2017, Vol. 37
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溶解性有机质(dissolved organic matter，DOM)作为一种十分重要的化学物质组分，其在联系陆地及水生生态系统中发挥了重要作用(Solomon et al., 2015;何伟等，2016).另外，DOM还在全球碳循环、生态系统营养盐平衡和生态系统的物质与能量转换等过程中扮演重要角色(Bodmer et al., 2016;Cuss and Guéguen, 2013; Birdwell and Engel, 2009).土壤中DOM主要由根系分泌物、细菌和真菌等微生物、植物凋落物组成，并且土壤DOM中溶解性有机碳(dissolved organic carbon，DOC)是岩溶生态系统中活跃的有机碳组分，在岩溶地区碳循环中发挥着重要作用(曹建华等，2005).
我国岩溶区面积广阔，岩溶系统独特的二元水文地质结构使得水体中DOM有着独特的分解、产生和保存方式(姚昕等，2014).另外，我国西南岩溶区土壤具有土层薄、易流失等特点，土壤中DOM经流水冲刷很容易通过岩溶裂隙、溶缝、落水洞等进入地下河中.在此过程中，一方面，土壤中DOM随雨水冲刷进入洞穴形成洞穴滴水，洞穴滴水携带的细菌、真菌等微生物对洞穴沉积产生了积极作用(Boquet and Boronat, 1973).另一方面，土壤中DOM随雨水冲刷进入地下河时，由于缺乏太阳光照的影响，使得DOM在地下河运移过程中不能进行光合作用和光解作用.因此，探讨DOM在岩溶洞穴地下河中的来源及变化特征显得十分重要.脂肪酸作为一种典型的生物标志物，其在示踪有机质来源及变化(Woulds et al., 2012)、古环境重建(Bertrand et al., 2013)及微生物多样性标记(Merilä et al., 2010) 等方面发挥重要作用.
在国内已发现的洞穴中，重庆丰都雪玉洞存在较为少见的碳酸盐类(方解石、文石)和硫酸盐类(石膏)次生物理化学沉积物并存的现象.其形态完美多样，类型珍贵稀有，色泽洁白如玉(朱学稳等，2004)；洞内滴水新生沉积物的沉积速率较快(雨季的沉积量月平均值为0.445 g，旱季的沉积量月平均值为0.249 g) (徐尚全等，2012)；洞内空气CO2浓度在每年11月存在先上升后快速下降的过程，上升期间地下河脱气量和δ13CDIC值表明地下河脱气是洞内空气CO2上升的控制因素(王晓晓，2014)，但对洞内较快沉积速率及高浓度CO2来源之间的关系尚未进行深入研究.因此，本研究选取雪玉洞地下河作为研究对象，利用脂肪酸对地下河水中DOM来源及变化特征进行示踪，为雪玉洞岩溶动力系统及生物地球化学循环提供基础数据，以期为雪玉洞内沉积速率影响因素及高浓度CO2来源提供数据支持.
2 研究区概况(General situation of study area)雪玉洞(29°47′00″N，107°47′13″E)位于重庆市丰都县长江南岸的龙河下游峡谷内，距丰都新县城12 km(图 1).洞口海拔233 m，高出龙河平水面55.5 m.雪玉洞因洞内次生沉积物种类丰富且色泽雪白如玉而得名.研究区内多年平均气温 16.5 ℃，多年平均降水量1072 mm，属典型亚热带湿润季风气候.雪玉洞发育在川东平行岭谷方斗山背斜北西翼的三叠系飞仙关组(T1f)薄至中厚层灰岩中，岩层产状为310°∠43°.洞穴顶板岩层厚150~250 m，上覆植被以常绿阔叶林和灌丛为主，土壤厚度0~50 cm.大气降水是洞内地下河唯一补给源，受西南季风和东南季风的双重影响，降水主要集中在每年的4-10月.
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| 图 1 雪玉洞地理位置及监测点位置示意 Fig. 1 Location of Xueyu Cave and sampling sites |
雪玉洞属峡谷型洞穴，洞道狭窄，没有发育大的洞厅，空间较小，其中下层发育地下河，使得洞内相对湿度较高(一般≥100%).洞内气温较稳定，但受灯光和游客的影响，各层略有差异，上层17.7~18.3 ℃，中层17.4~18.1 ℃，下层16.6~17.6 ℃，地下河水温16.3~16.7 ℃.为便于洞穴管理，当地工作人员在洞口安装两扇门，这使得洞内外气流的交换不明显(Wu et al., 2015;王凤康等，2014;蒲俊兵等，2009).
