2017, Vol. 37
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多环芳烃是由两个及两个以上苯环组成的挥发性或半挥发性的碳氢化合物, 由未完全燃烧的燃料、煤炭、木材、烟草和石油等有机高分子材料产生, 是一类具有致癌或致畸活性的有机污染物.多环芳烃种类繁多, 目前为止发现的有200多种, 其中16种被美国环保署列为优先控制污染物, 7种被我国列为优先控制的污染物(Tsai et al., 2007).PAHs在环境中的含量很低, 但由于其具有生物蓄积性及半挥发性的特性, 且难于降解, 在环境中能持久性存在, 广泛分布在气体颗粒、食物、土壤和一些职业环境中, 易通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体(牛红云等, 2006), 对人体的危害较大.多环芳烃主要通过吸入污染的空气, 摄入木炭烧烤肉类和其他烟熏食品等方式进入人体.血液和尿液中的多环芳烃水平被作为表征多环芳烃暴露情况的生物标记物(Brandt et al., 2003).我国南方某市部分中学生尿1-羟基芘含量高达0.18 μmol·mol-1肌酐(岳强等, 2009).多环芳烃在人的血液及脂肪组织中均有残留, 其中在萨特阿拉伯正常人体血液中残留量高达42.76 ng·mL-1(Al Daghri et al., 2014).
长期接触大量的多环芳烃, 可产生多种损伤, 如氧化应激、DNA加合物的形成等(Liu et al., 2006; Wang et al., 2007), 最终引起癌症或者其他疾病.苯并[b]荧蒽是含有5个苯环的一种典型多环芳烃化合物, 具有很强的致癌性(Castaño-Vinyals et al., 2004), 仅次于苯并a芘, 且在环境中含量较其他异构体高, 有报道显示珠江三角洲地区河流表层沉积物中苯并[b]荧蒽浓度高达828 ng·g-1(麦碧娴等, 2000), 被定为海洋环境中优先控制和必须检测的污染物.在16种优先控制的多环芳烃中, 5~6环的多环芳烃在颗粒物中占主要地位, 其中苯并[b]荧蒽(13.5%)占主导地位(吴明红等, 2014).且苯并[b]荧蒽对机体有一定的损害作用, 能引起翡翠贻贝内脏团脂质MDA含量升高, 并具有剂量-效应和时间-效应关系(杨涛等, 2006).
由于免疫细胞接近于皮肤、呼吸道和消化道等环境污染物潜在进入点, 因此免疫系统容易受到污染物的影响.研究表明, 多环芳烃可以改变T和B淋巴细胞的功能, 损害单核细胞, 是一类具有免疫抑制能力的环境污染物(Burchiel et al., 2001).一些多环芳烃(如, 苯并蒽, 苯并芘)会引起炎症免疫反应.已知在暴露试验中, 暴露浓度越低越能反映现实暴露情况(Oostingh et al., 2015), 然而, 有关环境浓度下多环芳烃的毒理学研究甚少.因此, 本研究以致癌性多环芳烃苯并[b]荧蒽为研究对象, 研究其在环境浓度下对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性、氧化损伤、炎症因子的释放及吞噬能力的影响, 有助于我们深入了解环境持久性有机污染物对免疫细胞的毒性作用.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料 2.1.1 实验试剂：DMEM高糖培养液培养液(吉诺生物医药技术有限公司), 四甲基偶唑盐(MTT)(江苏鸿声化工厂), 胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司), 胰蛋白酶-EDTA(北京大学生物科技有限公司), 二甲基亚砜(DMSO), 苯并[b]荧蒽(北京振翔科技有限公司), SOD活性检测试剂盒, MDA测定试剂盒, 活性氧(ROS)检测试剂盒(碧云天), LDH测定试剂盒(南京建成), IL-6, IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒(上海哈灵生物科技有限公司), FITC标记的大肠杆菌(invitrogen公司).
