2017, Vol. 37
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抗生素在动物养殖场被广泛用于预防动物疾病和促进动物生长.然而，30%~90%的抗生素不能在动物体内代谢，往往以原药的形式随粪尿排出体外，进入农田土壤、地表水、地下水等生态环境中，不仅造成了生态环境的污染，还可能诱发各类抗生素耐药细菌的产生 (仇天雷等，2015).抗生素抗性基因 (Antibiotic Resistance Genes, ARGs) 是细菌耐药性产生的根源，ARG可以通过质粒、整合子等基因元件在环境细菌中进行水平转移传播 (苏建强等，2013)，一旦转移到人类致病菌中，将会对人类健康造成巨大的危害.因此，可以认为环境中ARG的持久性残留和传播比抗生素本身的危害还要大.
高温堆肥一直被认为是无害化处理固体废弃物的有效途径，大量研究已经表明，通过堆肥可以有效去除粪便、污泥中的抗生素及有害微生物 (Su et al., 2015；Kim et al., 2012).近年来，也有一些关于高温堆肥去除抗生素抗性基因的报道，但报道结果差异较大.郑宁国等 (2016)研究发现，大规模的高温堆肥能够有效降低猪粪中β-内酰胺类和喹诺酮类抗性基因的水平；林辉等 (2016)研究发现，高温堆肥能够有效降低鸡粪中四环素类抗性基因 (tetQ、tetW) 的相对丰度；而韦蓓等 (2014a;2014b) 却在污泥高温堆肥中发现，磺胺类抗性基因sulⅠ、sulⅡ丰度只在高温阶段有所下降，在冷却阶段出现显著反弹.Qian等 (2016)认为堆肥物料中的抗生素种类和浓度会改变细菌群落，进而影响堆肥进程；Selvam等 (2012)研究发现，堆肥物料中的抗生素浓度会造成堆肥过程中细菌群落的波动，而微生物是抗性基因的主要携带者，因此，细菌群落的改变会直接影响抗生素抗性基因的丰度.在堆肥物料中添加不同浓度的抗生素来探索抗生素、微生物、抗性基因三者的关系，对于阐明堆肥对抗生素抗性基因的影响是十分必要的.
四环素类抗生素是养殖场应用频率最高、使用量最大的一类抗生素.相关调查结果显示，我国不同地区猪粪中的四环素最高含量从59.06 mg · kg-1到172.90 mg · kg-1不等 (Wang et al., 2015)，检出四环素类ARG种类高达10种之多 (Cheng et al., 2013)，俨然猪粪中的四环素类抗生素及其抗性基因已成为了一个重要的污染源.因此，本实验选择四环素、金霉素、土霉素3种典型抗生素以不同浓度添加到猪粪中，在堆肥的不同阶段定量检测抗生素含量、微生物数量及四环素抗性基因丰度的动态变化，研究添加不同浓度抗生素对猪粪堆肥过程中抗生素和四环素抗性基因的影响.
2 材料和方法 (Materials and methods) 2.1 供试材料土霉素 (Oxytetracycline, OTC, 纯度≥97%)、金霉素 (Chlorotetracycline, CTC, 纯度≥99%) 购于美国Sigma公司，四环素 (Tetracycline, TC, 纯度≥97.5%) 购于德国Dr. Ehrenstorfer公司.供试新鲜猪粪取自吉林农业大学动物养殖基地，该基地在猪的养殖过程中未添加任何抗生素.供试玉米秸秆取自吉林农业大学试验田.堆肥原料理化性质如表 1所示.
| 表 1 堆肥原料理化性质 Table 1 The characteristics of raw materials for composting |
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堆肥试验于2016年4月3日—5月17日在吉林农业大学动物养殖基地一空置动物室内进行.堆肥按C/N比为25 : 1计算新鲜猪粪与玉米秸秆 (粉碎至1~3 cm) 的干重质量比，再根据各自的水分计算出湿重质量比 (约为4 : 1).堆肥物料总质量设定为40 kg，即猪粪约为32 kg，玉米秸秆约为8 kg，将物料充分混匀后放置到堆肥装置中 (泡沫箱，长70 cm、宽50 cm、高45 cm，泡沫箱侧壁设有通风孔)，设置3个重复，水分控制在60%~65%，定期进行翻堆通风，静态自然堆置45 d.
试验共设计3个处理.对照组：猪粪+玉米秸秆；低剂量组：猪粪+玉米秸秆+四环素类抗生素 (TC、OTC、CTC各添加10 mg · kg-1)；高剂量组：猪粪+玉米秸秆+四环素类抗生素 (TC、OTC、CTC各添加50 mg · kg-1).
