1 引言 (Introduction)

邻苯二甲酸酯 (Phthalic Acid Esters, PAEs) 是一类典型的内分泌干扰物, 部分邻苯二甲酸酯化合物被美国环保局和我国环境监测总站列为优先控制污染物 (Wang et al., 2013).作为重要的化工产品, 邻苯二甲酸酯在塑料制品生产过程被作为添加剂大量使用 (Zeng et al., 2008).我国设施农业的快速发展使塑料制品被广泛应用, 随着塑料的老化邻苯二甲酸酯会缓慢释放并最终进入土壤, 导致其成为农田土壤中最常被检出的有机污染物之一 (He et al., 2015; 王凯荣等, 2013), 尤其在北方设施菜地 (王丽霞, 2007)、南方菜园 (蔡全英等, 2005; 杨国义等, 2007; 关卉等, 2007; 赵胜利等, 2009) 土壤中邻苯二甲酸酯含量甚至已经达到几十mg·kg^-1, 由此可能引发的农产品质量安全以及人体健康风险备受国内学者的关注 (汪军等, 2013; 李彬等, 2016).

作为一种重要的油料作物, 花生 (Arachis hypogaea) 的种植在我国多采用地膜覆盖方式, 长期的地膜残留导致农田土壤已经遭到不同程度的邻苯二甲酸酯污染 (崔明明等, 2013; Chai et al., 2014).已有调查发现, 山东省花生主产区土壤中6种邻苯二甲酸酯浓度为0.34~2.81 mg·kg^-1, 其中, 邻苯二甲酸二丁酯 (Dibutyl Phthalate, DBP) 和邻苯二甲酸二 (2-乙基己基) 酯 (Di-(2-ethylhexyl Phthalate, DEHP) 为主要的污染物组分, 检出率均为100%, 2者之和占ΣPAEs含量98.0%(崔明明等, 2013), 部分种植区土壤中DBP和DEHP浓度甚至高达13.01 mg·kg^-1和35.77 mg·kg^-1(张海光等, 2013).另外, 由于花生籽粒脂肪含量高, 对疏水性有机污染物可能具有更强的生物富集性, 因此, 花生种植面临潜在的邻苯二甲酸酯污染风险.目前, 少量相关研究工作主要集中于花生邻苯二甲酸酯污染水平的调查, 关于花生对邻苯二甲酸酯吸收累积方面的研究报道仍十分有限.本文选择DBP和DEHP作为目标污染物, 通过盆栽试验考察邻苯二甲酸酯污染对花生产量的影响以及花生吸收累积邻苯二甲酸酯的特征, 旨在为长期覆膜条件下花生邻苯二甲酸酯污染风险评估提供科学依据.

2 材料与方法 (Materials and methods) 2.1 实验材料

供试土壤:采自青岛市即墨花生种植区0~20 cm表层土壤, 自然风干, 挑选出石块、植物体等杂物后过2 mm筛待用.土壤的基本理化性质为:pH值5.63, 有机质12.46 g·kg^-1, 碱解氮64.22 mg·kg^-1, 速效磷30.25 mg·kg^-1, 速效钾289.90 mg·kg^-1, DBP和DEHP的背景含量分别为2.81 mg·kg^-1和1.86 mg·kg^-1.

污染土壤制备:参考曾巧云等 (2006)、Li等 (2014)的方法, 将一定量DBP/DEHP (质量比1：1) 溶于丙酮溶剂中, 配成总浓度为10 g·L^-1的丙酮溶液.将DBP/DEHP丙酮溶液按设计的污染水平添加到供试土壤中, 待丙酮彻底挥发干净后, 充分混匀, 施加底肥N (尿素) 200 mg·kg^-1、P₂O₅(过磷酸钙) 150 mg·kg^-1、K₂O (硫酸钾) 200 mg·kg^-1, 用蒸馏水调至田间持水量的70%, 5 d后进行粉碎、混匀和装盆.盆栽时取土壤样品分析DBP和DEHP的初始含量, 污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ处理土壤中DBP含量分别为34.62 mg·kg^-1和73.91 mg·kg^-1, DEHP含量分别为38.47 mg·kg^-1和77.56 mg·kg^-1.