2.1.2 仪器设备：低温高速离心机(德国eppendorf), 细胞培养箱(德国Heraeus有限公司), DMIL型倒置荧光显微镜(德国Leica公司), JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所), SpectraMax 190(美国分子仪器有限公司), CHB-100恒温金属浴杭州博日科技有限公司, Automatic ice machine(英国Grant公司).
2.2 实验方法 2.2.1 细胞培养将RAW264.7细胞置于37 ℃, 5%CO2培养箱中, 用含10%胎牛血清、青霉素(1×105 μL-1)及链霉素(100 mg·L-1)的 DMEM培养液传代培养, 实验用细胞处于对数期.
2.2.2 溶液的配制将纯度大于99.9%的苯并[b]荧蒽粉末, 溶于DMSO中, 配制成0.04 mol·L-1的浓度, 室温保存, 染毒前用细胞培养液稀释到实验所需浓度, 使DMSO浓度小于0.1%.
2.2.3 细胞增殖活力的测定用MTT法测定苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞增殖活力的影响.取对数期生长的细胞, 以每孔100 μL(约104个)接种到96 孔板中培养, 设置空白对照组和加药组, 待细胞贴壁12~16 h, 每孔加入200 μL不同浓度(10、30、50、80 nmol·L-1)的苯并[b]荧蒽溶液, 正常组只加含5%血清的培养液, 每组6复孔, 作用24 h后, 每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1, 即0.5% MTT), 继续培养4 h.然后吸出上清, 每孔加入150 μL二甲基亚砜, 置摇床上低速振荡10 min, 使结晶物充分溶解, 在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值.
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式中, η为RAW264.7细胞的相对活力, A1处理组OD490的吸光值, A2为对照组OD490的吸光值.
2.2.4 乳酸脱氢酶(LDH)的检测染毒24 h后, 收集细胞培养液, 按试剂盒说明书进行操作, 最后在酶标仪440 nmol·L-1波长下检测各孔吸光值.
2.2.5 SOD活力及脂质过氧化产物MDA含量的测定将对数期的细胞以105个·mL-1的密度接种到12孔板(1 mL·孔-1), 苯并[b]荧蒽作用24 h后, 收集细胞, 用预冷的PBS洗涤3遍, 用细胞破碎仪冰浴匀浆, 匀浆液4 ℃, 3000 r·min-1离心20 min, 取上清作为待测样品, 按照试剂盒说明进行操作, 并用酶标仪测量其吸光值, 计算出SOD活力和MDA含量.
2.2.6 活性氧自由基ROS测定将对数期的细胞以105个·mL-1的密度接种到24孔板(0.5 mL·孔-1), 染毒24 h, 移除细胞培养液, 加入按照1:1000用无血清培养液配置好的浓度为10 μmol·L-1的DCFH-DA探针, 37 ℃细胞培养箱内孵育30 min.用无血清细胞培养液快速洗涤细胞3次, 以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA探针, 用酶标仪检测荧光强度, 根据荧光强度确定细胞内ROS水平.
2.2.7 ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的变化将RAW264.7细胞按1×105 个·mL-1的密度接种于24孔板中, 待细胞长至80%左右, 使用不同浓度苯并[b]荧蒽染毒 24 h, 用无菌管收集细胞培养液, 3000 rpm离心20 min, 吸取上清, 利用ELISA试剂盒, 按照包被, 加样, 加酶标抗体, 加底物液显色, 终止反应, 结果判定这几个步骤进行实验, 检测各炎性因子的变化.
2.2.8 巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的测定购买invitrogen公司货号为E2861的FITC标记的大肠杆菌, 共10 mg, 称取1 mg溶在1 mL灭菌PBS中, 使E.coli密度为3×108 个·mL-1, 放在-20 ℃保存.将处于对数期的RAW264.7细胞稀释成1.5×105 个·mL-1, 接种于24孔板中(1 mL·孔-1), 细胞贴壁后, 加入苯并[b]荧蒽作用24 h后, 每孔加5 μL配置好的大肠杆菌, 使它与细胞数量比为10:1, 作用1 h后, 用PBS洗涤3次, 洗掉未被吞噬的大肠杆菌, 然后用荧光显微镜在20倍镜下拍摄明场和荧光图, 通过相同细胞数目下的荧光强度判断被细胞吞入的大肠杆菌的量.