2.3 样品采集分别于第1、3、7、21、42 d从堆体上、中、下3点进行取样，采用四分法进行混合.采样时间分别代表着堆肥的不同阶段，第1 d代表升温阶段 (约45 ℃)，第3 d代表高温阶段 ( > 55 ℃)，第7 d代表冷却阶段 (约50 ℃)，第21 d代表初期腐熟阶段 (约35 ℃)，第42 d代表完全腐熟阶段 (约28 ℃).
2.4 测定项目及方法 2.4.1 堆体理化性质每日上午8：00和下午4：00测定堆体中心温度的平均值；有机碳采用重铬酸钾法测定；全氮采用凯氏定氮法测定；含水率采用质量测定法测定；pH值采用pH计测定 (鲜样品和去离子水质量体积比为1 g/10 mL).
2.4.2 抗生素测定四环素类抗生素测定参照文献 (孙刚等，2010).采用甲醇-Na2EDTA/MCIVaine (体积比1 : 1) 萃取液萃取，HLB固相柱净化，甲醇进行洗脱净化，采用日本岛津LC-2010-AHT型高效液相色谱仪测定.TC、OTC和CTC的检测限分别为0.025、0.002、0.016 mg · kg-1，加标回收率分别为 (65.70%±9.15%)、(82.00%±11.47%)、(57.00%±6.95%.)
2.5 抗性基因的检测和定量分析 2.5.1 样品DNA提取采用细菌基因组FastDNA提取试剂盒提取样品中的DNA，按照试剂盒说明书进行操作.DNA含量及纯度采用超微量紫外分光光度计进行检测.
2.5.2 PCR检测本实验选择8种常见的四环素类抗性基因tetA、tetC、tetE、tetG、tetM、tetO、tetQ和tetW对样品进行检测.引物设计主要来源于已发表的文献 (Aminov et al., 2002；Cheng et al., 2013)，引物、片段大小及退火温度如表 2所示.PCR反应体系为25 μL体系，包含10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物 (10 μmol · L-1) 各0.5 μL，DNA模板2 μL，ex Taq酶0.3 μL和ddH2O 16.7 μL.PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃终延伸5 min.
| 表 2 PCR和Q-PCR引物序列、片段大小及退火温度 Table 2 Primer sequences, fragment size and annealing temperature for PCR and Q-PCR assays |
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PCR扩增产物切胶纯化后，与载体pMD-18T载体连接后转化至Escherichia coli DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后送生工基因公司进行测序.所得序列与GeneBank数据库中序列进行Blast分析比对来确定目的基因是否正确.确认无误后，采用质粒小提试剂盒提取质粒，采用紫外分光光度计测定浓度，按10倍浓度梯度稀释，以拷贝数为横坐标，循环数Ct值为纵坐标绘制标准曲线.标准质粒拷贝数计算公式如下：
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(1) |
式中，CNV为拷贝数，m为质量，M为摩尔质量，NA为阿伏伽德罗常数，x为质粒浓度 (ng · μL-1)，a为插入片段.
2.5.4 Q-PCR分析本试验对6种检测出的四环素类抗性基因 (tetA、tetC、tetG、tetM、tetQ、tetW) 及16S rDNA基因进行定量检测.Q-PCR反应体系为20 μL体系，包括SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，上下游引物 (10 μmol · L-1) 各0.5 μL，BSA (10 mg · mL-1) 0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.2 μL.Q-PCR反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，退火35 s，72 ℃延伸35 s，40个循环.ddH2O为阴性对照，仪器自动添加溶解曲线程序.
2.6 数据分析试验数据采用Microsoft Excel软件进行整理，采用SPSS Statistic19.0利用Duncan′s Multiple-Range test进行差异性分析.
3 结果与讨论 (Results and discussion) 3.1 猪粪堆肥过程中基本理化性质的变化堆肥初期，堆肥物料中的好氧微生物将易分解的有机物质迅速分解为小分子物质，并产生大量的代谢热能，导致堆肥温度迅速上升.对照组、低剂量组和高剂量组的堆肥温度分别在第3 d、第4 d、第4 d达到最高，分别为62、61和60 ℃.随着堆体和环境空气的对流和转导，以及水分的蒸发，大量热量被带走，堆体温度开始下降.根据国家卫生合格标准，堆体温度在55 ℃条件下保持3 d以上，是杀灭粪便中致病菌和寄生虫卵的重要条件.结果显示，3组堆体温度均达到了无害化腐熟标准.至45 d时，3组堆体温度均稳定在28 ℃左右，略高于环境温度，堆肥不再有蚊蝇滋生，刺鼻的气味消失，堆肥产物呈现疏松的团粒结构.
