2017, Vol. 37
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JIN Zhinong, E-mail: znjin@nit.edu.cn
土壤作为生态系统的重要组成部分, 是农业发展的物质基础, 也是人类及其它生物生存不可替代的环境资源, 其质量直接关系到人类社会发展的前景 (周际海等, 2015).近年来, 由于我国工农业和城市化的高速发展, 石油原油成为推动社会进步不可或缺的能源, 但大规模、频繁的石油原油开发和生产活动 (王旭辉等, 2012), 加之环境保护意识不强, 污染控制修复技术缺乏, 使得我国土壤石油原油污染及危害程度远高于发达国家, 且污染呈逐年累积加重态势 (Liu et al., 2010).石油原油中除含有大量有机污染物以外, 还含有镉、铅、铜、铬、汞等重金属物质.此外, 矿产资源的大量开采、工业“三废”、农药和化肥的广泛施用, 使得大量含有重金属的污染物排放量与日俱增 (毛雪飞等, 2015), 重金属污染也日益加剧.实际上, 石油原油和重金属往往是同时存在于土壤环境中的两种环境污染物 (Nadal et al., 2011), 且土壤系统中污染物之间多具有伴生性和综合性, 即有机与无机污染复合污染更为常见 (杨文弢等, 2016；兰翔等, 2016).当两种污染同时存在时, 对环境的危害更加复杂.因此, 有机与无机复合污染问题已引起国内外学者的高度关注 (黄荣霞等, 2016).
土壤微生物和酶在有机质转化、利用与有机废弃物的降解, 以及无机物质氧化还原等代谢过程中起重要作用 (李君剑等, 2015), 参与着土壤系统的形成和演变.许多研究表明, 土壤微生物活性是反映土壤受污染程度的敏感指标, 也是衡量土壤生产力的重要参数 (段雄伟等, 2014；马恒亮等, 2009).国内外就有机或无机等单一污染物对土壤微生物活性的影响已进行了广泛研究 (Garcia et al., 2013；Saha et al., 2013).但目前对于有机与无机复合污染与土壤微生物活性关系的报道还较少.因此, 本研究选取石油原油和铅镉两类典型污染物为代表, 通过研究石油原油、铅镉及其复合污染条件下, 土壤基础呼吸、土壤微生物量碳、土壤FDA水解酶、脱氢酶、脲酶及过氧化氢酶等生物学指标的变化, 探究石油原油及铅镉复合污染对土壤微生物生态功能的影响, 以期为有机和无机复合污染土壤的修复提供理论依据.
2 材料与方法 (Materials and methods) 2.1 供试材料 2.1.1 供试土壤采自南京雨花台区板桥镇长江南岸冲积地的潮土 (土壤质地分类为砂质壤土), 种植制度为稻麦轮作, 土壤取样深度为0~20 cm, 鲜土采集后, 剔除石块、大中型土壤动物及根茬等残体, 采集的土壤风干后过2 mm筛, 4 ℃下保存.土壤基本理化性质如下：pH 6.43, 有机碳10.87 g·kg-1, 全氮0.89 g·kg-1, 硝态氮27.17 μg·kg-1, 铵态氮5.42 μg·kg-1.
2.1.2 污染土壤的制备模拟土壤石油原油、铅、镉污染水平的选定是依据中国《土壤环境质量标准》(GB15618-2008) 土壤环境质量农田污染第二级标准值来设定的.考虑到土壤污染的实际情况, 石油原油、铅镉的污染浓度均高于污染第二级标准值, 且铅镉污染相对更为严重, 故选定污染浓度石油原油为1000 mg·kg-1(二级标准值的2倍), 铅为500 mg·kg-1(二级标准值的10倍), 镉为50 mg·kg-1(二级标准值的100倍).为了使供盆栽试验用的模拟污染土壤充分均匀, 试验采取如下3个步骤将石油原油、铅 (PbCl2·4H2O) 及镉 (CdCl2) 与土壤混合：①先用200 mL丙酮溶解试验所需要的石油原油, 用去离子水溶解实验所需的铅、镉, 然后分别加入到1000 g土壤中, 充分搅拌均匀, 为第一母体污染土壤；②待第一母体污染土壤中丙酮挥发干后, 再分别加入到3份1000 g土壤中, 充分搅拌, 放置1 d, 为第二母体污染土壤；③然后将第二母体污染土壤再加入到另外3份预先称好的土壤中, 使石油原油、铅、镉的浓度达到上述试验处理要求, 在干净的塑料袋内放置7 d, 期间每天混合1次, 最后分装到带有底盘的塑料盆 (上缘直径为10 cm, 底面直径8 cm, 高12 cm) 中, 每盆装200.0 g土壤 (烘干计), 室内室温黑暗放置平衡1周后使用.