2.3 统计方法实验数据以平均值±标准误差(Mean±SD)表示, 用GraphPad Prism 5软件进行数据统计分析, 采用student t-test检验, 进行处理组和正常组的比较, p＜0.05表示差异有显著性.
3 结果(Results) 3.1 苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞增殖活力的影响结果如表 1所示, 与正常组相比, 10 nmol·L-1浓度的苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞的增殖活力无影响(p＞0.05) , 30、50和80 nmol·L-1的苯并[b]荧蒽能显著抑制RAW264.7细胞的增殖活力(p＜0.05) , 且呈剂量效应关系, 抑制率分别为22.8%、38.4%和43.1%.该结果表明苯并[b]荧蒽能抑制巨噬细胞RAW264.7的增殖活力.
| 表 1 苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞增殖活力的影响 Table 1 Effects of different concentrations of benzo[b]fluoranthene on the viability of RAW264.7 cells |
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乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶, 细胞凋亡或坏死时, 细胞膜结构遭到破坏, 细胞浆内的乳酸脱氢酶会释放到培养液中, 因此乳酸脱氢酶的释放量能够反映细胞毒性.结果如图 1所示, 染毒24 h后, 与正常组相比, 细胞培养液中乳酸脱氢酶的量随着苯并[b]荧蒽浓度的升高逐渐增加, 50 nmol·L-1和80 nmol·L-1有统计学差异(p＜0.05) .结果表明, 苯并[b]荧蒽对细胞具有毒性作用, 且LDH的释放量与细胞增殖活力相关.
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| 图 1 苯并[b]荧蒽对乳酸脱氢酶释放量的影响(与对照组相比, *p ＜0.05) Fig. 1 Effects of Benzo[b]Fluoranthene on the release of LDH(Compared to the control, *p ＜0.05) |
结果如图 2所示, 随着苯并[b]荧蒽浓度的增加, RAW264.7细胞内的SOD活力升高, MDA含量也呈现增加的趋势.与正常组相比, 10 nmol·L-1浓度组的抗氧化酶SOD活力和脂质过氧化产物MDA含量无显著变化, 30、50和80 nmol·L-1浓度组的SOD活力和MDA含量均显著上升(p＜0.05) .
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| 图 2 苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞MDA含量和SOD活力的影响(与对照组相比, *p ＜0.05, **p ＜0.01) Fig. 2 Effect of Benzo[b]fluoranthene on the MDA content and SOD activity of RAW264.7 cells.(Compared to the control, *p ＜0.05, **p ＜0.01) |
酶联免疫实验结果如图 3所示: 与正常组相比, 细胞培养液上清中炎症因子IL-6和IL-1β的分泌量在低浓度下(10 nmol·L-1和30 nmol·L-1)无显著变化, 在高浓度下(50 nmol·L-1和80 nmol·L-1)有显著的增加(p＜0.05) .而TNF-α的分泌量在30 nmol·L-1和50 nmol·L-1浓度下有显著性增加(p＜0.05) , 在80 nmol·L-1的浓度下无显著性变化.
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| 图 3 苯并[b]荧蒽对炎症因子释放量的影响(与对照组相比, *p ＜0.05, **p ＜0.01) Fig. 3 Effect of benzo[b]fluoranthene on the release of inflammatory cytokines(Compared to the control, *p ＜0.05, **p ＜0.01) |
苯并[b]荧蒽作用24 h后, 由图 4可知, 与正常组相比, 随着苯并[b]荧蒽浓度的增加, 相同数量的细胞区域的荧光强度减弱, 说明被细胞吞噬的大肠杆菌(E.coli)数量减少, 吞噬能力下降.表明苯并[b]荧蒽损害了巨噬细胞的吞噬功能.