供试花生品种为青花7号和青花5号, 由青岛农业大学农学与植物保护学院提供.2个品种具有单株生产力高、丰产性好、适应性广的特点.

2.2 盆栽试验

实验地点在青岛农业大学教学实习基地, 采用300 mm×300 mm (内径×高) 的陶制花盆, 每盆装土15 kg (风干重).在综合考虑我国农田土壤邻苯二甲酸酯污染水平的基础上, 参考曾巧云等 (2005)、宋广宇等 (2010)的实验方案, 设置3个复合污染水平, 即空白对照、污染水平Ⅰ (DBP/DEHP 40 mg·kg^-1)、污染水平Ⅱ (DBP/DEHP 80 mg·kg^-1), 每个处理设3次重复, 随机区组排列.

选用籽粒饱满、大小一致的花生种子, 催芽后选出芽整齐大体一致的种子播种 (2014.05.29), 每盆3穴, 每穴2粒种子, 出苗后进行间苗、补苗, 保证每盆3穴、每穴一株花生.花生生长过程不再施肥且不使用农药, 定期浇水, 待花生成熟 (2014.09.28), 每盆花生分根、茎、叶、荚果采集, 先用自来水冲洗, 再用蒸馏水冲洗并用滤纸吸水后60 ℃烘干样品, 粉碎保存待测; 土壤样品进行风干、过筛处理后, 保存待测.

2.3 测定方法 2.3.1 土壤样品的前处理

参照王明林 (2007)的方法, 准确称取土壤样品5.00 g于250 mL锥形瓶中, 加入提取液丙酮：石油醚 (V/V=1/3) 90 mL, 超声处理30 min, 砂芯漏斗抽滤, 用90 mL提取液充分洗涤锥形瓶及砂芯漏斗内壁, 滤液和洗涤液合并收于圆底烧瓶中, 35 ℃低压旋转蒸发浓缩至3~5 mL; 用玻璃层析柱 (1.2 cm×30 cm) 依次加入4 g无水硫酸钠、6 g弗罗里硅土和4 g无水硫酸钠, 先用淋洗液石油醚：乙醚 (V/V=10/0.4) 10 mL预洗柱子, 弃去淋洗液, 再用石油醚：乙醚 (V/V=10/3) 90 mL洗涤圆底烧瓶, 收集全部洗脱液于鸡心瓶, 35 ℃低压旋转蒸发浓缩至干后用甲醇定容至1.5 mL, 待测.

2.3.2 植物样品的前处理

参照崔明明等 (2013)的方法, 准确称取植物干样0.50 g于150 mL锥形瓶中, 加入提取液乙酸乙酯40 mL, 超声处理30 min, 砂芯漏斗抽滤, 用30~40 mL提取液充分洗涤锥形瓶及砂芯漏斗, 滤液和洗涤液合并收于圆底烧瓶中, 35 ℃低压旋转蒸发浓缩至1 mL左右.先用石油醚10 mL淋洗柱子 (同上), 弃去淋洗液, 加入样品浓缩液, 用60~70 mL石油醚洗涤圆底烧瓶, 通过层析柱收集洗脱液于鸡心瓶中, 35 ℃低压旋转蒸发浓缩至干后用甲醇定容至1.5 mL, 待测.

2.3.3 液相色谱测定条件

采用岛津液相色谱 (LC20A), 色谱柱Intersil ODS-SP (4.6 mm×150 mm, 5 μm), 流动相为甲醇/水, 总流速为0.8 mL·min^-1, 梯度洗脱程序为:初始 (甲醇70%), 0~25 min (甲醇70%~100%), 25~33 min (甲醇100%), 33~40 min (甲醇70%), 自动进样, 进样量20 μL, 柱温箱恒温32 ℃, 检测器波长228 nm, 保留时间分别为DBP (13.79 min)、DEHP (27.07 min).

