2017, Vol. 37
[PDF全文]
2. 山西省分析科学研究院, 太原 030006;
3. 忻州师范学院生物系, 忻州 034000
2. Shanxi Academy of Analytical Science, Taiyuan 030006;
3. Biology Department, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000
氯吡嘧磺隆是磺酰脲类除草剂的一种, 其主要作用于杂草乙酰乳酸合成酶, 抑制支链氨基酸合成, 进而造成蛋白质合成受阻.氯吡嘧磺隆具有用药量低、除草效果好的特点, 属于超高效除草剂.此外, 氯吡嘧磺隆在土壤中属于较难吸附的一种除草剂, 吸附系数在不同类型土壤中为5.49~8.71(郭敏等, 2012).因此, 土壤中部分残留的氯吡嘧磺隆易通过自然降水和灌溉等途径污染水源, 同时对水体中非靶标生物产生影响.由地表及地下水的除草剂残留调查结果 (Battagline et al., 2000；Russel et al., 1995) 可知, 水体中含有残留的磺酰脲类除草剂已经引起了人们对该类除草剂环境安全性的广泛关注.氯吡嘧磺隆的水解速率与pH和温度有着密切的关系, 在碱性条件容易降解, 在pH为4、7、9的缓冲溶液中, 水解半衰期分别为8.9、14.6、0.7 d；在温度为25、35、45 ℃时的水解半衰期分别为18.9、10.2、5.9 d (张铎, 2014).根据农药登记资料表明, 氯吡嘧磺隆对浅蓝色大太阳鱼和虹鳟鱼的LC50(96 h) 分别>118 mg·L-1和>131 mg·L-1.
近年来, 氯吡嘧磺隆被引进中国, 广泛用于玉米、小麦和水稻田等杂草的防除.目前, 国内外对氯吡嘧磺隆的研究主要集中在土壤中残留动态、水解、光解、土壤吸附及对后茬作物生长的影响等方面 (钟红舰等, 2011; 张铎等, 2014; 郭敏等, 2012), 而有关该除草剂对鱼类毒性和代谢的影响却鲜见报道.
代谢组学是继基因组学和蛋白组学之后新近发展起来的一门学科, 是系统生物学的重要组成部分.代谢组学主要用于研究内源小分子代谢物与毒性、疾病、生命活动等的相互关系.近年来, 该技术已被用于分析果汁质量 (Spraul et al., 2009), 评价肥料和农药对橘子营养组成的影响 (Bemillon et al., 2013), 环境因素和基因对瓜类水果质量的影响 (Zhang et al., 2012), 喷施代森锰锌对大蒜叶片代谢物的影响 (Pereira et al., 2014), 分析不同地域葡萄和葡萄酒品质差异 (Son et al., 2009), 揭示野生型和转基因型大蒜代谢的不同 (Picone et al., 2011), 评估转基因葡萄品质 (Sobolev et al., 2010), 评价甲基茉莉酸酯缺乏对番茄细胞代谢的影响 (Kausch et al., 2012), 分析卷心菜栽培品种在不同地域的代谢差异 (Kim et al., 2013), 分析长期镉暴露对番茄植物生长和代谢的影响 (Karmakar et al., 2009), 分析含砷污水灌溉对大蒜作物的代谢影响 (Hédiji et al., 2010), 以及分析三叉苦新旧叶片代谢差异 (Beni et al., 2011) 等.此外, 还用于研究农药如去草胺、氯氟氰菊酯、敌敌畏等对鱼类代谢的影响 (Xu et al., 2015; Li et al., 2014; Liu et al., 2015).基于此, 本研究采用代谢组学技术研究氯吡嘧磺隆对斑马鱼肝脏代谢的影响, 以期为氯吡嘧磺隆的环境生物安全性评价和风险评估提供理论依据.
2 材料与方法 (Materials and methods) 2.1 仪器与试剂液相色谱系统配置UltiMate 3000(美国Thermo Fisher公司), 质谱系统为四级杆串联轨道离子阱质谱Q Exactive Orbitrap (美国Thermo Fisher公司), Tracefinder工作站和SIEVE软件, 液相色谱柱Waters AQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), Milli-Q超纯水系统 (美国Milli-pore公司)；氯吡嘧磺隆水分散粒剂 (75%有效成分) 购自江苏省农用激素工程技术研究中心有限公司.