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| 图 4 苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞吞噬能力的影响(20倍镜拍摄)(注：a和d为空白对照组, b和e为50 nmol·L-1浓度组, c和f为80 nmol·L-1浓度组) Fig. 4 Effect of benzo[b]fluoranthene on the phagocytic ability of RAW264.7 cells(×20) (a and d: control group; b and e: treatment at the dose of 50 nmol·L-1; c and f: treatment at the dose of 80 nmol·L-1) |
流行病学研究表明, 多环芳烃能够损害机体的免疫功能(Wieslaw et al., 2005; 贾旭淑等, 2012), 影响免疫细胞的生物学功能(van Grevenynghe et al., 2003；沈孝兵等, 2005).本研究探讨了多环芳烃对巨噬细胞RAW264.7的毒性作用.研究结果表明, 环境浓度下的苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞具有明显的细胞毒性, 引起氧化损伤和炎症反应, 且对RAW264.7细胞的吞噬功能造成了损伤.
氧化应激是环境污染物毒作用表现的主要特性.活性氧自由基ROS、抗氧化酶SOD活力及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量等指标被用来检测苯并芘对RAW264.7细胞的氧化损伤程度.Palackal等研究发现致癌性多环芳烃能够诱导活性氧自由基(ROS)的形成(Palackal et al., 2001).活性氧自由基是氧化损伤产生的关键因素, 可以引起细胞膜的脂质过氧化(LPO), 产生大量的MDA.MDA能够破坏细胞膜的通透性, 促进有害物质的释放, 因此MDA含量间接反映了细胞受损程度(Geng et al., 2005).超氧化物歧化酶SOD是清除ROS的关键性酶, 其活性大小间接反映其清除活性氧自由基的能力(宋姗娟等, 2013).SOD活力与MDA含量存在一定的相关性, 当氧化损伤程度较低时, 细胞合成分泌更多的SOD以清除自由基, 表现为应激诱导效应；当氧化损伤程度远远超过细胞抗氧化能力时, 表现为抗氧化酶活性的抑制.研究报道一些多环芳烃对SOD活力的影响呈现先诱导后抑制的情况(王淑红等, 2000；杨涛等, 2006).本研究结果显示, 苯并[b]荧蒽在环境浓度下, 能诱导产生活性氧自由基(结果未显示), 引起MDA显著的升高, 抗氧化酶SOD活力也有显著诱导.
巨噬细胞作为免疫细胞, 在受到外界刺激时, 会产生一系列非特异性防御作用, 如释放大量的细胞因子(白介素、TNF-α等), 但在防御过程中, 其本身也会受到损害.细胞因子是可以直接反映炎症效应的重要生物标记, IL-1β是介导炎症反应的一种主要促炎因子, TNF-a是炎症反应中最早和初级内源性介质, IL-6在免疫调剂和炎症反应中具有广泛的生物学活性.有研究显示, 大气颗粒物能够诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-6和TNF-α(Pozzi et al., 2003).本研究结果表明, 低浓度的苯并[b]荧蒽也能够诱导炎症因子IL-6, IL-1β和TNF-α的分泌(见图 3).
巨噬细胞具有很强的吞噬能力, 能吞噬病原微生物, 减少其对生物体的伤害.有报道显示过高浓度的大气细颗粒物可以降低体内、外肺泡巨噬细胞的吞噬功能(Miyata et al., 2011).巨噬细胞吞噬功能与其细胞膜及溶酶体膜的完整性有关.过量的脂质过氧化产物MDA会对细胞膜的通透性造成损害, 增加有害物质乳酸脱氢酶LDH的释放量(见图 1), 其吞噬功能也受到损害(见图 4).已知氧化应激与炎症相关基因的表达之间存在着一定的关联(Becker et al., 2005; Rahman et al., 2000).因此, 苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞的免疫毒性作用, 可能是因为诱导产生氧化应激, 从而引起了炎症因子的释放及吞噬功能的受损.
