1 引言(Introduction)

异养硝化和好氧反硝化是目前生物脱氮研究的热点.异养硝化是微生物在利用有机底物的同时将铵态氮转化为羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的过程(Schmidt et al., 2003).好氧反硝化是微生物在好氧条件下以有机物为电子供体，利用氧和硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，将硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮气和气态氮化物的过程(Bernat et al., 2007).Robertson等(1983) 在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha，该菌株同时具有好氧反硝化能力和异养硝化能力，因此，也是首个分离出的异养硝化-好氧反硝化菌.随后越来越多的异养硝化-好氧反硝化菌被发现，主要包括泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)(Robertson et al., 1988；Third et al., 2005)、产碱菌属(Alcaligenes) (Gupta et al., 2000；Joo et al., 2005)、假单胞菌属(Pseudomonas) (Wan et al., 2011；赵丹等，2013)、芽孢杆菌(Bacillus)(尹明锐等，2010)、不动杆菌(Acinetobacter) (Pedersen et al., 1999；宋宇杰等，2013)等.异养硝化好氧反硝化使得硝化-反硝化反应能在同一个反应器中进行，相较于传统生物脱氮具有大大降低基建投资和运行费用及高效脱氮等诸多优点(Joo et al., 2006；信欣等，2014).目前，国内外对异养硝化-好氧反硝化菌的研究尚处于实验室阶段，实际应用的研究较少(Xiao et al., 2011；Kulkarni, 2012；Yao et al., 2013)，因此，对异养硝化-好氧反硝化菌进行研究，对未来生物脱氮的应用具有重要意义.

近年来对异养硝化-好氧反硝化菌报道的文献越来越多，异养硝化-好氧反硝化菌逐渐成为研究热点.本研究从长期施用农家肥的土壤中筛选出一株能高效去除氨氮、亚硝态氮和硝态氮的菌株SQ2，鉴定为一株异养硝化-好氧反硝化细菌，比较和分析菌株SQ2对氨氮、亚硝态氮和硝态氮去除特性，考察菌株异养硝化的最适条件和耐高氨氮特性，并研究菌株实际处理高氨氮猪场废水的情况，以期为生物脱氮提供良好的菌源，并为该菌种在今后的研究和应用中提供实验基础和理论支持.

2 材料与方法(Material and methods) 2.1 材料

培养基：①异养硝化培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.47 g，琥珀酸钠8.0 g，维氏盐溶液50 mL，H₂O 950 mL，pH 7.5；②亚硝酸盐培养基：NaNO₂ 0.49 g，琥珀酸钠8.0 g，维氏盐溶液50 mL，H₂O 950 mL，pH 7.5；③硝酸盐培养基：NaNO₃ 0.61 g，琥珀酸钠8.0 g，维氏盐溶液50 mL，H₂O 950 mL，pH 7.5；④维氏盐溶液：K₂HPO₄5.0 g，MgSO₄·7H₂O 2.5 g，NaCl 2.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.05 g，MnSO₄·4H₂O 0.05 g，H₂O 1000 mL.

2.2 实验方法 2.2.1 异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选

从长期施用农家肥的农田土壤取样，取1 g样品接种于装有100 mL灭菌后的异养硝化培养基的250 mL三角瓶中，充分摇匀，28 ℃、180 r·min^-1条件下培养，2 d后取5 mL重新接种至新鲜培养基，如此连续富集培养5次.富集液经10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7梯度稀释后分别涂布于平板培养后，挑取不同单菌落进行分离纯化，再分别接种至异养硝化液体培养基，28 ℃、180 r·min^-1条件下培养2 d.通过观察加入纳氏试剂的颜色变化，定性检测培养液中氨氮浓度的变化，完成初筛.

将初筛得到的菌株接种至异养硝化培养基、亚硝酸盐反硝化培养基和硝酸盐反硝化培养基培养2 d，分别定量检测氨氮、亚硝态氮和硝态氮的变化，选取对3种氮源均有较好脱氮效果的菌株为目的菌株，接种至斜面，4 ℃冰箱保藏.

2.2.2 菌株的鉴定

将目的菌株平板划线活化后，稀释涂布至异养硝化培养基平板，观察描述菌落形态特征；对目的菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细胞形态；利用DNA提取试剂盒提取细菌DNA，PCR反应体系的组成为：DNA template 1 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL，Primer F 2 μL，Primer R 2 μL，加Sterilized ddH₂O至终体积为50 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，初步检验扩增产物的生成，并将成功的扩增产物送至上海生工生物技术服务有限公司进行测序，测序结果提交GenBank获得登录号，在NCBI里对序列进行Blast分析，然后通过MEGA5软件用NJ法构建进化树.