2.1.3 化学试剂PbCl2、CdCl2·4H2O等所用试剂均为分析纯.石油原油来源于中国石化金南油田, 其基本理化性质为：地面相对密度为871.4 kg·m3(25 ℃), 地面黏度为18.7 mPa·s (60 ℃), 凝固点为26.8 ℃, 蜡质含量为24.7%, 胶质、沥青质总含量为8.4%.
2.2 试验设计与方案试验设置4个处理, 即新鲜土壤 (S)、新鲜土壤+1000 mg·kg-1石油原油污染 (SP)、新鲜土壤+500 mg·kg-1铅污染+50 mg·kg-1镉污染 (SH)、新鲜土壤+1000 mg·kg-1石油原油污染+500 mg·kg-1铅污染+50 mg·kg-1镉污染 (SPH).室内培养条件为：光照与黑暗各12 h·d-1, 室内昼夜温度为30 ℃/20 ℃, 温差变化为±2 ℃, 进行为期80 d的培养试验, 于第0、10、20、40和80 d后进行破坏性采样, 每个处理随机取3个盆钵作为3个重复, 供分析土壤微生物活性等相关指标, 每隔一天称重将盆栽土壤含水率调节为土壤饱和含水率的60%左右.
2.3 测定方法土壤基础呼吸采用碱吸收法测定, 以24 h后每克土释放的CO2质量 (mg) 来表示 (mg·g-1·d-1)(鲁如坤, 2000).土壤脲酶活性测定采用苯酚-次氯酸钠比色法, 以24 h后每克土生成的NH3-N来表示 (mg·g-1·d-1)(关松荫, 1986)；土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法, 以每小时每克土消耗的KMnO4量来表示 (mL·g-1·h-1)(关松荫, 1986)；土壤脱氢酶活性测定采用氯化三苯基四氮唑 (TTC) 还原法, 以24 h后每克干土中TTC的还原产物三苯甲臜 (TPF) 的生成量表示 (μg·g-1·d-1)(关松荫, 1986)；土壤FDA水解酶活性测定采用优化的荧光素双乙酸酯 (FDA) 水解方法测定, 以每小时每克土荧光素的生成量表示 (μg·g-1·h-1)(关松荫, 1986)；土壤微生物量C的测定采用CHCl3熏蒸-K2SO4浸提法, 浸提液中的微生物量碳采用TOC仪分析测定 (韩桂琪等, 2010).
2.4 数据分析采用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2013软件对数据进行统计分析并作图.
3 结果与分析 (Results and analysis) 3.1 石油原油、铅镉及其复合污染对土壤基础呼吸的影响研究表明, 在培养期内各处理土壤基础呼吸大体呈逐渐下降后趋于平稳的变化趋势 (图 1).第0 d时, 土壤呼吸强度表现为SH > SP > SPH > S, 与对照 (S) 相比, SH、SP、SPH处理土壤基础呼吸强度分别增加约100.99%、36.61%、17.02%, SH处理与其他处理之间土壤呼吸强度差异显著 (p < 0.05), S、SP、SPH处理之间无显著差异；第10 d时, 土壤呼吸强度表现为SH > SPH > SP > S, 与对照相比, SH、SPH、SP处理土壤基础呼吸强度分别增加约67.34%、25.80%、15.29%, SH处理与其他处理之间土壤呼吸强度差异显著, S、SP、SPH处理之间无显著差异；第20~80 d, 除SP处理外 (第40 d时), 土壤基础呼吸在各处理间无显著性差异.
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| 图 1 石油原油、铅镉及其复合污染对土壤基础呼吸的影响 (不同字母表示处理间存在显著差异 (p < 0.05), 下同) Fig. 1 Effect of oil, lead, cadmium and their combined contaminations on soil basal respiration (The data with different letters are significant differences at p < 0.05 level, the same below) |
从图 2可以看出, 不同处理的土壤微生物量碳均随着培养时间的增加呈先上升后下降的趋势.第0 d时, 土壤微生物量碳在各处理间均无显著差异.第10 d时, 土壤微生物量碳含量表现为SP > S > SPH > SH, 与对照 (S) 相比, SP处理土壤微生物量碳增加约16.37%, SPH、SH处理土壤微生物量碳减少约8.02%和25.04%, SP与SH、SPH处理间及SH与S处理间土壤微生物量碳差异显著 (p < 0.05), 其它处理间土壤微生物量碳无显著性差异.第20 d和40 d时, 土壤微生物量碳含量均表现为SP > SPH > SH > S, 污染处理的土壤微生物量碳均比对照 (S) 明显增加.第20 d时, SP、SPH、SH处理土壤微生物量碳分别增加了约90.25%、42.62%、29.25%, SP处理土壤微生物量碳显著高于其他3个处理, SPH处理土壤微生物量碳显著高于对照处理, SPH与SH之间、SH与S之间无显著性差异.第40 d时, SP及SPH处理的土壤微生物量碳显著高于对照处理, SP与SPH之间、SH与其它处理之间土壤微生物量碳无显著差异；第80 d时, SH处理土壤微生物量碳显著低于其它处理 (p < 0.05), 其它处理之间无显著差异.