5 结论(Conclusions)环境浓度下苯并[b]荧蒽对RAW264.7具有一定的细胞毒性, 能够引起细胞产生氧化应激和炎症反应, 且对其吞噬功能造成了损害, 降低了巨噬细胞清除其他病原微生物的能力, 抑制了其免疫功能.其具体的作用机制还需进一步研究.
| [${referVo.labelOrder}] | Al Daghri N M, Al Daghri N M, Alokail M S, et al. 2014. Polycyclic aromatic hydrocarbon distribution in serum of Saudi children using HPLC-FLD:marker elevations in children with asthma[J]. Environmental Science and Pollution Research, 21(20) : 12085–12090. DOI:10.1007/s11356-014-3108-0 |
| [${referVo.labelOrder}] | Becker S, Mundandhara S, Devlin R B, et al. 2005. Regulation of cytokine production in human alveolar macrophages and airway epithelial cells in response to ambient air pollution particles:further mechanistic studies[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 207(2) : 269–275. DOI:10.1016/j.taap.2005.01.023 |
| [${referVo.labelOrder}] | Burchiel S W, Luster M I. 2001. Signaling by environmental polycyclic aromatic hydrocarbons in human lymphocytes[J]. Clinical Immunology, 98(1) : 2–10. DOI:10.1006/clim.2000.4934 |
| [${referVo.labelOrder}] | Brandt H C A, Watson W P. 2003. Monitoring human occupational and environmental exposures to polycyclic aromatic compounds[J]. Annals of Occupational Hygiene, 47(5) : 349–378. |
| [${referVo.labelOrder}] | Castaño-Vinyals C, D'errico A, Malats N, et al. 2004. Biomarkers of exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons from environment air pollution[J]. Occupational and Environmental Medicine, 61(4) : e12. DOI:10.1136/oem.2003.008375 |
| [${referVo.labelOrder}] | Geng H, Meng Z, Zhang Q. 2005. Effects of blowing sand fine particles on plasma membrane permeability and fluidity, and intracellular calcium levels of rat alveolar macrophages[J]. Toxicology Letters, 157(2) : 129–137. DOI:10.1016/j.toxlet.2005.01.010 |
| [${referVo.labelOrder}] | 贾旭淑, 宋超, 陈家长. 2012. 苯并芘对鱼类免疫毒性作用的研究进展[J]. 中国农学通报, 2012, 28(23) : 98–103. |
| [${referVo.labelOrder}] | Liu A L, Lu W Q, Wang Z Z, et al. 2006. Elevated levels of urinary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, lymphocytic micronuclei, and serum glutathione S-transferase in workers exposed to coke oven emissions[J]. Environmental Health Perspectives, 114(5) : 673–677. |
| [${referVo.labelOrder}] | 麦碧娴, 林峥, 张干, 等. 2000. 珠江三角洲河流和珠江口表层沉积物中有机污染物研究:多环芳烃和有机氯农药的分布及特征[J]. 环境科学学报, 2000, 20(2) : 192–198. |
| [${referVo.labelOrder}] | Miyata R, Eeden S F V. 2011. The innate and adaptive immune response induced by alveolar macrophages exposed to ambient particulate matter[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 257(2) : 2092–2122. |
| [${referVo.labelOrder}] | 牛红云, 蔡亚岐, 魏复盛, 等. 2006. 多环芳烃暴露的生物标志物——尿中羟基多环芳烃[J]. 化学进展, 2006, 18(10) : 1381–1390. |
