1 引言(Introduction)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是具有两个或两个以上苯环结构的一类持久性有机污染物, 主要由生物物质及化石燃料的不完全燃烧形成, 排放到大气中的PAHs 90%以上通过大气沉降等途径进入土壤, 使土壤成为环境中 PAHs 的主要储存库(Nelson, 1983).PAHs具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应, 可通过生物吸收及食物链等途径进入动植物体内, 对生态环境和人体健康造成危害(Hariraish, 2009；岳敏等, 2003), 其中4环及4环以上的高环芳烃(High molecular weight-PAHs, HMW-PAHs)由于疏水性强、脂溶性高等特点, 加大了污染土壤中HMW-PAHs的修复难度, 对环境及人体健康存在更大风险.

目前, 微生物修复是去除土壤中PAHs的主要途径之一(郑乐等, 2007；Tian et al., 2008), 具有成本低廉、效率高、无二次污染等优点.然而苏丹等(2006) 研究认为, 游离微生物可能由于与土著微生物的恶性竞争、抗毒能力差或单位土壤体积内有效降解菌浓度低不能被很好地应用于原位PAHs污染土壤的修复, 而微生物经固定化后可以克服这些弊端.微生物固定化是将游离的微生物或酶限定于特定空间区域内, 保持微生物活性、提高单位体积微生物浓度且可以重复使用(王建龙, 2002；武淑文, 2003).在固定化微生物技术中不同材料的选择对微生物的固化及PAHs降解有较为重要的影响.目前应用于土壤中PAHs修复的固定化材料大多以聚乙烯醇、海藻酸钠和活性炭为主, 且在降解PAHs性能上表现较佳(王新等, 2008；元妙新, 2011；Wang et al., 2007), 但普遍存在以下不足：①载体价格较高；②对微生物有毒害作用；③易产生二次污染, 需进行后续处理；④制作工艺繁琐.因此, 寻求经济环保、性能优良的固定化载体材料势在必行.而天然材料经济无毒, 本身可被生物降解, 且能够克服现阶段载体材料的缺点.我国天然植物废料资源尤其丰富, 如果任意弃置将导致环境污染和资源浪费, 而将常见的农业废弃物(如粮食作物秸秆、蔬菜作物秸秆等)作为载体材料用于固定化微生物修复土壤PAHs, 不仅可变废为宝, 成为修复土壤PAHs的良好材料, 而且可以提高土壤有机质, 改良土壤.目前有不少学者利用天然材料固化微生物对土壤PAHs的降解进行了研究, 主要集中在玉米秸秆上较多(李婧, 2012), 而对于不同秸秆材料固化微生物在降解土壤PAHs性能的差异性研究上开展工作尚少, 尤其蔬菜秸秆的研究较为缺乏.因此, 比较不同载体材料固化微生物对土壤PAHs的降解特性, 从而筛选出适宜的载体材料, 对于修复PAHs污染土壤具有重要的意义.本研究以河北某典型煤矿区周边的农田 PAHs污染土壤为研究对象, 以课题组前期筛选的Fusarium.sp(ZH-H2) 为 HMW-PAHs降解菌, 并选择玉米秸秆、黄瓜秸秆、番茄秸秆3种农业废弃物为该菌的固定化载体材料, 研究不同载体材料固定化ZH-H2对该区土壤10种HMW-PAHs修复效果的影响, 并分析3种土壤酶活性的变化规律, 为进一步开展原位土壤HMW-PAHs的修复提供理论依据, 同时为农作物秸秆的资源化利用提供渠道.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料