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| 图 1 堆肥过程中温度的变化 Fig. 1 The change of temperature during composting |
图 2描述了不同处理组在堆肥过程中四环素、土霉素和金霉素的降解效果.3种抗生素在2个处理组中的降解趋势可分为3个阶段：快速降解阶段 (1~7 d)、中速降解阶段 (8~21 d)、缓慢降解阶段 (22~42 d).在1~7 d时，高剂量组和低剂量组中3种抗生素降解速率最快，TC去除率分别为37%、60%；OTC去除率分别为38%、65%；CTC去除率最高，分别为51%、76%.随后，抗生素降解速率开始放缓，至21 d时，高剂量组3种抗生素 (TC、OTC、CTC) 的去除率分别为56%、58%、68%，其中，CTC去除率最高；而在低剂量组中，OTC去除率最高，为92%，TC为90%，CTC为86%.21 d以后，抗生素的降解速率变得极为缓慢，直至堆肥结束，降解速率变化极为缓慢，高剂量组中3种抗生素 (TC、OTC、CTC) 的去除率分别为60%、62%、71%，其中，CTC去除率最高，低剂量组中3种抗生素 (TC、OTC、CTC) 的去除率分别为91%、94%、92%，3种抗生素去除率在该组中差异很小.
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| 图 2 不同堆肥处理四环素 (a)、土霉素 (b) 和金霉素 (c) 的去除率 Fig. 2 Percentage of TC (a), OTC (b) and CTC (c) removal in different treatments of composting |
从实验结果可以看出，3种抗生素的去除主要发生在快速降解阶段 (1~7 d) 和中速降解阶段 (8~21 d).这与Selvam等 (2012)、孟磊等 (2015)的研究结果相类似.Selvam等 (2012)在高温堆肥对环丙沙星去除效果的研究中发现，环丙沙星的去除主要发生在前21 d.孟磊等 (2015)在高温堆肥对鸡粪中氟喹诺酮类抗生素去除效果的研究中发现，5种喹诺酮类抗生素在堆肥初期 (0~14 d) 的去除率均明显高于堆肥后期 (19~42 d).另外，本研究发现低剂量组中四环素类抗生素去除率显著高于高剂量组，这可能是由于高剂量组中抗生素添加量较高，对堆肥中的微生物产生了毒害作用，抑制了微生物的增殖及活力，从而导致高剂量组中四环素类抗生素的降解速率变得缓慢，最终去除率降低.另外两个处理组均在高温期降解效率最高，Arikan等 (2007)的研究结果也表明，高温是导致堆肥过程中抗生素降解的主要因素.一方面可能由于四环素类分子C—N键能较弱，当温度升高时易断裂，导致羧基及哌嗪环断裂并脱去.另一方面可能是由于温度升高增强了嗜温菌和嗜热菌的生物活性，促进了抗生素的生物降解 (孟磊等，2015).
3.3 堆肥处理对细菌数量的影响本研究通过定量堆肥中细菌16S rDNA基因的拷贝数，从宏观角度研究不同堆肥处理组中细菌的动态变化.由图 3可知，堆肥初始物料中细菌16S rDNA基因的拷贝数为3.5×1011coies · g-1(以干重计)，在堆肥第1 d时，细菌16S rDNA基因的拷贝数有所降低，其中，对照组与低剂量组无明显差异，但均显著高于高剂量组 (p < 0.05).第3 d时，各组的细菌16S rDNA基因拷贝数急剧下降，下降幅度近4倍.在第21 d时，各组的细菌16S rDNA基因拷贝数略有升高，随后逐渐降低.本研究中细菌的动态变化规律与Selvam等 (2012)的研究结果一致.在堆肥初始阶段，细菌16S rDNA基因拷贝数迅速降低，这可能与堆体进入高温期有关.高温导致堆体中大部分细菌无法生存，另外生存环境的突然改变也抑制了部分敏感细菌的生长 (Li et al., 2010).高剂量组16SrDNA基因拷贝数在第1、3、21、42 d都显著低于对照组和低剂量组 (p < 0.05)，这可能是由于高浓度抗生素抑制了细菌的生长和微生物活性而导致的.