| [${referVo.labelOrder}] | Oostingh G J, Smith K E, Tischler U, et al. 2015. Differential immunomodulatory responses to nine polycyclic aromatic hydrocarbons applied by passive dosing[J]. Toxicology In Vitro, 29(2) : 345–351. DOI:10.1016/j.tiv.2014.11.007 |
| [${referVo.labelOrder}] | Palackal N T, Lee S H, Harvey R G. 2002. Activation of polycyclic aromatic hydrocarbontrans-dihydrodiol proximate carcinogens by human aldo-keto reductase (AKR1C) enzymes and their functional overexpression in human lung carcinoma (A549) cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 277(27) : 24799–24808. DOI:10.1074/jbc.M112424200 |
| [${referVo.labelOrder}] | Pozzi R, De Berardis B, Paoletti L, et al. 2003. Inflammatory mediators induced by coarse (PM2.5/10) and fine (PM2.5) urban air particles in RAW 264.7 cells[J]. Toxicology, 183(1/3) : 243–254. |
| [${referVo.labelOrder}] | Rahman I, MacNee W. 2000. Oxidative stress and regulation of glutathione in lung inflammation[J]. European Respiratory Journal, 16(3) : 534–554. DOI:10.1034/j.1399-3003.2000.016003534.x |
| [${referVo.labelOrder}] | 沈孝兵, 浦跃朴, 王志浩, 等. 2005. 烹调油烟对暴露人群的免疫损伤作用[J]. 环境与职业医学, 2005, 22(1) : 17–19. |
| [${referVo.labelOrder}] | 宋姗娟, 魏海英, 刘婷, 等. 2013. 菲对肺泡巨噬细胞的毒性作用[J]. 环境化学, 2013, 33(4) : 551–555. |
| [${referVo.labelOrder}] | Tsai W T, Mi H H, Chang Y M, et al. 2007. Polycyclic Aromatic hydrocarbons(PAHs) in bio-crudes from induction-heating pyrolys is of biomass wastes[J]. Bioresource Technology, 98(5) : 1133–1137. DOI:10.1016/j.biortech.2006.04.007 |
| [${referVo.labelOrder}] | van Grevenynghe J, Rion S, Le Ferrec E, et al. 2003. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Inhibit Differentiation of Human Monocytes into Macrophages[J]. The Journal of Immunology, 170(5) : 2374–2381. DOI:10.4049/jimmunol.170.5.2374 |
| [${referVo.labelOrder}] | Wang H, Chen W, Zheng H, et al. 2007. Association between plasma BPDE-Alb adduct concentrations and DNA damage of peripheral blood lymphocytes among coke oven workers[J]. Occupational and Environmental Medicine, 64(11) : 753–758. DOI:10.1136/oem.2006.030445 |
| [${referVo.labelOrder}] | 王淑红, 王新红, 陈荣, 等. 2000. 荧蒽、菲、芘对菲律宾蛤仔超氧化物歧化酶的影响[J]. 厦门大学学报:自然科学版, 2000, 39(4) : 504–509. |
| [${referVo.labelOrder}] | Wieslaw J, Aleksander G, Agnieska P, et al. 2005. Prenatal ambient air exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons and the occurrence of respiratory symptoms over the first year of life European[J]. Journal of Epidemiology, 20(9) : 775–782. |
| [${referVo.labelOrder}] | 吴明红, 陈镠璐, 陈祖怡, 等. 2014. 多环芳烃在上海近郊大气颗粒物PM2.5和PM10中的污染特征、来源及其健康风险评估[J]. 上海大学学报, 2014, 20(4) : 521–530. |
| [${referVo.labelOrder}] | 杨涛, 陈海刚, 蔡文贵, 等. 2011. 菲和苯并(b)荧蒽曝露对翡翠贻贝外套膜的氧化胁迫及损伤[J]. 南方水产科学, 2011, 7(4) : 24–29. |
| [${referVo.labelOrder}] | 岳强, 王德超, 于志强, 等. 2009. 我国南方某市部分中学生多环芳烃内暴露水平研究[J]. 环境与健康杂志, 2009, 26(5) : 385–387. |