供试土壤：2014年8月于河北省某典型煤矿区采集受HMW-PAHs长期污染的农田表层土壤(0~10 cm), 布袋封装, 带回实验室, 进行自然避光风干, 研磨, 过1 mm筛, 在4 ℃冰箱内冷藏备用.土壤类型为褐土, 质地为壤土.土壤基本性质见表 1, 16种PAHs总量为4437.82 μg·kg^-1, 10种HMW-PAHs总含量为3330.82 μg·kg^-1, 荧蒽(Flt)、芘(Pyr)、苯并(a)蒽(BaA)、(Chry)、苯并(b)荧蒽(BbF)、苯并(k)荧蒽(BkF)、苯并(a)芘(BaP)、二苯并(a, h)蒽(DbA)、苯并(ghi)苝(BghiP)、茚苯(1, 2, 3-cd)芘(InP)的含量分别为485.51、395.45、230.27、399.68、607.65、209.97、266.49、60.55、352.73、322.52 μg·kg^-1, 单体HMW-PAH占10种HMW-PAHs总量质量分数如图 1所示.

供试菌种：本课题组前期在该区农田土壤中筛选的高环芳烃高效降解菌：镰刀菌属真菌(Fusarium sp.), 命名ZH-H2.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 保藏号：CGMCC No.9316.

供试秸秆材料：2014年9月于河北省保定市三分厂采集玉米秸秆, 于廊坊永清蔬菜基地采集黄瓜和番茄秸秆, 洗净秸秆, 105 ℃烘箱中杀青30 min, 然后60 ℃烘干, 粉碎过1 mm筛, 并分别与草炭土按质量比1:2混合均匀, 121 ℃灭菌20 min, 制成3种秸秆载体材料备用.

2.2 试验方法

菌液制备：从斜面挑取1株Fusarium.sp 接入高氏一号固体培养基的培养皿中, 培养皿用封口膜封口, 倒放培养皿, 在30 ℃恒温培养箱中培养7 d.然后在无菌状态下的超净台里用1 mL移液枪吸无菌水反复冲洗吹打ZH-H2菌落, 菌液经过灭菌的4层纱布过滤后, 得到孢子悬浮液, 漩涡震荡, 使孢子在水溶液中分布均匀, 再用血球计数板测定孢子的数量, 孢子的数量为1.25×10⁷ cfu·mL^-1, 作为原液备用.

固定化ZH-H2载体材料制备：分别称取1.1节中制备的3种秸秆材料90 g放入500 mL锥形瓶, 每种材料重复3次, 共9瓶.于121 ℃高温高压灭菌20 min, 降温后分别加入5 mL上述菌液, 并适当补充无菌水, 在30 ℃、150 r·min^-1摇床条件下培养3 h, 即得到固定化ZH-H2的3种载体材料, 用于土壤培养试验.

土培试验方案：试验用塑料盆钵, 盆钵上缘直径 13 cm, 底面直径 9 cm, 高 11 cm.土培试验处理见表 2.试验设置3个处理, 每个处理3个重复, 共计18个盆钵.取210 g风干土放入每个盆钵中, 依据表 2处理设置按3:7质量比向土壤中添加3种灭菌载体材料和3种固定化ZH-H2载体材料, 充分混合后, 调节水分含量为田间持水量的60%, 将盆钵置于30 ℃恒温培养箱中培养.每2 d补水1次, 60 d后采集土壤样品.将每盆土壤混合均匀后采用四分法分取样品, 1/2部分土壤样品过1 mm筛, 密封, 置于4 ℃冰箱中保存, 用于测定PAHs的残留量；1/2部分自然阴干, 过1 mm筛, 用于测定土壤酶活性(实验布置时间：2014年9月；土壤样品采集时间：2014年11月).

2.3 样品的测定指标及方法

土壤基本理化性质：采用土壤农化常规分析法(鲍士旦, 2000).

土壤PAHs测定指标： 10种PAHs, 分别为荧蒽(Flt)、芘(Pyr)、苯并(a)蒽(BaA)、(Chry)、苯并(b)荧蒽(BbF)、苯并(k)荧蒽(BkF)、苯并(a)芘(BaP)、二苯并(a, h)蒽(DbA)、苯并(ghi)苝(BghiP)、茚苯(1, 2, 3-cd)芘(InP).

