2017, Vol. 37
[PDF全文]
2. 中国科学院城市环境研究所, 厦门 361021;
3. 江西师范大学化工学院, 南昌 330022
2. Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021;
3. Department of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022
生物电化学系统利用生物电极促进污染物降解和转化, 可实现污染物的资源化, 在能源与环境领域具有广阔的应用前景(Babaey et al., 2007; Logan et al., 2012).电极材料是电活性微生物生长和电子转移的场所, 对生物电化学系统性能的提高具有重要影响.传统的碳电极材料, 如石墨棒、碳纸、碳布和网状玻璃碳等由于表面光滑、比表面积较小等原因, 不利于产电微生物的附着, 生物电化学性能较差(He et al., 2005; Logan et al., 2007).复合材料的大孔结构为产电微生物附着成膜提供了足够的位点, 展现了良好的生物电化学性能, 但由于成本较高, 限制了其在生物电化学系统领域规模化应用(Qiao et al., 2007; Xie et al., 2012a; 2012b; Xie et al., 2011).
以纤维素纸板为原料碳化制备的层状波纹碳(LCC)电极具有制备简单、成本低、生物电化学性能优越等优点, 是规模化应用于生物电化学系统领域的理想电极材料之一.Chen等(2012)采用LCC电极构建的生物电化学系统输出最大电流密度达7.28 mA·cm-2, 是相同厚度石墨板(GP)电极的6.6倍, 其研究结果还表明, LCC电极在生物电化学系统运行过程表现出的良好电化学性能不仅与电极的理化性质有关, 在一定程度上还取决于电极表面形成的生物膜微生物种类和含量.
电化学活性微生物是实现生物电化学系统污染物资源化的关键, Xiao等(2015)采用454高通量测序发现, 不同实验室来源的电化学系统电极生物膜中Acinetobacter guillouiae含量较高.Lee等(2003)比较了以葡萄糖和乙酸钠为底物的电化学系统阳极微生物多样性差异, 发现低丰度的产电菌具有底物特异性分布.比较LCC电极与GP电极在生物电化学系统运行过程形成的生物膜微生物群落结构差异, 有助于加深对微生物群落结构与电极电化学性能之间关系的认识.高通量测序技术不需要对微生物分离培养, 具有较高的测序深度, 可以全面反映微生物群落结构, 目前已广泛应用于分析生物电化学系统电极生物膜微生物群落结构(Ansorge et al., 2009; 吕昌勇等, 2012；Wang et al., 2015).因此, 本研究采用Solexa高通量测序技术系统分析LCC电极和GP电极表面生物膜的微生物群落组成差异, 旨在从微生物学角度认识LCC电极提高生物电化学系统产电效率的机理.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 电极材料制备层状波纹纸板放入高温反应炉, 在氮气的保护下高温碳化.碳化过程为：以10 ℃·min-1的升温速率升到100 ℃, 保温30 min；以5 ℃·min-1的升温速率升温至1800 ℃, 碳化1 h；自然降温至室温, 取出即得LCC电极.
2.2 生物电化学系统结构、启动及运行三电极体系由100 mL广口瓶制成, 分别以LCC电极和GP电极(几何面积均为4 cm2, 2 cm×2 cm)为工作电极, 碳毡为对电极, Ag/AgCl电极为参比电极, 广口瓶加橡胶塞以保证体系厌氧, 工作电极和对电极用钛丝引出, 与参比电极一起固定于橡胶塞.
三电极体系接种6.0 g活性污泥, 加入人工废水(Wang et al., 2013), 电池测试系统(Maccor, 美国)设置体系电位为0.2 V (vs. Ag/AgCl).待输出电流密度降低到0.1 mA·cm-2以下, 更换人工废水, 依此步骤, 直至体系产生稳定重复的输出电流即视为启动成功.
2.3 电极生物膜生物量的测定电极附着微生物采用蛋白质浓度来定量(刘志丹等, 2006), 检测方法采用Bradford法.