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| 图 2 石油原油、铅镉及其复合污染对土壤微生物量碳的影响 Fig. 2 Effect of oil, lead, cadmium and their combined contaminations on soil microbial biomass C |
由图 3可以看出, 随培养时间的增加, 各处理间微生物呼吸熵大体表现为先下降后趋于平稳的趋势.第0 d时, 微生物呼吸熵表现为SH > SP > SPH > S, 与对照 (S) 相比, SH、SP、SPH处理的微生物呼吸熵分别增加约94.41%、33.41%、14.00%, SH处理的微生物呼吸熵与其他处理差异显著 (p < 0.05), 其它各处理间无显著差异.第10 d时, 微生物呼吸熵表现为SH > SPH > S > SP, 与对照 (S) 相比, SH、SPH处理的微生物呼吸熵分别增加约120.89%、36.88%, SP处理的微生物呼吸熵减少约2.16%, SH处理的微生物呼吸熵显著高于其它处理, 其它处理之间无显著差异.第20 d时, SP、SPH处理的微生物呼吸熵显著低于对照处理S, SH与SP、SPH与S间微生物呼吸熵有显著差异, 其它处理间微生物呼吸熵无显著性差异；第40 d和80 d时, 各处理之间微生物呼吸熵差异不显著.
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| 图 3 石油原油、铅镉及其复合污染对微生物呼吸熵的影响 Fig. 3 Effect of oil, lead, cadmium and their combined contaminations on soil microbial qCO2 |
在整个培养期内, FDA水解酶整体活性表现为先升高后降低再趋于稳定的趋势 (图 4a).第0 d和10 d时, FDA水解酶活性表现为SP > SPH > SH > S.与对照 (S) 相比, 第0 d时, SP、SPH、SH处理的FDA水解酶活性分别增加约156.49%、73.60%、30.37%, 第10 d FDA水解酶活性分别增加约168.58%、77.99%、3.94%；第0 d和10 d, 除SH和S之间、SH和SPH之间FDA水解酶活性无显著差异外 (p > 0.05), 其它处理之间FDA水解酶活性差异显著.第20 d时, FDA水解酶活性表现为SP > S > SPH > SH, 与对照 (S) 相比, SP处理的FDA水解酶活性增加约17.49%, SPH、SH处理的FDA水解酶活性分别减少7.67%、29.26%, 各处理之间FDA水解酶活性均有显著差异 (p < 0.05).第40 d时, FDA水解酶活性表现为处理SP > SPH > SH > S, 除SH和S处理之间无显著差异外, 其他各处理间均存在显著差异.第80 d时, FDA水解酶活性表现为SPH > S > SH > SP, 除SP与SH处理之间无显著差异外, 其它处理FDA水解酶活性均存在显著差异.
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| 图 4 石油原油、铅镉及其复合污染对土壤FDA水解酶 (a)、脱氢酶 (b)、脲酶 (c)和过氧化氢酶 (d) 活性的影响 Fig. 4 Effect of oil, lead, cadmium and their combined contaminations on soil FDA hydrolysis (a), dehydrogenase (b), urease (c) and catalase (d) activity |
从图 4b可以看出, 在整个培养期内脱氢酶活性大体表现为先上升后下降的趋势.石油原油污染处理 (SP) 的脱氢酶活性在培养期内都是最高的.第0 d时, 脱氢酶活性在SP与S间、SH与SPH间无显著差异 (p > 0.05), 其它处理之间存在显著差异.第10 d和80 d, 脱氢酶活性表现为SP>SPH>S>SH, SP处理脱氢酶活性显著高于其它处理, 其它处理之间脱氢酶活性均有显著差异 (p < 0.05).第20 d时, SP处理脱氢酶活性显著高于其它处理, 各处理间脱氢酶活性均有显著差异.第40 d时, 与对照 (S) 相比, SP处理脱氢酶活性增加了19.81%, 而SPH、SH处理却分别减少了45.85%、61.35%, SP处理脱氢酶活性显著高于其它处理, 各处理之间脱氢酶活性均有显著差异.