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| 图 3 堆肥物料16S rDNA的Q-PCR定量结果 (不同小写字母代表差异显著 (p < 0.05)，下同) Fig. 3 Quantification of 16S rDNA of the composting mass by using Q-PCR |
在堆肥的初始物料中共检测到6种编码四环素类抗性的基因，其中，编码外排泵类基因3种 (tetA、tetC、tetG)，编码核糖体保护蛋白类基因3种 (tetM、tetQ、tetW)，这表明猪的消化道中存在着大量的四环素类抗性细菌.有趣的是，取样基地在猪养殖过程中并未添加任何抗生素促生长剂，同时猪粪样品中也未检测出TC、CTC和OTC的存在.这可能是由于长期存在环境中的抗性细菌通过呼吸道、消化道进入猪体内，并在猪肠道细菌之间发生了水平传播.同时本文发现，这6种抗性基因在其他样品中也被频繁检出，Cheng等 (2016)在猪粪、沼气残渣、土壤等样品中检测到tetA、tetB、tetC、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW等基因.Liu等 (2012)在废水处理系统中检测到tetA、tetC、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX等基因.由此可知，本试验检测到的6种四环素类抗性基因在环境中是普遍存在的.在这6种抗性基因中，tetG相对丰度最高，达到1.5%，其次依次为tetC (0.22%)、tetA (0.1%)、tetM (0.09%)、tetQ (0.04%)，tetW相对丰度最低，只有0.01%.这与Yu等 (2005)的研究结果截然相反，Yu等发现猪粪中的核糖体保护蛋白类基因 (tetQ、tetW) 的相对丰度远远高于外排泵类基因 (tetC、tetG)，这可能与样品来源、环境因素及猪的饲养管理有一定关系.
堆肥过程中各处理组目标基因相对丰度的变化如图 4所示.在堆肥过程中，抗生素添加组目标基因相对丰度普遍高于对照组，而低剂量组目标基因相对丰度 (tetW除外) 又普遍高于高剂量组，这可能是因为抗生素的添加可以刺激抗生素抗性基因的产生，而亚抑制浓度的抗生素刺激更有利于抗生素抗性基因的增殖和持续性 (Wu et al., 2011).tetA、tetC、tetQ相对丰度在1~14 d呈现增长趋势，第14 d出现最高值，随后开始下降，至第42 d时，tetA相对丰度仍然高于初始时相对丰度，而tetC、tetQ相对丰度低于初始时相对丰度.tetM相对丰度呈现先下降再升高再降低的趋势，至42 d时tetM相对丰度低于初始丰度，从第3 d起，高剂量组tetM相对丰度一直高于低剂量组.tetW在第1 d时相对丰度最高，随后逐渐下降，第21 d时下降到最低，第42 d时低于检测限.
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| 图 4 堆肥过程中抗性基因相对丰度的变化 Fig. 4 Variations of the relative abundances of ARG during the composting |
1) 经堆肥处理后，低剂量组中四环素、土霉素、金霉素的去除率分别为91%、94%、92%，高剂量组中四环素、土霉素、金霉素的去除率分别为60%、62%、71%.堆肥对猪粪中低浓度的抗生素降解效果更好.两处理组在高温阶段四环素类抗生素降解速率最快，高温是影响猪粪堆肥过程中抗生素的主要因素.
2) 经堆肥处理后，tetA的相对丰度增加，tetC、tetG、tetM、tetQ、tetW的相对丰度均下降.高温堆肥对猪粪中的四环素类抗性基因也有一定的削减作用.
| [${referVo.labelOrder}] | Aminov R I, Chee Sanford J C, Garrigues N, et al. 2002. Development, validation, and application of PCR primers for detection of tetracycline efflux genes of Gram-negative bacteria[J]. Applied & Environmental Microbiology, 68(4) : 1786–1793. |
| [${referVo.labelOrder}] | Arikan O A, Sikora L J, Mulbry W, et al. 2007. Composting rapidly reduces levels of extractable oxytetracycline in manure from therapeutically treated beef calves[J]. Bioresource Technology, 98(1) : 169–176. DOI:10.1016/j.biortech.2005.10.041 |
| [${referVo.labelOrder}] | Cheng W X, Li J N, Wu Y, et al. 2016. Behavior of antibiotics and antibiotic resistance genes in eco-agricultural system: A case study[J]. Journal of Hazardous Materials, 304 : 18–25. DOI:10.1016/j.jhazmat.2015.10.037 |
| [${referVo.labelOrder}] | Cheng W X, Chen H, Su C, et al. 2013. Abundance and persistence of antibiotic resistance genes in livestock farms: a comprehensive investigation in eastern China[J]. Environment International, 61 : 1–7. DOI:10.1016/j.envint.2013.08.023 |
| [${referVo.labelOrder}] | 仇天雷, 高敏, 韩梅琳, 等. 2015. 鸡粪堆肥过程中四环素类抗生素及抗性细菌的消减研究[J]. 农业环境科学学报, 2015, 34(4) : 795–800. DOI:10.11654/jaes.2015.04.027 |
| [${referVo.labelOrder}] | 潘顺昌, 严秀宜潘长庆. 1987. GB7959—1987粪便无害化卫生标准[S]. 北京: 中国标准出版社 |