土壤PAHs的测定方法：采用索式提取法提取, 经过干燥、浓缩、净化、再次浓缩定容, 通过气相色谱-质谱法(GC-MS(Aglient 7890/5975c))测定样品.GC-MS程序升温方法：起始温度为80 ℃, 保持2 min；以10 ℃·min^-1上升到140 ℃, 保持3 min；再以10 ℃·min^-1上升到210 ℃保持3 min；最后以5 ℃·min^-1上升到290 ℃保持3 min.进样口温度为280 ℃, 进样量为1 μL, 不分流进样, 流速为1.1 mL·min^-1, 离子源温度230 ℃, 四极杆温度150 ℃(赵欧亚, 2015).

质量保证与质量控制：每批次提取装置中均设置至少20%的随机重复样品；测定样品前处理回收率：替代物基质加标法, 氘代三联苯与4-溴-2氟联苯两种替代物质最后回收率控制在70%~130%(张小辉等, 2010), 回收率和检测线的测定参考EPA标准方法(EPA, 1998).

土壤酶活性测定：土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定, 以 20 min每克土壤消耗 0.1 mol·L^-1KMnO₄的毫升数表示；土壤多酚氧化酶活性采用邻苯三酚比色法测定, 以每克干土2 h内生成的紫色没食子素的毫克数表示；土壤木质素过氧化物酶活性以每分钟使1 μmol黎芦醇氧化成黎芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)表示, 0.2 mol·L^-1酒石酸钠缓冲液(pH 3.0) 1.5 mL, 15 mmol·L^-1黎芦醇1.0 mL, 酶液0.4 mL, 15 mmol·L^-1 H₂O₂ 0.1 mL启动反应, 25 ℃水浴2 min, 在310 nm处迅速测其光密度, 测定3 min 内吸光度的变化, 以0.4 mL蒸馏水代替酶液作空白对照, 测定在3 min内的310 nm处吸光度的变化, 计算酶活力, 黎芦醛的摩尔吸光系数ε=9300(mol·L^-1)^-1·cm^-1(程晓滨, 2008).

2.4 数据统计分析

PAHs的降解率

(1)

式中, C₀为CK土壤中PAHs含量, C_t 为土壤中PAHs的残留含量.

本论文数据采用Excel 2003和SPSS 17.0软件进行统计分析, 不同数据组的差异显著性比较采用单因素方差分析, 图表中不相同的小写字母表示处理间差异显著(p＜0.05) .

3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 不同秸秆材料固定化ZH-H2对土壤HMW-PAHs总量的降解影响

土壤培养60 d后, 因CK1、CK2和CK3 3种灭菌材料对照土壤PAHs残留含量差异不大, 因此, 将3者平均值作为空白对照(CK)作为计算不同秸秆材料固定化ZH-H2的降解率.不同秸秆材料固定化ZH-H2处理下土壤10种HMW-PAHs总量的变化如图 2所示.可以看出, Y+B处理下的∑10 PAHs含量显著低于H+B和X+B处理(p＜0.05) , 而H+B和X+B之间的差异不显著(p＞0.05) ；与对照(CK)相比, Y+B 、H+B和X+B处理下10种HMW-PAHs总量均显著下降, 分别下降了720.98、536.18、515.91 μg·kg^-1, 修复效果分别达21.65%、16.10%和15.49%.可见, 玉米、黄瓜、番茄3种固定化材料中, 以玉米秸秆为载体固定化ZH-H2对10种HMW-PAHs总量的降解效果最好.