2.4 Solexa高通量测序技术 2.4.1 电极表面生物膜DNA提取三电极体系启动后取出工作电极, 经磷酸缓冲液(50 mmol·L-1, pH=7.0)洗涤, 采用细菌DNA提取试剂盒(百泰克, 北京)提取电极生物膜基因组DNA.
2.4.2 PCR扩增以提取的电极生物膜DNA为模板, 采用通用引物27F和533R进行PCR扩增, 其中, 作为测序端的引物533R其5′端加标签标记(Tedersoo et al., 2010), PCR反应体系组成：5×FastPfu缓冲液4 μL, dNTP 2 μL, 正向引物0.6 μL, 反向引物0.6 μL, FastPfu聚合酶0.3 μL, 模板1 μL, 灭菌蒸馏水补足至20 μL.
2.4.3 PCR产物定量及微乳液PCR纯化的PCR产物用Promega公司QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司, 美国)定量后, 将待测样品按比例混合进行微乳液PCR, 获得的PCR产物上机测序.
2.4.4 序列处理获得的原始序列采用QIIME 1.6软件(Zhao et al., 2010)筛选处理, 去除包括平均质量低于25、模糊碱基数大于0及长度短于200 bp的序列, 使用Shannon指数、Chao1指等表征各个样品微生物群落多样性；主要OTU序列上传至Genbank, 登录号为KU373084-KU373116.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 层状波纹纸盒碳化电极的表征层状波纹纸盒碳化后呈黑色, 横截面呈波形, 波峰高度约为2 mm, 波长约为3 mm (图 1).从LCC的扫描电镜结果可推断, 这种碳材料具有多层次的多孔、大孔结构, 非常适合微生物的生长和附着.
 |
| 图 1 层状波纹状纸盒碳化后电镜切面放大图 Fig. 1 Scanning electron micrograph of LCC after carbonization |
四探针导电率测试仪测试LCC电极和GP电极导电性能, 结果显示, 两种电极的导电性都很好, 其中, GP电极的导电率达35.71 S·cm-1, 高于LC电极的15.63 S·cm-1.相同运行的条件下, LCC电极构建的生物电化学系统输出最大电流密度是GP电极的6.6倍, 说明LCC电极良好的生物电化学性能并仅取决于其良好的导电性.
3.3 电极生物膜生物量测定LCC电极生物膜微生物量为(1.277±0.008) mg·cm-2, 高于GP电极的(0.514±0.009) mg·cm-2, 这可能是由于LCC电极材料具有的有序多孔结构, 比表面积大, 表面形成的生物膜较容易吸收培养液中的营养物质, 更加有利于微生物的生长繁殖.
3.4 高通量测序分析细菌群落多样性 3.4.1 测序质量及生物膜细菌多样性评价采用Solexa高通量测序技术对电极生物膜细菌16S rRNA基因V3区序列进行分析, 测序结果及多样性指数如表 1所示.从表 1可知, LCC电极生物膜共获得原始序列12643条, 优化后获得序列11623条, 测序覆盖深度为0.82, 97%相似度聚类分析产生2786个OTUs; GP电极生物膜共获得12837条有效序列, 获得优化序列11943条, 测序深度为0.80, 经过97%相似度聚类分析产生OTUs 3130个.
| 表 1 Solexa高通量测序及多样性统计 Table 1 Solexa high-through sequencing information and diversity statistics |
 |
LCC电极生物膜Chao1指数及Shannon指数分别为11131及7.89, 均小于GP电极生物膜(12488及8.37), 说明LCC电极生物膜内细菌的丰度和多样性均低于GP电极生物膜.这可能是由于LCC电极的结构和化学组成的特异性, 对电化学活性微生物具有一定的选择性富集, 表现出较高的输出电流密度, 以及较简单的电极生物膜菌落结构.