3.4.3 石油原油、铅镉及其复合污染对土壤脲酶活性的影响由图 4c可以看出, 脲酶活性总体呈现出先降低后上升再降低的趋势.第0 d时, SPH处理的脲酶活性显著小于其它处理 (p < 0.05), 而其它处理之间无显著差异.第10 d时, 对照处理 (S) 的脲酶活性显著低于其它处理, 其它处理间无显著差异.第20 d时, 与对照 (S) 相比, SP、SPH处理脲酶活性分别增加约13.90%、7.00%, 而SH处理减少13.05%, 除SP和SPH处理之间脲酶活性无显著差异外, 其它各处理间存在显著差异.第40 d和80 d时, 各处理的脲酶活性变化趋势一致, 即SPH > SP > S > SH, 且存在明显差异.
3.4.4 石油原油及铅镉污染对土壤过氧化氢酶活性的影响研究表明, 在培养期内, 土壤过氧化氢酶活性表现为先降低后上升再降低再上升的趋势 (图 4d).第0 d时, 过氧化氢酶活性在SPH、SP、SH处理之间无显著差异 (p > 0.05), 但均显著低于对照处理 (S).第10 d时, SP和SPH处理过氧化氢酶活性显著高于S和SH处理 (p < 0.05), 而SP和SPH间、S和SH间无显著差异.第20 d时, 除SP与S处理间过氧化氢酶活性无显著性差异外, 其它各处理间均存在显著差异, 与对照 (S) 相比, SPH、SP处理过氧化氢酶活性分别增加约32.35%、26.08%, SH处理过氧化氢酶活性减少约9.48%.第40 d时, SPH和SP处理过氧化氢酶活性显著高于SH和S处理, 但SPH和SH间、SH和S间无显著差异；第80 d时, 与对照 (S) 相比, SPH、SP处理过氧化氢酶活性分别增加约32.04%、3.18%, 而SH处理减少约2.27%, SPH处理过氧化氢酶活性显著高于其它处理 (p < 0.05), 而其它处理间无显著差异.
4 讨论 (Discussion)土壤呼吸和微生物呼吸熵是综合反映土壤污染对微生物活性影响的重要指标 (Baath et al., 1989), 是反映土壤受胁迫程度的主要生理生态参数, 可作为衡量土壤地力及土壤环境质量的重要生物学指标 (李小利等, 2007).本研究发现, 随培养时间的增加, 土壤基础呼吸和微生物呼吸熵强度先下降后趋于平稳, 这与Zhou等(2011) 的研究结果相似.土壤基础呼吸和微生物呼吸熵强度下降, 可能是由于土壤微生物受外源污染胁迫后, 抑制了自身的代谢活动, 导致CO2释放量减少.其中, SH处理的土壤呼吸强度高于SPH和SP处理, 尤其是第0 d和第10 d, 反映出铅镉污染带来的刺激作用更强烈, 促使土壤微生物释放更多的能量来维持正常的生命活动, 导致土壤基础呼吸增加, 微生物呼吸熵升高.
土壤微生物量碳与土壤微生物数量直接相关, 是反映土壤肥力与土壤环境的敏感指标 (Giller et al., 1998), 其变化能直观反映土壤受污染的程度 (陈承利, 2006).本研究发现, 在第0~10 d时, 土壤微生物量碳含量上升, 第10 d后开始逐渐降低.Zhou等(2011) 研究了土壤添加食细菌线虫和扑草净后, 发现土壤微生物量碳在不同浓度的污染物中呈先上升后下降趋势, 这与本研究的结果基本相似.土壤微生物量碳含量增大可能是由于添加的外源污染促进了微生物的合成代谢, 使微生物数量增多；但随着培养时间的增加, 土壤微生物量碳含量下降, 这可能是由于土壤微生物在外源污染的干扰下, 抗逆性增强, 代谢速率增大, 养分利用率降低造成的 (Liao et al., 2005).在同一培养时间内, 土壤微生物量碳表现为SP>SPH>SH, 这可能是一方面土壤中的石油原油可以为某些微生物提供碳源用于自身的新陈代谢, 而另一方面铅镉又在一定程度上抑制了土壤微生物量碳的合成, 可归因于石油原油及铅镉这两类污染物存在吸附点位的竞争 (张闻等, 2012), 会导致一种污染物从结合点位取代另一种处于竞争弱势的污染物.通常情况下, 竞争的结果在很大程度上取决于所共存的各污染物的种类、浓度比、土壤理化性质和复合污染时间.