2.3.4 质量控制

试验过程中避免使用任何塑料制品; 玻璃仪器经铬酸洗液浸泡过夜, 用蒸馏水洗涤和有机溶剂淋洗后烘干备用; 硅藻土、无水硫酸钠和弗罗里硅土经高温处理后备用.通过向土壤和植物样品中分别添加0.1、1.0和10.0 mg·kg^-1的邻苯二甲酸酯标液进行添加回收率试验, 样品回收率均在81.7%~118.9%之间, 符合微量分析的要求.在样品分析过程中, 每个样品前处理过程均加入回收率指示物苯甲酸苄酯, 回收率均在75%~120%之间.

2.4 统计分析方法

采用SPSS21.0对数据进行统计分析, 用最小显著极差法 (LSD) 进行平均数显著性检验; 采用Origin9.0作图.

3 结果与分析 (Results and analysis) 3.1 邻苯二甲酸酯污染对花生植株生物量的影响

表 1为邻苯二甲酸酯污染对花生植株生物量的影响.由表可以看出, 土壤邻苯二甲酸酯污染使花生根、茎、叶、籽粒的生物量均有所下降.对于青花7号, 污染水平Ⅰ下花生根、茎、叶和籽粒的生物量分别比空白对照减少9.48%、21.92%、9.45%、14.76%, 污染水平Ⅱ下花生根、茎、叶和籽粒的生物量分别比空白对照减少11.10%、12.85%、19.29%、10.03%, 但除茎外均未表现出显著差异; 对于青花5号, 污染水平Ⅰ下花生根、茎、叶和籽粒的生物量分别比空白对照显著减少23.90%、37.52%、33.95%、24.11%, 污染水平Ⅱ下花生根、茎、叶和籽粒的生物量分别比空白对照显著减少49.88%、64.61%、60.04%、48.75%.与青花7号相比, 青花5号花生产量受土壤邻苯二甲酸酯污染的影响显著.

3.2 花生植株不同部位的邻苯二甲酸酯含量

表 2和表 3分别为花生植株不同部位的DBP和DEHP含量.由表可以看出, 2个品种花生植株不同部位的DBP和DEHP含量随土壤中邻苯二甲酸酯污染水平的增加均呈现显著升高趋势.在污染水平Ⅱ下, 青花7号花生籽粒中DBP和DEHP含量分别为空白对照的11.58倍和10.31倍, 而青花5号花生籽粒中DBP和DEHP含量分别为空白对照的8.10倍和6.91倍.通过进一步方差分析发现, 在相同的污染水平下, DBP和DEHP在花生植株不同部位的含量存在显著性差异 (p < 0.05), 其中, 花生根系DBP和DEHP含量最高, 显著高于茎、叶、果荚和籽粒.利用t-检验对相同处理条件下2个品种花生邻苯二甲酸酯含量进行对比分析发现, 在污染水平Ⅰ条件下, 花生各部位DBP和DEHP含量在2个品种之间无显著差异, 但在污染水平Ⅱ条件下, 花生根、果荚和叶DBP含量以及叶DEHP含量在2个品种之间有显著差异 (p < 0.05).

3.3 邻苯二甲酸酯在花生植株的累积总量及其分布特征

邻苯二甲酸酯在花生中的累积总量即各部位含量与其生物量的乘积之和.不同污染水平下花生植株邻苯二甲酸酯累积总量见图 1.由图可以看出, 青花7号花生植株DBP和DEHP累积总量随着污染水平的增高而显著升高, 在污染水平Ⅱ下DBP和DEHP累积总量高达0.406 mg·pot^-1和0.419 mg·pot^-1, 分别为空白对照的2.35倍和3.30倍; 青花5号花生植株DBP和DEHP累积总量在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下无显著差异, 但均显著高于空白对照 (p < 0.05).