3.4.2 稀释曲线图 2为LCC电极和GP电极生物膜测序稀释曲线.由图 2可知, 随着获得的序列数量的增加, OTU数量也迅速增加, 随着获得的序列数量进一步增大, OTU数量增加趋于平缓, 但即使测序数量超过12000条, 稀释性曲线仍未饱和, 还是有新的OTU出现.本次测序结果能大致描述样品细菌组成, 从整体水平反映出LCC电极和GP电极生物膜菌落结构差异.
 |
| 图 2 LCC电极和GP电极生物膜样品稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curves of biofilm attached to LCC and GP electrodes |
LCC电极和GP电极生物膜菌落结构在门的水平上表现出了较高的多样性(图 3).在LCC电极生物膜中, 相对含量超过1%的门共计有9个, 而GP电极生物膜有6个.两电极生物膜菌落在门分类水平最明显差异在于Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes所占比例的不同, 这3个门的细菌分别占总序列数的76%(LCC)和85%(GP).电极生物膜中含量最为丰富是Proteobacteria, 其在LCC和GP电极生物膜的含量分别为52%和62%.目前大多数已知的产电菌(如Geobacter和Shewanella等)都属于Proteobacteria, 说明生物电化学系统电极材料对电化学活性细菌富集具有一定的择选性.三电极体系测试结果表明, 单层波纹的LCC电极产生的最大电流密度高达7.28 mA·cm-2, 而相同厚度GP电极产生的最大电流密度只有1.10 mA·cm-2(Chen et al., 2012).
 |
| 图 3 电极生物膜细菌在门分类水平组成(a.LCC电极, b.GP电极) Fig. 3 Relative abundance of bacterial community composition at phylum levels (a.LCC, b.GP) |
电极生物膜细菌在纲分类水平含量差异如图 4所示.生物膜主要含有α-、β-、γ-、δ-Proteobacteria, Bacteroidia等纲细菌.其中, Β-Proteobacteria在石墨板电极生物膜中含量为43.5%, 远高于LCC电极的13.4%, 目前该纲已知的电化学活性微生物仅有Comamonas denitrificans(Xing et al., 2010)和Rhodoferax ferrireducens(Chaudhuri et al., 2003).而δ-Proteobacteria在LCC电极生物膜中含量为25.8%, 远高于GP电极的5.8%, 该纲已知的产电菌种类较多, 如Desulfuromonas(Bond et al., 2002)、Desulfovibrio(Zhao et al., 2008)、Geobacter(Lovley et al., 1993)、Geopsychrobacter(Holmes et al., 2004)等.
 |
| 图 4 电极生物膜细菌在纲分类水平含量 Fig. 4 Relative abundance of bacterial community composition at class levels |
在属分类水平上菌群结构如表 4所示, 两个电极生物膜中含量大于0.5%的属共有17个, 它们在LCC电极和GP电极生物膜中的含量分别为37.33%和38.67%.从统计结果可知, 两种电极生物膜所含细菌种类相似, 但含量差异较大, 尤其是Geobacter和Dysgonomonas等电化学活性细菌, 这可能与电极材料的不同对细菌的选择性富集有关(Sun et al., 2011).与GP电极相比, LCC电极输出电流密度越高, 其生物膜细菌群落结构相对越简单, 但产电菌含量相对较高.吴义诚等(2016)研究表明, 电极生物电化学性能越好, 其电极生物膜微生物群落结构相对越简单, 电化学活性微生物含量相对较高.
| 表 4 电极生物膜中相对丰度高于0.5%微生物OTU组成 Table 4 The relative abundance of OTU composition above 0.5% in the biofilm |
|
相比于DGGE和克隆文库等传统的微生物群落结构分子生物学分析手段, 高通量测序技术能更准确、全面地反应电极微生物群落结构, 可检测到电极生物膜中较低丰度的电化学活性微生物(Wang et al., 2015; 吴义诚等, 2014；Sun et al., 2011).