土壤酶活性是土壤微生物活性的敏感指标, 它可以表征土壤质量的健康状况, 外源污染物对土壤微生物活性的影响研究主要集中于土壤酶活性的变化 (郭星亮等, 2012).土壤中的FDA可以被土壤中的微生物水解成有色的荧光素, 其水解与土壤中多种酶关系密切, 如蛋白酶、脂肪酶和酯酶等, FDA水解酶活性表征的是土壤中催化水解反应的一类酶 (马星竹, 2010).脱氢酶作为胞内酶, 可使有机物中的氢原子脱离出来并传给特定的受体 (王华金等, 2013), 微生物对有机类污染物的降解反应往往都是从脱氢开始的.因此, 土壤FDA水解酶和脱氢酶活性可作为监测土壤微生物总体活性的指标, 可以用来衡量土壤地力和土壤质量.本研究发现随着培养时间的增加, FDA水解酶及脱氢酶活性大体表现为先升高后降低的趋势, 添加石油原油污染处理 (SP) 对其活性表现为激活作用 (Chen et al., 2016；Zhang et al., 2015), 这可归因于石油原油中的某些有机组分可被特定的土壤微生物作为新的碳源, 促进了酶的合成和分泌, 用于正常的生命代谢活动, 这与周启星等(1995) 的结论相似.在培养后期, 石油原油污染处理 (SP) 酶活性降低可能是石油原油中易被降解的有机质减少, 难利用的有害组分增多, 对酶的抑制增强造成的, 而铅镉污染处理 (SH) 酶活性下降, 可能是在培养后期土壤微生物呼吸能量释放过多或者部分微生物死亡造成的.
脲酶广泛存在于土壤中, 是一种经增殖的或裂解的微生物细胞分泌出的胞外酶, 也是唯一直接参与含N有机物转化的酶 (陈书涛等, 2016), 可催化有机分子中酰胺的碳氮键水解为二氧化碳和氨.脲酶在本研究的培养初期活性降低, 可能是由于外源环境的突然改变抑制了微生物的代谢活动, 进而导致酶活性下降.随着培养时间的增加, 氮素转化率下降, 微生物生长代谢缓慢, 降低了脲酶的合成和分泌, 也可能是由于外源污染中的某些物质与酶分子活性部位——巯基和含咪唑等配位结合, 可以形成稳定的化合物, 产生了与底物的竞争性抑制作用, 这与Hagmann等(2015) 研究结果一致.在培养后期, 石油原油污染 (SP) 或石油原油与铅镉复合污染 (SPH) 的脲酶活性较其它处理强, 可能是石油原油中的某些物质会对土壤微生物的生长产生促进作用, 导致脲酶数量增多、活性增加.
过氧化氢酶广泛存在于植物及微生物中, 能促进过氧化氢分解, 降低过氧化氢对土壤微生物的毒害作用 (王华金等, 2013), 从而为土壤微生物提供更好的生长繁殖环境.本研究中过氧化氢酶活性变化波动较大, 洪春来等(2008) 认为土壤酶产生这种变化是出现“抗性酶活性”现象, 适应性强的微生物可自行繁殖, 表现出酶活性先降低后增大再降低再增大, 出现多个抗性峰.在培养后期, 石油原油及铅镉复合污染 (SPH) 的过氧化氢酶活性均高于其它处理, 可能是石油原油与铅镉形成污染更强的络合物, 刺激微生物分泌更多的过氧化氢酶, 以抵抗外源污染给土壤环境带来的危害, 使土壤微生物能更好的适应环境.也有研究表明, 土壤中过氧化氢酶活性与土壤中有机质和氮素有密切关系, 与其他性质关系不显著 (张平等, 2013).需要指出的是, 本试验采用的石油原油污染浓度相对较低, 在今后的研究中, 可以将石油原油污染设置成不同的浓度梯度来研究, 有助于人们更好地理解复合污染条件下土壤微生物的响应规律, 从而为复合污染治理提供理论依据.
5 结论 (Conclusions)1) 铅镉污染对土壤基础呼吸和微生物呼吸熵的激活作用最强, 石油原油污染可为部分微生物提供碳源, 促进微生物生物量碳的增加.
2) 土壤酶对环境污染的响应不尽相同, 石油原油污染对FDA水解酶及脱氢酶活性的刺激作用最强, 而石油原油及铅镉复合污染对脲酶及过氧化氢酶的刺激作用最强.
3) 石油原油及铅镉复合污染对土壤微生物活性的影响与石油原油或铅镉污染的影响不同, 不是两种污染作用结果的简单叠加, 而是存在着明显的交互作用.
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