3 材料与方法(Materials and methods) 3.1 样品的采集根据雪玉洞地下河的分布特点，分别在地下河的主要入口处(Site1：位于雪玉洞内部)、地下河出口处(Site 2：位于雪玉洞入口处)设置了2个采样点(图 1).采样时间为2014年11月1日和11月8日，用事先清洗干净4 L棕色玻璃瓶采集水样，加入饱和HgCl2，抑制微生物的生长，然后密封迅速运回实验室保存.
3.2 试剂和材料样品分析所用的正己烷、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯，购自美国Fisher公司.玻璃纤维膜(Whatman GF/F，有效孔径0.7 μm)和4 L棕色玻璃瓶(室内使用去离子水清洗3遍，现场润洗多次)于450 ℃马弗炉中灼烧6 h，无水硫酸钠(分析纯)于550 ℃马弗炉中灼烧8 h，分别置于干燥器中冷却密封备用；脱脂棉经二氯甲烷抽提72 h后风干，密封干燥备用.盐酸用二氯甲烷萃取6次后备用.
3.3 样品处理与分析 3.3.1 水样中溶解态脂肪酸提取取经过玻璃纤维滤膜过滤的水样装入棕色瓶中，用净化后的盐酸酸化至pH<2，摇匀，使用全自动固相萃取系统(美国 Horizon公司，SPE-DEX 4790) 萃取(C18膜，直径47 mm，3M公司)，提取液用50 mL鸡心瓶收集，提取液依次经过皂化、甲基化后，用正己烷萃取其中的正构烷烃和脂肪酸，然后经干燥、浓缩后，氮吹至0.2 mL，加入内标物，放入-26 ℃冰箱中待测.
3.3.2 脂肪酸分析脂肪酸的检测采用GC-MS分析(Agilent，7890A/5975C)，色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm).载气为高纯氦气，流速为1 mL·min-1，进样口温度280 ℃，升温程序为初始温度50 ℃，保持1 min后以20 ℃·min-1升温至200 ℃，然后再以10 ℃·min-1的速度升温至290 ℃，保持15 min.无分流进样，进样量1 μL.EI电离源70 eV，离子源温度230 ℃.采集全扫描数据.使用内标法进行定量分析.
4 结果与讨论(Results and discussion) 4.1 溶解态脂肪酸含量及组成特征图 2为采样点中溶解态脂肪酸浓度变化特征.在2014年11月1日，Site 1、Site 2采样点溶解态脂肪酸浓度分别为1642和1755 ng·L-1；2014年11月8日Site 1、Site 2采样点溶解态脂肪酸浓度分别为3838和4999 ng·L-1.平均浓度为分别为1698和4419 ng·L-1.Site 1采样点中溶解态脂肪酸浓度均小于Site 2采样点.
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| 图 2 溶解态脂肪酸浓度分布 Fig. 2 Distribution of total dissolved fatty acids concentrations |
表 1为采样点中不同溶解态脂肪酸浓度比重.根据表 1，Site 1和Site 2采样点中溶解态脂肪酸均以饱和直链脂肪酸(SSFA)浓度所占比重最高，其平均浓度百分比分别为62.54%和58.87%.其次为单不饱和脂肪酸(MUFA)，其平均浓度百分比分别为27.39%和28.34%.饱和支链脂肪酸(BSFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)所占比例较小.Site 1采样点中溶解态BSFA浓度所占比重均低于Site 2采样点，MUFA和PUFA则没有明显规律.具体来说，在2014年11月1日，Site 1采样点中溶解态BSFA和PUFA浓度所占比重均小于Site 2采样点，SSFA和MUFA则表现为大于Site 2采样点；2014年11月8日，则是溶解态BSFA和MUFA所占比重均小于Site 2采样点，PUFA所占比重大于Site 2采样点.这可能说明，外在条件的变化能够影响地下河水中溶解态有机质的来源.