4 结论(Conclusions)LCC电极良好的电化学性能并不完全取决于其良好的导电性能, 其多孔有序的结构为产电微生物附着成膜提供了足够的位点, 使其展现了良好的生物电化学性能.GP电极生物膜细菌群落的丰度和多样性都高于LCC电极.LCC电极生物膜中电化学活性细菌Geobacter含量远高于相同条件下运行的GP电极生物膜.
| [${referVo.labelOrder}] | Ansorge W J. 2009. Next-generation DNA sequencing techniques[J]. New Biotechnology, 25(4) : 195–203. DOI:10.1016/j.nbt.2008.12.009 |
| [${referVo.labelOrder}] | Bond D R, Lovley D R. 2002. Electrode reducing microorganisms harvestingenergy from marine sediments[J]. Science, 295(5554) : 483–485. DOI:10.1126/science.1066771 |
| [${referVo.labelOrder}] | Chaudhuri S K, Lovley D R. 2003. Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells[J]. Nature Biotechnology, 21(10) : 1229–1232. DOI:10.1038/nbt867 |
| [${referVo.labelOrder}] | Chen S, He G, Liu Q, et al. 2012. Layered corrugated electrode macrostructures boost microbial bioelectrocatalysis[J]. Energy &Environmental Science, 5(12) : 9769–9772. |
| [${referVo.labelOrder}] | He Z, Minteer S D, Angenent L T. 2005. Electricity generation from artificial wastewater using an upflow microbial fuel cell[J]. Environmental Science & Technology, 39(14) : 5262–5267. |
| [${referVo.labelOrder}] | Holmes D E, Nicoll J S, Bond D R, et al. 2004. Potential role of a novel psychrotolerant member of the family Geobacteraceae, Geopsychrobacter electrodiphilus gen.nov., sp.nov., in electricity production by a marine sediment fuel cell[J]. Applied and Environmental Microbiology, 70(10) : 6023–6030. DOI:10.1128/AEM.70.10.6023-6030.2004 |
| [${referVo.labelOrder}] | Lee J, Phung N T, Chang I S, et al. 2003. Use of acetate for enrichment of electrochemically active microorganisms and their 16S rDNA analyses[J]. FEMS Microbiology Letters, 223(2) : 185–191. DOI:10.1016/S0378-1097(03)00356-2 |
| [${referVo.labelOrder}] | 刘志丹, 连静, 杜竹玮, 等. 2006. 利用异化金属还原菌构建含糖微生物燃料电池[J]. 生物工程学报, 2006, 22(1) : 131–137. |
| [${referVo.labelOrder}] | Logan B E, Chen S, Waston V, et al. 2007. Graphite fiber brush anodes for increased power production in air-cathode microbial fuel cells[J]. Environmental Science & Technology, 41(9) : 3341–3346. |
| [${referVo.labelOrder}] | Logan B E, Rabaey K. 2012. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals by using microbial electrochemical technologies[J]. Science, 337(6095) : 686–690. DOI:10.1126/science.1217412 |
| [${referVo.labelOrder}] | Lovley D R, Giovannoni S J, White D C, et al. 1993. Geobacter metallireducens gen.nov.sp.nov., a microorganism capable of coupling the complete oxidation of organic compounds to the reduction of iron and other metals[J]. Archives of Microbiology, 159(4) : 336–344. DOI:10.1007/BF00290916 |
| [${referVo.labelOrder}] | 吕昌勇, 陈朝银, 葛锋, 等. 2012. 微生物分子生态学研究法的新进展[J]. 中国生物工程杂志, 2012, 32(8) : 111–118. |
| [${referVo.labelOrder}] | Qiao Y, Li C, Bao S, et al. 2007. Carbon nanotube/polyaniline composite as anode material for microbial fuel cells[J]. Journal of Power Sources, 170(1) : 79–84. DOI:10.1016/j.jpowsour.2007.03.048 |
