴化铵改性粉煤灰吸附酸性大红染料[J]. 辽宁化工, 2011, 40(9): 901–903.
|
Levin L, Papinutti L, Forchiassin F. 2004. Evaluation of Argentinean white rot fungi for their ability to produce lignin-modifying enzymes and decolorize industrial dyes[J]. Bioresour Technology, 94(2): 169–176.
DOI:10.1016/j.biortech.2003.12.002
|
梁宏, 曾抗美. 2003. 染料废水处理方法的研究进展[J]. 四川轻化工学院学报, 2003, 16(2): 20–24.
|
刘转年, 赵西成. 2007. 粉煤灰廉价吸附剂资源化利用的现状和对策分析[J]. 西安建筑科技大学学报(自然科学版), 2007, 39(5): 690–694.
|
由庆. 2016. 产漆酶菌株的筛选及漆酶基因的克隆表达[D]. 哈尔滨: 哈尔滨商业大学
|
任南琪, 周显娇, 郭婉茜, 等. 2013. 染料废水处理技术研究进展[J]. 化工学报, 2013, 64(1): 84–94.
|
Revankar M S, Lele S S. 2007. Synthetic dye decolorization by white rot fungus, Ganoderma sp.WR-1[J]. Bioresour Technology, 98(4): 775–780.
DOI:10.1016/j.biortech.2006.03.020
|
王慧, 郑小伟, 王宾香, 等. 2009. 真菌对染料的脱色研究进展[J]. 应用环境生物学报, 2009, 15(1): 147–151.
|
王慧, 周月霞, 柏仕杰, 等. 2008. 染料废水生物法处理技术的研究进展[J]. 厦门大学学报(自然科学版), 2008, 47(2): 286–290.
|
于存, 池玉杰. 2017. 一色齿毛菌CB1对活性染料的脱色研究[J]. 菌物学报, 2017, 36(6): 743–751.
|
张旭, 陈胜, 孙德智, 等. 2009. 印染废水生物法处理技术研究进展[J]. 长春工业大学学报(自然科学版), 2009, 30(1): 26–32.
|