| 表 1 溶解态脂肪酸成分组成1) Table 1 Composition of dissolved fatty acids1) |
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图 3为Site 1、Site 2采样点中溶解态饱和直链脂肪酸碳数分布特征.由图 3可以看出，各采样点中SSFA碳数分布范围为C10:0～C28:0，且浓度均以C16:0为主碳峰，次碳峰为C18:0和C14:0.一般来说，C14:0、C16:0、C18:0等低等饱和脂肪酸广泛存在于蜡质、微藻和细菌中(Wang and Liu, 2012).但也有研究指出，C10:0～C20:0主要来自藻类、浮游生物及细菌(黄婧等，2009；黄咸雨等，2007).另外，C22:0～C38:0等饱和直链脂肪酸主要来自水生(Fang et al., 2014)及陆地高等植物.所以，利用∑C21:0-/∑C22:0+能够反映出低等生物输入和高等生物输入相对浓度的变化(房吉敦等，2009).Site1、Site2采样点中溶解态脂肪酸∑C21:0-/∑C22:0+值的变化范围为14.93～40.63，平均值为20.03，显示地下河DOM以低等生物源为主.
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| 图 3 地下河水中溶解态饱和直链脂肪酸碳数分布 Fig. 3 The distributions of dissolved saturated straight fatty acids in the underground river water |
不饱和脂肪酸通常被认为是真核藻和细菌输入的标志，而单不饱和脂肪酸则指示水生藻类和细菌输入(Zou et al., 2006).如C16:1ω9(c)、C16:1ω9(c)主要来自于细菌，18:1ω9(t)则主要来自放线菌和真菌，C18:1ω7(t)可能来自革兰氏阴性细菌.表 2中各单不饱和脂肪酸浓度变化较大，如C18:1ω9(t)的浓度变化范围为65.1~406 ng·L-1，C16:1ω9(c)的浓度变化范围为65.6~692 ng·L-1等.除C18:1ω5(t)和C22:1ω9(c)外，其他Site 2 采样点中各单不饱和脂肪酸浓度都显著大于Site 1.
| 表 2 各采样点中单不饱和脂肪酸浓度变化 Table 2 Variation of dissolved monounsaturated fatty acids concentrations among different sites |
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主成分分析方法是环境统计分析常用的一种多元统计方法.目前，利用主成分分析方法在判断脂肪酸来源及贡献等方面发挥了重要作用(Reiffarth et al., 2016;Boëchat et al., 2014).本研究采用主成分分析方法对雪玉洞地下河水中溶解态脂肪酸组合特征进行分析，对脂肪酸来源进行解析.
| 表 3 公因子方差解释 Table 3 Interpretation of common components |
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利用SPSS17.0对雪玉洞地下河水中溶解态脂肪酸中37种成分进行分析，经球形检验认为该数据符合主成分分析要求，选取特征根大于1的主成分.由表 3可以看出，共提取3个主成分，其方差贡献率分别是50.38%、29.03%和20.59%，累积贡献率为100%.
表 4为脂肪酸因子载荷.和第1主成分正相关的主要有小于C:20的饱和直链脂肪酸(C15:0、C14:0、C16:0、C20:0、C13:0、C10:0、C18:0、C12:0) ，单不饱和脂肪酸(C16:1ω9(c)、C16:1ω9(t)、C18:1ω9(t)、C17:1ω7(c))，饱和支链脂肪酸(MeC13:0、3MeC16:0、6MeC14:0、MeC14:0、MeC15:0) ，还有指示陆地高等植物输入的C26:0，负相关的是C18:1ω5(t).第2主成分中正相关的是C18:3ω5, 7, 9、MeC21:0、C22:0、C21:0、MeC17:0、C24:0、C23:0，负相关的是C25:0和C22:1ω9(c).第3主成分中正相关的既有饱和直链脂肪酸(C11:0、C28:0) 、单不饱和脂肪酸(C18:2ω6, 9(c)、C22:1ω9(c)、C18:1ω7(t)、C18:1ω5(t))、多不饱和脂肪酸(C20:5ω3, 6, 9, 12, 15、C18:2ω6, 9(c))，负相关的是C17:0、MeC16:0.
| 表 4 脂肪酸因子载荷 Table 4 Component loading of fatty acids parameters |
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根据前人研究，小于C:20的偶数碳饱和直链脂肪酸主要来自原生地藻类和细菌的输入；C16:1ω9(c)、C16:1ω9(t)、C18:1ω9(t)等单不饱和脂肪酸主要来自细菌、真菌等微生物的输入(Mortillaro et al., 2011)；MeC15:0等饱和支链脂肪酸也主要指示细菌、真菌的输入.因此第1主成分主要指示洞穴滴水中溶解性有机质的输入.