2.2.3 菌株脱氮特性研究

种子液的制备：挑取单菌落分别接种于异养硝化培养基、亚硝酸盐反硝化培养基和硝酸盐反硝化培养基，28 ℃、180 r·min^-1条件下培养1 d，制得相应种子液用于后续实验.

菌株异养硝化和好氧反硝化特性研究：将上述制备的种子液按1%接种量分别接入200 mL异养硝化培养基、200 mL亚硝酸盐反硝化培养基和200 mL硝酸盐反硝化培养基(500 mL锥形瓶)中，28 ℃、180 r·min^-1条件下摇床培养，每间隔一段时间检测pH、OD₆₀₀、COD和氮浓度变化.

不同反应条件对菌株异养硝化的影响：研究了C/N、pH、接种量、碳源、温度和转速对菌株氨氮去除效果的影响.各单因素影响实验中，C/N分别为1、4、8、12、16、20和30；pH分别为3、5、7、9和11；接种量分别为1%、3%、5%、7%和10%；碳源包括葡萄糖、蔗糖、琥珀酸钠、柠檬酸钠和乙酸钠；温度分别为8、18、28、35、40和45 ℃；转速分别设为60、100、140、180和220 r·min^-1.固定单一影响因子，其余条件分别为温度28 ℃、pH=7、转速180 r·min^-1、C/N=12、接种量5%，碳源为琥珀酸钠.各培养基均为100 mL, 分装于250 mL锥形瓶中，经115 ℃、30 min高压灭菌.其中，培养液氨氮浓度均设为100 mg·L^-1.摇床培养12 h，测定OD₆₀₀、氨氮和总氮浓度变化.

菌株耐高氨氮特性研究：控制C/N=12，氨氮浓度分别设为100、400、800、1200和1400 mg·L^-1，以5%接种量接入种子液，28 ℃、180 r·min^-1条件下摇床培养，每隔一段时间测定OD₆₀₀、氨氮和总氮浓度的变化.

菌株对实际高氨氮猪场废水的处理：以5%的接种量将种子液接种至猪场废水，28 ℃、180 r·min^-1条件下摇床培养5 d，测定氨氮、亚硝态氮、总氮及总磷的变化.

2.3 水质检测方法及数据处理

NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法测定；NO^-₂-N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定；NO₃^--N采用紫外分光光度法测定；NH₂OH采用偶联反应光度法测定；TN采用碱性过硫酸钾紫外分光光度法测定；OD₆₀₀用721可见分光光度计在光密度为600 nm处测定吸光度值.去除率η、去除速率R(mg·L^-1·h^-1)计算公式如下：

(1)

(2)

式中，C₁表示t₁时刻的相应氮源浓度(mg·L^-1)，C₂表示t₂时刻的相应氮源浓度(mg·L^-1).每组实验设3组平行，采用Excel和Origin8.0软件对实验结果进行统计分析与绘图.

3 结果与分析 (Results and analysis) 3.1 菌株的筛选与鉴定

经富集和初筛，初步获得11株脱氨氮能力较好的菌株，经复筛得到1株高效去除氨氮、硝态氮和亚硝态氮的菌株，编号为SQ2.如图 1所示，菌株SQ2在异养硝化培养基上菌落为黄白色，边缘整齐，圆形隆起，表面湿润、光滑，不透明.菌株为革兰氏阴性菌，短杆状，大小为(0.5~0.8) μm×(1.1~1.5) μm.

对菌株SQ2进行测序，得到长度为1398 bp的16S rRNA序列，在GenBank登录号为KU519421.NCBI数据库中Blast检索显示，菌株SQ2序列与GenBank中已知报道的多株Acinetobacter sp．相似性为100%，结合形态学特征，鉴定菌株SQ2为不动杆菌Acinetobacter sp．.应用 MEGA5软件采用NJ法构建系统发育树，结果如图 2所示.