比较各处理下不同环数PAHs的含量可知(图 3), 与CK相比, Y+B 、H+B和X+B处理下各环数PAHs含量均显著下降, 且4环PAHs在Y+B处理下含量最低, 为1192.43 μg·kg^-1.不同处理对4环PAHs修复效果大小顺次为Y+B＞H+B≈X+B, Y+B处理下修复效果最高, 达21.08%, 是H+B和X+B处理下的1.78倍和2.01倍；5环PAHs修复效果大小顺次为Y+B＞H+B≈X+B, Y+B处理下的修复效果也表现最高, 达21.28%, 为H+B和X+B处理的1.26倍和1.39倍；Y+B 、H+B和X+B 3种处理对6环PAHs总量的降解率分别为23.54%、24.13%和26.92%, 修复效果差异不明显.可见, 对4环、5环HMW-PAHs总量的降解效果在3个处理中以玉米秸秆固定化ZH-H2表现突出, 对6环的降解效果在3个处理间差异不显著.

同一处理对4环、5环、6环PAHs的修复表现出不同的变化规律.H+B对4环、5环、6环PAHs的降解率大小顺次为6环PAHs＞5环PAHs＞4环PAHs(p＜0.05) , X+B表现为6环PAHs＞5环PAHs≈4环PAHs, Y+B对不同环数PAHs的降解率没有显著性差异.由此可知, 番茄、黄瓜秸秆载体材料固定化ZH-H2处理对6环PAHs的降解率均优于4环、5环PAHs, 而玉米秸秆载体材料固定化ZH-H2处理对6环PAHs的降解率略优于4环、5环PAHs, 未达到显著水平.

3.2 不同材料固定化ZH-H2对土壤HMW-PAHs单体的降解影响

进一步对土壤10种 HMW-PAHs 单体进行分析如图 4所示.以玉米秸秆为载体固定ZH-H2处理与对照相比, 土壤中10种 HMW-PAHs 单体均有不同程度的降解, 其降解率范围为16.17%~24.24%.经检验, Y+B处理对BbF(24.20%)、InP(24.24%)、BghiP(22.90%)的修复效果显著高于BkF(16.17%)和DbA(16.74%), 且对Flt、Pyr、BaA、Chry、BaP单体的修复差异不显著, 降解率分别为20.33%、21.68%、20.84%、21.53%、19.67%；以黄瓜秸秆为载体的处理中, 对InP、BghiP 的降解率最高, 分别达25.67%、22.73%, 而对其他 PAHs 单体的降解率范围为10.55%~18.50%;以番茄秸秆为载体处理中, 对BghiP的降解率显著高于其他PAHs单体, 达30.95%, 而对其他 PAHs 单体的降解率范围为5.83%~22.50%.可见, 3种材料固定化ZH-H2处理对InP、BghiP均有较好的修复效果.

比较3种载体材料固定化ZH-H2对土壤PAHs单体的修复效果发现, 不同载体材料修复 PAHs 单体的效果有一定的差异性.对于 Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BaP 6种 PAHs而言, Y+B处理对6个单体的修复效果显著高于H+B和X+B处理(p＜0.05) , 而H+B和X+B处理之间差异不显著(p＞0.05) ；对 BkF、DbA和InP 3种 PAHs 单体而言, Y+B、H+B、X+B 3种处理之间差异不显著；对 BghiP 单体, X+B处理的修复效果显著高于Y+B和H+B处理(Y+B≈H+B＜X+B), 分别比Y+B和H+B处理提高了26.02%和26.58%.可见, 对于不同单体PAHs污染的土壤选用适宜的材料吸附ZH-H2能够起到更为理想的降解效果.