一般来说，C21:0~C24:0主要指示沉水或挺水植物的输入，而大于C24:0的饱和直链脂肪酸则被认为来自陆地高等植物的输入.雪玉洞地下河与外部河流相通，外部河流在进入地下河时自身就携带了河水内部及陆地向河流输入的有机质，第2主成分主要指示洞外河水中溶解性有机质对雪玉洞地下河水有机质的输入.即细菌、藻类、真菌和陆地高等植物的输入.
雪玉洞为国家4A级著名景区，旅游活动旺盛，游客在进入洞内时不仅携带了大量的真菌、细菌等微生物，还携带一些来源于陆地高等植物的有机质.即有机质来源成分复杂多样.第3主成分中呈正相关的是不仅有指示陆地高等植物来源的C26:0、C28:0，还有指示细菌C22:1ω9(c)、C18:1ω7(t)、和C22:1ω9(c)真菌(Bach et al., 2010)的输入，所以认为第3主成分主要指示外部旅游活动的输入.
根据主成分分析结果，雪玉洞地下河水中溶解态脂肪酸主要分为以下3种来源:①洞穴滴水的输入；②外部河流的输入；③游客的携带.并对洞穴中溶解脂肪酸的3种来源含量定义如下:
洞穴滴水脂肪酸来源(Ⅰ) =C16:1ω9(c)+C15:0+C14:0+MeC13:0+C16:1ω9(t) +C16:0+C20:0+C13:0+3MeC16:0+6MeC14:0+C18:1ω9(t)+ C14:1ω5+MeC14:0+MeC15:0+C16:1ω5(t)+ C10:0+C17:1ω7(c)+C18:0+C12:0+C26:0；
外部河水脂肪酸来源(Ⅱ)=MeC17:0+C18:3w5, 7, 9+C21:0+MeC21:0+C22:0+C23:0+C24:0+C25；
游客携带的脂肪酸(Ⅲ)=C11:0+C28:0+C20:5ω3, 6, 9, 12, 15+C18:2ω6, 9(c)+C22:1ω9(c)+C18:1ω(t)+C18:1ω5(t).
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| 图 4 各采样点中不同来源溶解态脂肪酸浓度变化 Fig. 4 Variation of dissolved fatty acids among different sampling sites and sources |
由图 4可见，在采样时期内，洞穴滴水携带的有机质向雪玉洞地下河水的输入构成了雪玉洞地下河水中溶解性有机质的主要来源.
第1种来源即洞穴滴水脂肪酸来源的溶解态脂肪酸浓度变化范围为1418～4617 ng·L-1，平均浓度为2483 ng·L-1；第2种来源即外部河水脂肪酸来源的溶解态脂肪酸浓度变化范围为39.9～792 ng·L-1，平均浓度为239 ng·L-1；第3种来源即游客携带的脂肪酸来源的溶解态脂肪酸浓度变化范围为104～393 ng·L-1，平均浓度为280 ng·L-1.
在采样期间内，雪玉洞地下河水中溶解态脂肪酸主要来自上覆洞穴滴水携带的有机质.另外，Site2采样点中溶解态脂肪酸浓度受旅游活动影响较大.说明，地下河水中溶解性有机质来源受外部环境变化影响显著.
5 结论(Conclusions)1) 采样期间雪玉洞地下河水中溶解态脂肪酸浓度变化差异明显，地下河入口(Site 1) 溶解态脂肪酸浓度明显低于出口处(Site 2) ，平均浓度分别为1698和4419 ng·L-1，其浓度变化受旅游活动影响较大；各采样点中溶解态脂肪酸组成以低碳数饱和直链脂肪酸(C≤20:0) 占优势，其次为单不饱和脂肪酸.
2) 雪玉洞地下河水中溶解态脂肪酸主要来自洞顶上覆土壤中DOM的输入，且土壤中DOM主要以细菌、真菌等微生物为主，并伴有少量高等植物的输入.另外，旅游活动对雪玉洞地下河水中DOM来源影响较大.
致谢: 衷心感谢西南大学地理科学学院陈宇、胡刘婵、雷佳琪、曾泽等在野外采样和样品前处理过程中的大力帮助!| [${referVo.labelOrder}] | Solomon C T, Jones S E, Weidel B C, et al. 2015. Ecosystem consequences of changing inputs of terrestrial dissolved organic matter to lakes:current knowledge and future challenges[J]. Ecosystems, 18(3) : 376–389. DOI:10.1007/s10021-015-9848-y |
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