3.2 菌株SQ2异养硝化和好氧反硝化特性

如图 3a所示，异养硝化培养基体系中，菌株SQ2在第4 h进入对数生长期，18 h时达到最大生长吸光度(OD₆₀₀)2.151.在菌体增殖过程中，氨氮和总氮浓度下降迅速，14 h内菌株对氨氮、总氮的去除率分别达到100%和92.5%，平均氨氮降解速率为7.21 mg·L^-1·h^-1，最大氨氮降解速率出现在8~10 h时，达到了11.96 mg·L^-1·h^-1，均高于菌株YL(梁贤等，2015).18 h时COD降至最低，由3150 mg·L^-1降至60.2 mg·L^-1，平均去除速率为171.7 mg·L^-1·h^-1.反应过程中有较明显的羟胺转化，10 h时NH₂OH浓度达到最大，积累量为1.25 mg·L^-1, 此后逐渐降低，并没有检测到硝态氮和亚硝态氮的产生.反应20 h后体系中氨氮、总氮及COD值逐渐上升，说明此时菌群开始进入内源呼吸期，菌体细胞内源氮分解成的氨氮及内部有机物等还原性物质被释放而逐渐在水中积累.过程中pH逐渐升高，由7.50升至9.61.菌株通过自身生长合成所同化的氨氮达到了总去除氨氮的66.8%，而其余氨氮则部分转化为气态氮脱离反应体系，部分被转化为其它含氮物质存在于溶液中.

如图 3b所示，以亚硝酸钠为氮源的好氧反硝化体系中，菌体第6 h进入对数生长期，20 h时达到最大生长吸光度1.938，亚硝态氮和总氮随菌体生长迅速下降，18 h内亚硝态氮和总氮去除率分别为99.6%和81.2%，平均亚硝氮去除速率为5.57 mg·L^-1·h^-1，最大速率出现在12~14 h，为 11.25 mg·L^-1·h^-1.20 h时COD降至最低，由3331 mg·L^-1降至135.4 mg·L^-1，平均去除速率为159.8 mg·L^-1·h^-1.一般高的亚硝酸盐浓度会对菌株产生毒性，抑制菌株的生长和代谢.何腾霞等研究的亚硝酸盐型反硝化细菌Pseudomonas tolaasii Y-12(何腾霞等, 2015a)和Pseudomonas putida Y-11(何腾霞等, 2015b)对高浓度的亚硝氮具有一定的耐受性，但在100 mg·L^-1的NO^-₂-N浓度下，NO^-₂-N和TN脱除率均在40%左右，菌株SQ2较之表现出了更好的耐受性和脱氮能力，显示了良好的环境适应能力及在治理亚硝酸盐水体污染方面的应用潜力.

如图 3c所示，以硝酸钠为氮源的好氧反硝化体系中，菌体在第6 h进入对数生长期，18 h达到最大生长吸光度1.962.硝态氮和总氮随菌体增殖迅速下降，18 h时硝态氮和总氮去除率分别为96.9%和78.1%，平均硝氮去除速率为5.48 mg·L^-1·h^-1，最大硝氮去除速率出现在12~14 h，为11.50 mg·L^-1·h^-1，过程中有亚硝态氮的少量积累，10 h时积累量最大为0.93 mg·L^-1，这不同于菌株LD3(王有乐等，2011)好氧反硝化过程中有大量亚硝态氮的积累.这是由于菌株SQ2亚硝酸盐还原酶和硝酸盐还原酶同时存在，且均具有较高的活性，反硝化过程中产生的亚硝态氮在高活性亚硝酸盐还原酶作用下被迅速还原所致.20 h时COD降至最低，由3354 mg·L^-1降至225.7 mg·L^-1，平均去除速率为156.4 mg·L^-1·h^-1.整个过程中，硝态氮和亚硝态氮反硝化体系pH均逐渐上升，由7.50分别升至9.78和9.76，在20 h后均检测到氨氮的产生，说明菌体在利用硝态氮或亚硝态氮为氮源生长合成细胞内源氮后，菌体进入内源期后部分内源氮被转化成氨氮进入水体.张培玉等(2010) 认为，菌株qy37的NO^-₂-N代谢途径中发生了同化性亚硝酸盐还原作用, 将NO^-₂-N逆向生成NH₂OH再转化为氨氮供菌体利用.反硝化体系中并没有检测到NH₂OH的产生，而是菌体在内源期产生的有机氮直接被氧化分解，即通过氨化作用转化成为氨氮从而导致水体中氨氮的产生.

比较可知，菌株SQ2在反应体系中对氮源的降解及COD的去除均具有良好的效果，而异养硝化体系能够将氨氮完全降解，且在氮源降解速率、COD去除速率及菌株生长量等方面优于好氧反硝化体系.亚硝酸盐对菌株SQ2的生长和脱氮等并没有明显的抑制作用，与菌株对硝酸盐的利用相似.