2.2 毒理学试验选取2~3 cm的健康斑马鱼 (AB) 驯化7 d, 至斑马鱼的死亡率低于10%.采用6个体积为10 L的鱼缸, 其中, 对照组和处理组各3个鱼缸, 对照组为清水对照.每个鱼缸中加入斑马鱼20条, 鱼缸中的水为脱去氯气的自来水, pH=7.36, 总硬度为239 mg·L-1, 水中溶解氧为7.2 mg·L-1, 水温25~27 ℃.试验采用半静态水生物测试法, 药液浓度为氯吡嘧磺隆对斑马鱼的亚致死剂量2.4 mg·L-1(1/10 LC50), 为了保证药液的浓度, 每隔24 h更换一次.8 d后, 将试验用斑马鱼断头处理, 取肝脏组织, -80 ℃冰箱保存, 待测.
2.3 样品制备将一定量的肝脏组织用液氮研磨成粉末状, 称取50 mg样品于10 mL离心管中, 加入2 mL的甲醇和水 (1/1, V/V), 超声提取1 h, 4 ℃、4000 r·min-1下离心20 min, 取上清液过0.22 μm的滤膜, 将上述溶液转入进样小瓶中, LC-Q Exactive Orbitrap检测.
2.4 超高效液相色谱质谱条件流动相为0.5%甲酸水溶液 (A) 和甲醇 (B), 梯度洗脱程序为：0~1 min, 95%A；1~6 min, 95%~5%A；6~8 min, 5%A；8~11 min, 5%~95%A；11~14 min, 5%A.柱温40 ℃, 流速0.5 mL·min-1, 进样量10 μL.
离子源为电喷雾电离源 (ESI), 正、负离子模式交替扫描, 扫描模式为Full scan/ddMS2, 扫描范围 (m/z)50~1000 Da；质谱参数：毛细管温度320 ℃, 正离子模式喷雾电压3500 V, 负离子模式喷雾电压2500 V, 鞘气35 arb, 辅助气10 arb, 归一化碰撞能量分别为30、50、70 eV.分辨率Full Scan 70000 FWHM, MS/MS17500 FWHM.
2.5 数据处理采用SIEVE软件对原始数据进行组分提取, 最终获得包括保留时间、质荷比与峰面积的二维数据阵.将数据导入SIMCA-P软件 (version 13.0, Umetrics AB, Umeå, Sweden), 进行数据处理, 建立模式识别模型并提取差异变量, 获得对分组有贡献的变量.采用mzCloud、Human Metabolome Database (HMDB) 多级谱库对代谢物进行鉴定.采用SPSS软件对差异代谢物进行独立样本t检验 (p < 0.01).
3 结果 (Results) 3.1 代谢物定性分析结果通过mzCloud多级谱库和HMDB数据库比对, 共鉴定出斑马鱼肝脏代谢物33种, 其母离子及子离子结果列于表 1.
| 表 1 斑马鱼肝脏代谢物定性分析结果 Table 1 Qualitative analysis results of metabolites in liver of zebra fish |
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为了辨别氯吡嘧磺隆对斑马鱼代谢物的影响, 采用无偏差主成分分析方法 (PCA)、偏最小二乘法判别分析 (PLS-DA) 和S-Plot等对液质联用测定结果进行分析.正离子模式下, 数据预测模型的交叉验证表明, 第一成分 (PC1) 值为57.6%, 第二成分 (PC2) 值为33.1%(图 1a).PCA得分图表明, 对照组和氯吡嘧磺隆处理组之间存在明显的差异 (p < 0.01).对数据进行偏最小二乘法判别分析 (PLS-DA), 经200次建模获得的PLS-DA模型置换验证图 (图 1b), 其中, Q2表示累计交叉有效性, R2表示累计方差值.Q2=0.982, 表明模型具有很强的预测能力.模型有效性的判别如图 1b所示, 置换验证结果中, R2(灰色圆圈) 与真实模型的R2值共同构成的回归线截距为0.193 < 0.4, Q2(黑色方块) 与真实模型的Q2值共同构成的回归线截距为-0.335 < 0.05.
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| 图 1 正离子检测模式下斑马鱼肝脏代谢物的得分图 (a)、验证模型图 (b)、S-Plot载荷图 (c) Fig. 1 Score plot (a), permutation test result for PLS-DA (b) and S-plot (c) of metabolites in liver of zebra fish in positive ion mode |
负离子模式下, 数据预测模型的交叉验证表明, 第一成分 (PC1) 值为70.4%, 第二成分 (PC2) 值为20.4%.PCA得分图表明, 对照组和处理组之间存在明显的差异.对数据进行偏最小二乘辨别判别分析, 经200次建模获得的Q2=0.978, 表明模型具有很强的预测能力.模型有效性的判别如图 2b所示, 置换验证结果中R2(灰色圆圈) 与真实模型的R2值共同构成的回归线截距为0.173 < 0.4, Q2(黑色方块) 与真实模型的Q2值共同构成的回归线截距为-0.317 < 0.05.