由图还可以看出, 在空白对照和污染水平Ⅰ下, 青花7号和青花5号对邻苯二甲酸酯的累积总量无显著差异, 但在污染水平Ⅱ下, 青花7号花生植株对DBP和DEHP的累积总量显著高于青花5号 (p < 0.05).

花生植株不同部位DBP和DEHP累积量占整个植株累积总量的百分比如表 4所示.由表可以看出, 空白对照处理DBP和DEHP主要在花生茎叶中累积, 青花7号和青花5号茎叶中DBP累积量分别占植株累积总量的56.85%和64.93%, DEHP累积量分别占植株累积总量的58.20%和68.01%;在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下, DBP和DEHP主要在籽粒中累积, DBP和DEHP累积量占花生植株累积总量的比例分别介于28.79%~37.03%和29.09%~36.75%之间, 土壤中邻苯二甲酸酯污染水平越高则籽粒中DBP和DEHP累积量占植株累积总量的比例越高.

3.4 土壤中邻苯二甲酸酯的残留特征

盆栽花生后土壤中邻苯二甲酸酯残留量如图 2所示.与盆栽前土壤中邻苯二甲酸酯的初始含量相比, 不同处理2个品种花生盆栽后土壤中DBP、DEHP含量均有所降低, 但在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下土壤中DBP和DEHP残留量仍显著高于空白对照 (p < 0.05).

在空白对照土壤中DBP和DEHP残留量差异不显著, 但在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下青花7号土壤中DEHP残留量分别为2.85 mg·kg^-1和3.84 mg·kg^-1, 青花5号土壤中DEHP残留量分别为2.17 mg·kg^-1和3.20 mg·kg^-1, 均显著高于DBP (p < 0.05), 表明DEHP较DBP更容易在土壤中残留.

对于DBP来说, 不同处理2个品种花生盆栽后土壤中残留量无显著差异; 对于DEHP来说, 在空白对照中青花7号和青花5号盆栽后土壤中含量无显著差异, 但在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下青花7号土壤中残留量显著高于青花5号 (p < 0.05).

3.5 花生籽粒对邻苯二甲酸酯的生物富集作用

花生籽粒对邻苯二甲酸酯的生物富集系数 (Bioaccumulation factors, BAFs) 指花生籽粒中邻苯二甲酸酯含量与土壤中残留的邻苯二甲酸酯浓度的比值.表 5为花生籽粒对邻苯二甲酸酯的生物富集系数.由表可以看出, 花生籽粒对DBP和DEHP的富集系数分别介于0.50~1.87和0.53~0.98之间.在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下, 花生籽粒对DBP的富集系数均大于1且高于空白对照, 同一品种花生籽粒对DBP的富集系数高于DEHP.

4 讨论 (Discussion)

作为农田土壤中普遍存在的一类有机污染物, 邻苯二甲酸酯污染会抑制植物种子萌发并阻碍植物生长 (Zhang et al., 2014; Ma et al., 2013).由于我国设施菜地土壤的邻苯二甲酸酯污染水平较高, 多数学者的研究对象为蔬菜, 而对于大田作物的研究相对较少.大量研究证实, 当土壤中邻苯二甲酸酯达到一定污染水平时, 辣椒 (尹睿等, 2002)、番茄 (尹睿等, 2004)、蕹菜 (尹睿等, 2004)、胡萝卜 (尹睿等, 2004)、油菜 (周佳佳, 2013)、黄瓜 (杜娜, 2014) 均会出现产量下降, 甚至会影响果实的品质.本文的研究对象选择两个品种的花生, 发现土壤DBP/DEHP污染对青花7号的生物量无显著影响, 但青花5号的生物量随污染水平升高却显著减少, 表明不同花生品种对邻苯二甲酸酯污染胁迫的适应能力有所不同, 杨子江等 (2013)也发现不同品种水稻对邻苯二甲酸酯胁迫的响应存在差异.这些研究结果说明控制土壤中邻苯二甲酸酯残留量和筛选种植抗性强的品种是避免作物产量遭受邻苯二甲酸酯污染影响的有效途径.