| [${referVo.labelOrder}] | Kim K R, Owens G, Ok Y S, et al. 2012. Decline in extractable antibiotics in manure-based composts during composting[J]. Waste Management, 32(1) : 110–116. DOI:10.1016/j.wasman.2011.07.026 |
| [${referVo.labelOrder}] | Li L L, Huang L D, Chung R S, et al. 2010. Sorption and dissipation of tetracyclines in soils and compost[J]. Pedosphere, 20(6) : 807–816. DOI:10.1016/S1002-0160(10)60071-9 |
| [${referVo.labelOrder}] | 林辉, 汪建妹, 孙万春, 等. 2016. 磺胺抗性消长与堆肥进程的交互作用[J]. 环境科学, 2016, 37(5) : 1993–2002. |
| [${referVo.labelOrder}] | Liu M, Zhang Y, Yang M, et al. 2012. Abundance and distribution of tetracycline resistance genes and mobile ele ments in an oxytetracycline production wastewater treatment system[J]. Environmental Science & Technology, 46(14) : 7551–7557. |
| [${referVo.labelOrder}] | 孟磊, 杨兵, 薛南东, 等. 2015. 高温堆肥对鸡粪中氟喹诺酮类抗生素的去除[J]. 农业环境科学学报, 2015, 34(2) : 377–383. DOI:10.11654/jaes.2015.02.023 |
| [${referVo.labelOrder}] | Qian X, Sun W, Gu J, et al. 2016. Variable effects of oxytetracycline on antibiotic resistance gene abundance and the bacterial community during aerobic composting of cow manure[J]. Journal of Hazardous Materials, 315 : 61–69. DOI:10.1016/j.jhazmat.2016.05.002 |
| [${referVo.labelOrder}] | Selvam A, Xu D L, Zhao Y Z, et al. 2012. Fate of tetracycline, sulfonamide and fluoroquinolone resistance genes and the changes in bacterial diversity during composting of swine manure[J]. Bioresource Technology, 126(4) : 383–390. |
| [${referVo.labelOrder}] | Su J Q, Wei B, Ou Yang W Y, et al. 2015. Antibiotic resistome and its association with bacterial communities during sewage sludgecomposting[J]. Environmental Science and Technology, 49(12) : 7356–7363. DOI:10.1021/acs.est.5b01012 |
| [${referVo.labelOrder}] | 苏建强, 黄福义, 朱永官. 2013. 环境抗生素抗性基因研究进展[J]. 生物多样性, 2013, 21(4) : 481–487. |
| [${referVo.labelOrder}] | 孙刚, 袁守军, 彭书传, 等. 2010. 固相萃取-高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素、金霉素和四环素[J]. 环境化学, 2010, 29(4) : 739–743. |
| [${referVo.labelOrder}] | Wang J, Ben W W, Zhang Y, et al. 2015. Effects of thermophilic composting on oxytetracycline, sulfamethazine, and their corresponding resistance genes in swine manure[J]. Environmental Sciences Processes & Impacts, 17(9) : 1654–1660. |
| [${referVo.labelOrder}] | 韦蓓, 黄福义, 李虎, 等. 2014a. 污泥堆肥过程中磺胺类和大环内酯类抗性基因的残留[J]. 应用与环境生物学报, 2014a, 20(3) : 395–400. |
| [${referVo.labelOrder}] | 韦蓓, 黄福义, 苏建强. 2014b. 堆肥对污泥中四环素类抗生素及抗性基因的影响[J]. 环境工程学报, 2014b, 8(12) : 5431–5438. |
| [${referVo.labelOrder}] | Wu X, Wei Y, Zheng J, et al. 2011. The behavior of tetracyclines and their degradation products during swine manure composting[J]. Bioresource Technology, 102(10) : 5924–5931. DOI:10.1016/j.biortech.2011.03.007 |
| [${referVo.labelOrder}] | Yu Z, Michel F C, Hansen G, et al. 2005. Development and application of real-time PCR assays for quantification of genes encoding tetracycline resistance[J]. Applied & Environmental Microbiology, 71(11) : 6926–6933. |
| [${referVo.labelOrder}] | 郑宁国, 黄南, 王卫卫, 等. 2016. 高温堆肥过程对猪粪来源抗生素抗性基因的影响[J]. 环境科学, 2016, 37(5) : 1986–1992. |