3.3 不同材料固定化ZH-H2对土壤酶活性的影响

不同材料固定化ZH-H2对土壤3种酶活性的影响见表 3.可以看出, 土壤木质素过氧化物酶活性在Y+B处理下比CK增加了38.24%, 而H+B和X+B处理下比CK分别降低了36.51%和20.63%；3种材料处理的木质素过氧化物酶酶活性大小顺次为Y+B>X+B≈H+B, Y+B比X+B和H+B分别增加了50.89%、60.78%, 在Y+B处理下最高, 这与固定化ZH-H2对Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BaP 6种单体PAH的修复效果规律相一致, 该酶活性的变化可能与其降解密切相关；对于多酚氧化酶活性而言, H+B处理比CK有所增加, 但未达到显著水平, 而Y+B、X+B处理却比CK显著降低(p＜0.05) , 其酶活性大小顺次表现为H+B>X+B>Y+B, Y+B处理下多酚氧化酶活性却表现最低；Y+B、H+B和X+B 3个处理下土壤过氧化氢酶活性均比CK显著增加, 分别是对照的2.00、1.99和1.87 倍, 且3种材料处理的酶活性大小顺次为Y+B≈H+B>X+B, 也同样表现为Y+B处理最高.可见, 木质素过氧化物酶和过氧化氢酶活性有着较为相似的规律, 可能与Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BaP 6种单体PAHs的修复效果有关.

4 讨论(Discussion) 4.1 不同材料固定化ZH-H2降解HMW-PAHs的研究

本研究证实, 玉米、黄瓜、番茄3种材料固定镰刀菌进行煤矿区老化污染土壤修复的土培试验后, 不同处理均对10种HMW-PAHs 单体产生了不同程度的降解, 对Flt、BaA和Chry降解率范围分别为5.83%~20.33%、12.11%~24.42%和14.24%~23.73%.刘丹等(2012) 研究表明, 利用玉米芯固定化Mucor sp.孢子悬浊后搅拌均匀形成的固定化毛霉菌, 30 d对焦化厂土壤中Flt、BaA和Chry的降解效果较好, 但对BkF、 BaP、 DbA和BghiP等高分子量PAHs降解效果不佳, 与本试验研究结果不同.这种降解差异可能与PAHs的种类及起始含量、降解菌的种类、接菌量、固定菌材料类型以及老化土壤的来源等诸多因素有关.如邹德勋等(2006) 明确了土壤中PAHs降解速率主要决定于 PAHs 的降解菌数量, 而土壤环境也会影响微生物降解PAHs的活性(张银萍等, 2010)；也有学者认为可能与所选土壤理化性质和PAHs初始含量有关, PAHs浓度低时不能快速诱导产生裂解酶(Bouchez et al., 1995), 影响了土壤中PAHs降解.

本研究表明, 3种秸秆材料固定化ZH-H2对各PAHs单体和4环PAHs总量、5环PAHs总量存在着明显的差异性.Y+B处理对Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BaP和4环PAHs总量、5环PAHs总量的修复效果显著高于H+B和Y+B处理, 尤其对BbF(24.20%)、InP(24.24%)的修复效果突出；X+B处理对BghiP单体的修复效果显著高于其它两处理, 达30.95%；对BkF、DbA和InP 3种PAHs单体的修复效果3个处理之间无显著差异性.同时, 以玉米秸秆为载体固定ZH-H2对多数 HWM-PAHs 的修复效果表现出色.孙璇等(2014) 以小麦秸秆、玉米秸秆和花生壳为原料低温热裂解制备生物质炭来研究对芘的吸附性能, 结果表明玉米秸秆裂解成的生物质炭, 吸附性能较强.可能归于玉米载体材料的比表面积、孔隙结构相对较大, 为细胞的生长提供足够的空间, 利于微生物生长繁殖(Shanxian et al., 2012), 土壤中微生物数量的增加提高了PAHs的修复效果.何娇等(2011) 热解炭化黄豆、芝麻、玉米秸秆制备的秸秆生物质环境材料对水中奈和苊的去除能力表明, 玉米＞黄豆＞芝麻, 说明以玉米秸秆作为吸附材料来去除PAHs的效果较好.有学者还认为, 玉米秸秆中含有更丰富的C、N元素(钱林波等, 2012)可能是更利于微生物的生长, 并作为微生物的共代谢物质促进对PAHs的降解.前人的研究已经证实不同秸秆材料吸附PAHs能力的差异对其降解有较大的影响, 而本研究中出现的玉米、黄瓜、西红柿3种秸秆固定化ZH-H2去除土壤PAHs的差异性可能与其吸附性能、碳氮比、碳氮可利用性以及降解菌与材料间的交互作用有关, 其机理有待于进一步深入研究.