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| 图 2 负离子检测模式下斑马鱼肝脏代谢物的得分图 (a)、验证模型图 (b)、S-Plot载荷图 (c) Fig. 2 Score plot (a), permutation test result for PLS-DA (b) and S-plot (c) of metabolites in liver of zebra fish in negative ion mode |
典型的S-Plot (权重变量与皮尔逊相关系数) 载荷图见图 1c、2c, 图中显示了造成2个处理组差异的代谢物.从图中可以看出, 肌酸酐、牛磺酸、多巴胺和5-b胆甾醇硫酸酯是处理组与对照组差异最大的代谢物.其中, 对照组代谢物多巴胺和5-b胆甾醇硫酸酯的含量显著低于氯吡嘧磺隆处理组 (p < 0.01), 而肌酸酐和牛磺酸含量显著高于处理组 (p < 0.01).
对差异代谢物进行相对定量, 相对定量是依据每个代谢物的平均峰面积, 这些值来源于SIEVE软件对数据的处理结果.为了进一步证实多元统计的结果, 对S-Plot挑选出的代谢物峰面积采用SPSS软件进行独立样本t-检验, 发现检验得出空白对照组和氯吡嘧磺隆处理组之间的4种代谢物存在明显的差异 (图 3).
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| 图 3 差异代谢物相对定量t-检验结果 (**代表显著性差异 (p < 0.01)) Fig. 3 Relative quantification graphs of contributing metabolites based on HPLC-MS-MS (**Statistically significant, p < 0.01) |
采用高分辨液质联用作为主要技术手段, 研究发现, 氯吡嘧磺隆处理组肌酸酐和牛磺酸含量显著下降, 多巴胺和胆甾醇硫酸酯含量显著上升.
血清肌酸酐的含量变化是用于快速评估肾脏功能的方法之一, 此外, 肌酸酐清除率也可用于肝脏功能障碍快速诊断.肝功能障碍会导致肌酸酐产生率降低40%~60% (Cocchetto et al., 1983; Papadakis et al., 1987; Lam et al., 1999).本研究中, 斑马鱼受到氯吡嘧磺隆胁迫后, 肝脏内肌酸酐含量显著下降, 表明斑马鱼肝脏代谢受到影响, 肝功能出现障碍.
牛磺酸是公认的动物受胁迫影响的代谢物之一 (Schaffer et al., 2010).牛磺酸是一种含硫氨基酸, 虽不能参与肽段的合成, 但仍在动物体内起着关键作用.动物肝脏、肾脏、心脏等器官中含有大量的牛磺酸, 它参与多种生理代谢, 特别是作为神经递质与胆汁酸共同阻止氧化损伤和中毒胁迫 (Milakofsky et al., 1985).此外, 牛磺酸还可以控制肌肉代谢和基因表达, 但其作用机制尚不明确 (De Luca et al., 2015), 其在肝脏中合成和运输, 主要通过半胱氨酸亚磺酸途径 (De Luca et al., 2015).肝脏疾病和运动均能造成实验动物牛磺酸含量下降 (Miyazaki et al., 2014).本研究中, 斑马鱼肝脏中牛磺酸含量显著下降, 表明氯吡嘧磺隆会影响斑马鱼肝脏代谢.
多巴胺参与调控动物的多种生理反应和行为过程 (Wu et al., 2013), 如学习、认知、运动和抉择等.有关多巴胺在昆虫神经系统和外周神经系统的分布及参与多种生理活动的研究已有报道 (Mustard et al., 2005), 而其在肝脏组织中的含量变化及与肝脏代谢的关系尚不明确.本研究中, 亚致死剂量的氯吡嘧磺隆胁迫导致斑马鱼体内多巴胺含量显著上升, 结合对斑马鱼在试验期间的行动异常、游动缓慢和身体褪色等现象, 表明其含量的变化可能影响斑马鱼的运动.
胆甾醇硫酸酯是一种具有抗肿瘤活性的物质 (黄上峰等, 2008), 国内外对5-b胆甾醇硫酸酯的研究尚未见报道.本研究发现, 氯吡嘧磺隆处理组中5-b胆甾醇硫酸酯含量显著上升, 这种含量变化对斑马鱼的影响机制尚不明确, 有待进一步研究, 但作为主要差异代谢物值得关注.
5 结论 (Conclusions)亚致死剂量的氯吡嘧磺隆暴露8 d, 斑马鱼肝脏的多种代谢物包括氨基酸、糖、有机酸等含量均发生变化, 其中, 4种代谢物含量变化最为显著.这表明4种代谢物可作为亚致死剂量氯吡嘧磺隆对肝脏代谢异常的指标.
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