已有研究证实, 覆膜种植模式下花生籽粒中ΣPAEs含量显著高于露地种植模式, 而且DEHP和DBP在花生籽粒中占ΣPAEs的百分比、检出率均较高 (崔明明等, 2013).本研究通过盆栽试验对不同污染水平下花生植株吸收累积DBP和DEHP的特征进行了初步分析, 发现花生植株的邻苯二甲酸酯含量和富集总量随土壤污染程度的增加显著升高, 表明花生会通过不同的途径吸收富集邻苯二甲酸酯.DBP和DEHP均为水溶性较低的邻苯二甲酸酯类化合物, 较难被植物降解或代谢, 容易累积在植物根系或茎叶部位 (曾巧云等, 2006).大量研究也证实, 植物体内DBP和DEHP的含量与土壤污染浓度呈正相关关系 (蔡全英等, 2004; 宋广宇等, 2010), 但植物对土壤中邻苯二甲酸酯的吸收途径既包含植物根系直接吸收土壤水溶液中的邻苯二甲酸酯, 也有部分为植物茎叶吸收土壤表层空气中的邻苯二甲酸酯 (杨杉等, 2016).在不同的环境条件下, 不同植物的吸收途径明显不同 (甘家安等, 1996; 刘文莉等, 2010).国内外学者尚未开展过花生对邻苯二甲酸酯的吸收途径研究, 本实验发现DBP和DEHP在花生植株不同部位的含量存在显著差异, 根系DBP和DEHP含量显著高于其他部位, 说明花生对邻苯二甲酸酯的吸收可能主要通过根系途径, 而根系吸收运移也是菜心与萝卜茎叶中DBP和DEHP的主要来源途径 (曾巧云等, 2005; 曾巧云等, 2006).在盆栽试验中, 少量DBP和DEHP也会从表层土壤中挥发出来对花生植株进行短期的熏蒸, 但挥发过程主要集中于实验前期, 花生植株茎叶生物量很小, 对邻苯二甲酸酯的吸收量有限, 而后期花生植株对邻苯二甲酸酯的吸收则主要来自土壤, 因此, 茎叶中邻苯二甲酸酯的累积可能主要通过根系吸收向地上部转运.同一种作物不同品种对邻苯二甲酸酯的转运能力存在差异 (Cai et al., 2015).Zhao等 (2015)在对不同品种的菜心吸收累积邻苯二甲酸酯的研究中发现, 低累积品种的菜心根部细胞壁和细胞器中DBP和DEHP含量高于地上部, 而且具有更小的转运系数.在本实验中污染水平Ⅱ条件下, 花生叶中DBP和DEHP含量在2个品种之间所表现出来的显著差异可能与不同品种花生对邻苯二甲酸酯的转运能力强弱有关.通过对花生植株不同部位邻苯二甲酸酯富集量进行分析发现, 在空白对照中花生茎叶中DBP和DEHP富集量较高, 而在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下花生籽粒中DBP和DEHP富集量占植株富集总量的比例最高, 作为花生的可食部位, 籽粒的高富集会增加邻苯二甲酸酯通过食物链威胁人体健康的风险.