一般来说, PAHs环数的增加, 生物可利用性降低, 降解率降低(孙铁珩等, 1999).然而, Olivier等(2004) 发现的镰刀菌属对5环、6环HMW-PAHs的修复效果高于4环PAHs, 与本研究中黄瓜秸秆、番茄秸秆载体材料固定ZH-H2对土壤6环PAHs的修复效果显著高于4、5环PAHs的修复效果以及玉米秸秆载体材料固定ZH-H2对土壤6环PAHs的修复效果略高于4、5环PAHs的修复效果规律一致, 这可能与镰刀菌属ZH-H2菌种降解PAHs的特性有关；然而玉米秸秆材料固定化ZH-H2对土壤6环PAHs的修复效果略高于4、5环, 与黄瓜秸秆、番茄秸秆固定化镰刀菌属ZH-H2对不同环数PAHs降解率规律不同, 可能归于不同秸秆材料成分的影响, 不同秸秆对不同环数PAHs的降解影响机理尚需进一步深入研究.

4.2 不同秸秆材料固定化ZH-H2对土壤酶活性的影响

本研究中Y+B、X+B处理下其活性均显著低于对照处理.该结果与Liu等(2014) 种植火凤凰修复8种HMW-PAHs得出的与对照相比土壤多酚氧化酶活性有明显降低的变化规律相一致；而与王洪等(2011) 研究得出的加入固定化菌剂后土壤多酚氧化酶活性与对照相比明显增加的结论却相反, 可能归于选用的菌种及载体材料不同造成了微生物活性及产酶受到不同影响所致, 不同固定化载体材料固定化ZH-H2对HMW-PAHs的修复效果不同.本研究中木质素过氧化物酶活性的变化规律与Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BaP 6种单体PAH的修复效果规律相一致.Wang等(2009) 利用白腐真菌降解土壤中Phe、Pyr、BaP的研究结果表明, 19 d的降解率范围为72.77%~25.50%, 而对应木质素过氧化物酶活性最大值的范围为0.16~0.05 U·g^-1.与本研究结果一致.本研究中不同材料固定化ZH-H2的处理土壤过氧化氢酶活性均显著高于对照.Miga等认为, 向土壤添加植物残体材料等天然有机质可明显改善土壤理化性质, 进一步影响了微生物在土壤中的产酶能力以及微生物数量(Miga et al., 2001).本研究中土壤过氧化氢酶活性明显提高可能与不同载体材料有机质对微生物产酶能力的影响有关.不同秸秆材料对土壤酶活性的影响机理尚待进一步研究.

5 结论(Conclusions)

1) 利用玉米、黄瓜、番茄不同秸秆材料固定ZH-H2修复煤矿区农田老化污染土壤呈现出了较为理想的效果, 对10种PAHs总量的修复效果顺次为Y+B(21.65%)＞H+B(16.10%)≈ Y+B(15.49%), 玉米秸秆固定化ZH-H2对10种HMW-PAHs总量修复效果最佳.

2) 对Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BaP的修复效果Y+B处理显著高于H+B和Y+B处理, 尤其对BbF(24.20%)、InP(24.24%)的修复效果突出；对BghiP单体的修复效果X+B处理显著高于Y+B和H+B, 达30.95%；对BkF、DbA和InP 3种PAHs单体的修复效果3种处理间无显著性差异, 对不同PAHs单体污染土壤需选用不同固定化材料固定ZH-H2.

3) 土壤木质素过氧化物酶和过氧化氢酶活性在3种秸秆材料处理下呈现了较为相似的规律, 均表现为Y+B处理下最高, 与固定化ZH-H2对Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BaP 6种单体PAHs的修复效果规律相一致；而对于多酚氧化酶活性却呈现了相反的规律, Y+B处理下表现最低.