3.3 不同条件对菌株SQ2异养硝化的影响

如图 4a所示，碳氮比(C/N)对菌株异养硝化影响明显.随碳氮比增大，OD₆₀₀值增大，且脱氮效果变好，说明适当提高碳氮比能够促进菌株的生长和脱氮.碳氮比为12时，氨氮完全降解，OD₆₀₀和总氮去除率分别达到1.731和92.1%.当碳氮比达到30时，OD₆₀₀下降明显，氨氮和总氮去除率分别下降至96.9%和72.1%.因此，充足的碳源能够保证异养硝化的进行，而较高的碳氮比使得碳源量过高，部分有机物会直接嵌入酶结构而影响酶活性(宋宇杰等，2013)，抑制菌株的生长和硝化反应.因此，菌株生长和脱氮的最佳碳氮比为12.

pH为7和9时，对应的OD₆₀₀值分别为1.686和1.734，氨氮均完全降解，总氮去除率分别为81.7%和83.2%(图 4b).说明在中性和弱碱性条件下，菌株有着良好的生长和脱氮效果.在偏酸(pH为5) 条件下和碱性(pH为11) 条件下，氨氮去除率分别降至80.5%和52.2%，OD₆₀₀分别为1.452和0.408；在pH为3时几乎不生长.因此, 菌株能够耐受的pH范围为5~11，最佳pH为7~9，相比菌株GL19(王兆阳等，2014)的pH耐受范围(6~10) 更广.

接种量不足达不到脱氨氮的作用，接种量过大会引起生物竞争营养物而致使部分细菌死亡，适量的接种对提高脱氮效果及实际应用有重要意义.如图 4c所示，随着接种量的增加，OD₆₀₀、氨氮和总氮去除率增加，在接种量为5%和10%时，氨氮均完全降解，总氮去除率分别达到92.3%和91.2%.因此，接种量以5%最适.

碳源为琥珀酸钠、柠檬酸钠和乙酸钠时，氨氮去除率均高于90%，总氮去除率均高于85%，其中，碳源为琥珀酸钠时，OD₆₀₀为最大1.590，氨氮完全降解，总氮去除率达到87.8%(图 4d).碳源为葡萄糖时，菌株的生长和脱氮效果远低于上述3种碳源，OD₆₀₀仅为0.591，氨氮和总氮去除率分别仅为51.7%和31.2%，而碳源为蔗糖时，菌株几乎不生长.与菌株XS76(吴建江等，2013)相同，琥珀酸钠是菌株生长和脱氮的最佳碳源，并且相较于葡萄糖等常用糖类，有机酸更利于菌株的生长和脱氮.

由图 4e可知，随着温度的升高，菌株OD₆₀₀、氨氮和总氮去除率均明显升高，温度为28 ℃时，氨氮完全降解，总氮去除率为85.6%，OD₆₀₀为1.722.再升高温度时，菌株OD₆₀₀、氨氮和总氮去除率均有所下降，说明高温对菌株的生长和脱氮有所抑制，可能是由于高温条件下，微生物体内酶等活性物质变性，部分细胞各项功能下降甚至死亡所致.但另一方面，在温度为45 ℃时，菌株仍表现出了很强的生长和脱氮能力，说明菌株具有较强的耐高温能力.由于低温对菌株生长和脱氮影响明显，可对其进行低温驯化，提高其在低温环境下应用的可能性.

当转速为60 r·min^-1时，OD₆₀₀、氨氮和总氮去除率低(图 4f)，这是由于菌株SQ2为严格好氧型菌，转速太低时，溶解氧不足不利于菌株的生长和脱氮.而随着转速的增加，OD₆₀₀、氨氮和总氮去除率逐渐增加, 当转速为180和220 r·min^-1时氨氮完全降解，OD₆₀₀和总氮去除率相差不大，因此，转速在180~220 r·min^-1间利于菌株的生长和脱氮.