花生种植后土壤中邻苯二甲酸酯残留量大幅下降, 通过对土壤中DBP和DEHP的平衡分析发现, 在不同的污染水平下, 花生植株对DBP和DEHP的累积总量占施入量的比例分别介于0.025%~0.34%和0.020%~0.51%之间, 与Li等 (2014)的11种作物吸收累积DEHP研究结果 (0.028%~0.30%) 类似, 表明植物吸收并非土壤中邻苯二甲酸酯去除的主要途径, 而微生物降解可能发挥着关键作用 (安琼, 1999; Xie et al., 2010). DBP的分子摩尔质量 (278.4 g·mol^-1) 和logK_ow (4.45, K_ow为辛醇-水分配系数) 均小于DEHP (分别为390.6 g·mol^-1、7.50), 而水溶解度 (11.2 mg·L^-1) 高于DEHP (0.003 mg·L^-1)(Stales et al., 1997), 导致其微生物利用率相对较高, 降解速率较快, 表现为土壤中DBP的残留量显著低于DEHP.在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下青花7号土壤中DEHP残留量显著高于青花5号可能是由于邻苯二甲酸酯的生物降解与土壤环境条件有关, DEHP的降解速率对环境因素的敏感度要大于DBP (安琼等, 1999).陈桐等 (2015)研究发现, 水稻根系分泌物中低分子有机酸受到邻苯二甲酸酯胁迫后质量浓度会发生变化, 而且不同品种之间有显著差异.低分子量有机酸可以调节根系环境pH值、菌群活性以及一些金属阳离子的浓度, 对有机污染物生物有效性有促进作用 (Bais et al., 2006; Gao et al., 2015).在邻苯二甲酸酯污染胁迫下, 青花7号和青花5号的生物量存在显著差异, 花生根系分泌物的浓度和组成也可能会发生差异性的变化, 从而影响土壤中邻苯二甲酸酯的有效性和微生物活性, 最终导致不同品种花生种植土壤中DEHP残留量差异显著.

生物富集系数是描述邻苯二甲酸酯在花生籽粒累积趋势的重要指标.在本实验中, 随着土壤污染水平的升高, 花生籽粒对DBP和DEHP的富集系数均有不同程度的增高, 在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下花生籽粒对DBP的富集系数介于1.11~1.87, 高于珠三角地区谷粒对DBP富集系数 (鲁磊安等, 2016), 花生籽粒对DEHP的富集系数水平与谷粒相当, 但与蔬菜对DBP和DEHP的富集系数相比, 花生的富集系数明显高于蔬菜 (Mo et al., 2009; Cai et al., 2008), 表明邻苯二甲酸酯具有较强的生物有效性, 易于被高脂肪含量的花生籽粒吸收富集.本研究还发现, 花生籽粒对DBP的富集系数显著高于DEHP, 与李彬等 (2015)和吴山等 (2015)对南方蔬菜产区土壤-蔬菜中邻苯二甲酸酯污染分布特征的调查结果相似, 魏丽琼等 (2016)在研究甜菜-牧草体系对土壤中4种邻苯二甲酸酯的修复效果时也发现植物茎叶对DBP的富集系数明显高于DEHP, 这可能是由于理化性质差异导致DBP生物可利用性高, 植物对DBP的吸收能力较DEHP强 (Yin et al., 2003).结合前面花生对邻苯二甲酸酯富集量的分析结果, 花生植株DBP和DEHP累积总量中籽粒所占比例最高, 鉴于在我国某些污灌区、工业区、电子废弃物回收区土壤中邻苯二甲酸酯浓度已经接近本实验设计污染水平, 一旦在类似地区种植花生, 籽粒受到邻苯二甲酸酯污染引发食品安全问题的风险较高.

5 结论 (Conclusions)

1) 土壤邻苯二甲酸酯污染对青花7号花生生物量无显著影响, 而青花5号花生生物量则显著降低, 在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下花生籽粒产量分别下降24.11%和48.75%.

2) 随着土壤中邻苯二甲酸酯污染水平的增高, 花生植株各部位DBP和DEHP含量均呈现显著升高趋势; 在不同的污染水平下, 花生根系DBP和DEHP含量显著高于其它部位; 在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下花生籽粒对DBP和DEHP的富集量占植株富集总量的比例最高.

3) 花生种植后土壤中邻苯二甲酸酯残留量均有明显降低, 在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下土壤中DBP和DEHP残留量仍显著高于空白对照且DEHP残留量显著高于DBP.

4) 花生籽粒对DBP和DEHP的生物富集系数分别介于0.50~1.87和0.53~0.98, 在污染水平Ⅰ和污染水平Ⅱ下花生籽粒对DBP的富集系数均高于对DEHP的富集系数.

致谢: 本论文感谢青岛农业大学农学与植物保护学院赵长星教授提供的花生种子.