| [${referVo.labelOrder}] | Rabaey K, Rodriguez J, Blackall L, et al. 2007. Microbial ecology meets electrochemistry:electricity-driven and driving communities[J]. The ISME Journal, 1(1) : 9–18. DOI:10.1038/ismej.2007.4 |
| [${referVo.labelOrder}] | Sun Y, Wei J, Liang P, et al. 2011. Electricity generation and microbial community changes in microbial fuel cells packed with different anodic materials[J]. Bioresource Technology, 102(23) : 10886–10891. DOI:10.1016/j.biortech.2011.09.038 |
| [${referVo.labelOrder}] | Tedersoo L, Nilsson R, Abarenkov K, et al. 2010. 454 Pyrosequencing and Sanger sequencing of tropical mycorrhizal fungi provide similar results but reveal substantial methodological biases[J]. New Phytologist, 188(1) : 291–301. DOI:10.1111/j.1469-8137.2010.03373.x |
| [${referVo.labelOrder}] | Wang R, Wu Y, Zheng Y, et al. 2015. Efficient degradation of sulfamethoxazole and the response of microbial communities in microbial fuel cells[J]. RSC Advances, 5(69) : 56430–56437. DOI:10.1039/C5RA08438E |
| [${referVo.labelOrder}] | Wang Z, Zheng Y, Xiao Y, et al. 2013. Analysis of oxygen reduction and microbial community of air-diffusion biocathode in microbial fuel cells[J]. Bioresource Technology, 144 : 74–79. DOI:10.1016/j.biortech.2013.06.093 |
| [${referVo.labelOrder}] | 吴义诚, 邓欢, 肖勇, 等. 2014. DGGE及T-RFLP分析光照下电位对细菌群落的影响[J]. 环境科学, 2014, 35(6) : 2328–2333. |
| [${referVo.labelOrder}] | 吴义诚, 贺光华, 郑越, 等. 2016. 基于高通量测序解析碳化温度对麻杆电极微生物群落影响[J]. 环境科学学报, 2016, 36(6) : 2271–2275. |
| [${referVo.labelOrder}] | Xiao Y, Zheng Y, Wu S, et al. 2015. Pyrosequencing reveals a core community of anodic bacterial biofilms in bioelectrochemical systems from China[J]. Frontiers in Microbiology, 6 : 1410. |
| [${referVo.labelOrder}] | Xie X, Hu L, Pasta M, et al. 2011. Three-dimensional carbon nanotube-textile anode for high-performance microbial fuel cells[J]. Nano Letters, 11(1) : 291–296. DOI:10.1021/nl103905t |
| [${referVo.labelOrder}] | Xie X, Ye M, Hu L, et al. 2012a. Carbon nanotube-coated macroporous sponge for microbial fuel cell electrodes[J]. Energy & Environmental Science, 5(1) : 5265–5270. |
| [${referVo.labelOrder}] | Xie X, Yu G, Liu N, et al. 2012b. Graphene-sponges as high-performance low-cost anodes for microbial fuel cells[J]. Energy & Environmental Science, 5(5) : 6862–6866. |
| [${referVo.labelOrder}] | Xing D, Chen S, Logan B C, et al. 2010. Isolation of the exoelectrogenic denitrifying bacterium Comamonas denitrificans based on dilution to extinction[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 85(5) : 1575–1587. DOI:10.1007/s00253-009-2240-0 |
| [${referVo.labelOrder}] | Zhao F, Rahunen N, Varcoe J R, et al. 2008. Activated carbon cloth as anode for sulfate removal in a microbial fuel cell[J]. Environmental Science & Technology, 42(13) : 4971–4976. |
| [${referVo.labelOrder}] | Zhao Y G, Wang A J, Ren N Q. 2010. Effect of carbon sources on sulfidogenic bacterial communities during the starting-up of acidogenic sulfate-reducing bioreactors[J]. Bioresource Technology, 101(9) : 2952–2959. DOI:10.1016/j.biortech.2009.11.098 |