3.4 菌株耐高氨实验及其对实际高氨氮猪场废水的处理

如图 5所示，在氨氮浓度在100~800 mg·L^-1时，其OD₆₀₀随氨氮浓度增加而增大，在800 mg·L^-1的高氨氮浓度环境下，其OD₆₀₀最大，说明菌株SQ2适合在高氨氮环境下生长，氨氮和总氮去除效果良好，分别达到61.6%和46.8%；氨氮浓度为1200和1400 mg·L^-1时，菌株OD₆₀₀减小，说明在此高氨氮条件下菌株的生长受到抑制，但菌株在1400 mg·L^-1的高氨氮条件下仍能生长良好，氨氮去除率达到38.6%，在第3 d时OD₆₀₀达到了2.635，而Bacillus methylotrophicus L7 在1121 mg·L^-1的高氨氮条件下最大OD₆₀₀仅为0.644(Zhang et al., 2012).游离态氨氮是氨氮在水中存在形式之一(张亮等，2012).pH 为7时，常温下游离氨氮约占氨氮的1%，一般硝化菌因游离态氨氮的存在会被抑制.根据游离态氨的计算公式(国家环境保护总局，2002)可知，在氨氮高达1400 mg·L^-1的环境下，游离态氨氮浓度已超过对普通硝化菌的抑制浓度，而菌株SQ2能够在此环境条件下生长良好，因此，菌株SQ2具有较强的耐受高氨氮的能力.

如图 6所示，以5%接种量将菌株SQ2接种至实际猪场废水中，28 ℃、180 r·min^-1条件下，废水中氨氮、总氮及总磷浓度下降明显，亚硝态氮也有较明显的去除效果，尤其是氨氮在第5 d时几乎被完全去除.废水中氨氮、亚硝态氮、总氮及总磷浓度在第5 d时由初始的603.24、216.43、844.22、8.04 mg·L^-1分别降至13.45、110.96、225.84、1.19 mg·L^-1去除率分别达到了97.8%、48.7%、73.2%、85.1%.菌株SQ2对高氨氮猪场废水的处理效果明显，说明菌种除具有强的耐受高氨氮能力，对实际高氨氮污水的脱氮亦具有良好效果.生物除磷主要由聚磷菌完成，而聚磷菌除吸收自身生长所需磷元素外，可在好氧摄磷过程超量吸收溶液中的磷酸盐合成聚磷酸盐及糖原等有机颗粒储存在细胞体内(王昶等，2009；孙雪等，2014)，从而降低溶液中磷的含量.对猪场废水的除磷说明菌株SQ2或可作为聚磷菌在生物除磷方面发挥潜在的应用价值.菌株SQ2对猪场废水中亚硝态氮的去除虽然并没有达到浓度更高的氨氮的去除效果，但仍达到了48.7%.实际猪场废水的处理结果表明，菌株SQ2在高氨氮污水和亚硝酸盐污染水质的生物处理方面具有良好的应用前景.

此外，菌株SQ2能够优先利用废水中的氨氮，这与菌株YN-05相似(周迎芹等，2013).相较于上述耐高氨氮实验组，废水中亚硝酸盐的存在，可能促进了菌株对氨氮的去除，使得水中高氨氮几乎完全脱除.这与菌株X3 (孙雪梅等，2012)和菌株qy37(张培玉等，2010)在有亚硝酸盐存在时能够促进氨氮降解，提高系统的脱氮效果类似.但Robertson等(1989) 曾提出当系统内同时存在氨氮和亚硝态氮时，菌体会优先选择亚硝酸盐进行反硝化；以及亚硝酸盐的加入会抑制异养硝化作用(Robertson et al., 1989).因此，可以在后续实验中研究混合系统内菌株SQ2的脱氮特性，为其在实际应用中提供更多理论支持.

4 结论 (Conclusions)

1) 从长期施用农家肥的土壤中筛得1株异养硝化-好氧反硝化菌SQ2，鉴定为不动杆菌Acinetobacter sp．

2) 在180 r·min^-1、28 ℃好氧条件下, 菌株SQ2对氨氮、亚硝态氮和硝态氮的去除率分别达到100%、99.6%和96.9%，异养硝化体系在氮源降解、COD去除及菌株生长量方面均优于好氧反硝化体系.

3) 菌株SQ2异养硝化最适条件为：碳氮比为12, pH为7~9, 接种量为5%, 碳源为琥珀酸钠, 温度为28℃, 转速为180~220 r·min^-1.

4) 菌株SQ2在800 mg·L^-1高氨氮条件下生长最好，在1400 mg·L^-1高氨氮条件下具有良好的生长和脱氮能力；菌株SQ2对实际高氨氮猪场废水的处理效果良好，在高氨氮污水和亚硝酸盐污染水质的生物处理方面具有良好的应用前景.