1 引言 (Introduction)

四环素类抗生素是目前使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一 (张浩等，2008)，它们是由放线菌产生的一类广谱抗生素，其结构均含并四苯基本骨架，主要包括四环素、土霉素和金霉素等.因其抗菌谱广，价格低廉，在养殖、医用和农用等方面的应用不断增长，其环境污染问题亦日趋严重 (Xie et al., 2011).欧盟体每年消耗四环素类抗生素的量高达2300 t (Hirsch et al., 1995)，1997年德国威悉·爱姆斯地区，四环素类抗生素的使用量是兽药采购总量的50% (Winckler and Grafe, 2001)，中国是生产和消费四环素类抗生素的大国，年出口量高达1.34×10⁷ kg (Zhu et al., 2013;杨晓芳等, 2014).抗生素被人体和动物吸收后，30%~90%以母体化合物的形式排出体外，一些四环素类抗生素在环境中具有一定的持久性和转化性 (贺德春等, 2011;李伟明等, 2012)，进而导致其环境中的药物残留问题严重，其土壤和水体污染及生态毒理效应已成为我国乃至全球亟待解决的重大环境问题之一，受到越来越多的科学研究者的关注 (Bao et al., 2009;董璐玺等, 2010).

目前，禽畜养殖场、药企和医院等是环境中四环素类抗生素的重要来源 (杨晓芳等, 2014)，土壤作为抗生素最终的归宿地，近年来，国内许多的地区的菜地土壤中都可以检测到四环素类抗生素 (Li et al., 2011;尹春艳等, 2012)，其含量与国外的相当，但检出率较高 (李彦文等, 2009).国内外一些研究发现土壤中四环素类抗生素含量范围在几μg·kg^-1到上千μg·kg^-1不等，主要分布在土壤中表层土0~30 cm左右，土壤强烈的吸附作用使其向土壤下层迁移的能力较差 (Hamscher et al., 2002;尹春艳等, 2012).四环素类抗生素在土壤中有一定的积累性，并可以转化成其代谢物，随时间的积累逐渐破坏土壤生态系统，通过一系列的环境行为影响土壤微生物、植物和动物的生长活动 (Liu et al. 2009; Xie et al., 2011; Dong et al, 2012)，甚至诱导细菌耐药性的产生 (Ji et al., 2012; Zhu et al., 2013)，可以通过食物链传递对农产品质量安全产生潜在的威胁.

一些研究发现土壤中四环素类抗生素污染可以导致其在蔬菜作物中积累，含量范围在几μg·kg^-1到几百μg·kg^-1之间，部分蔬菜作物的可食部位已经超过了欧盟规定的环境中抗生素生态毒害效应触发值 (100 μg·kg^-1)(Ahmed et al., 2015; Hu et al., 2010; Li et al., 2011)，四环素类抗生素可以引起人体肝脏等器官的损伤 (Leitner et al., 2010).小白菜是人们广泛种植及食用的蔬菜作物，四环素类抗生素可以通过土壤-白菜-人体食物链传递进入人体进而对人类健康产生潜在威胁 (Li et al., 2016).然而目前国内外关于环境中不同土壤类型中四环素类抗生素污染对蔬菜作物的生态毒性还不是十分明确，可利用的生态毒性效应数据也较少.抗生素污染对植物种子的萌发和根长的影响被认为是直观、有效的生态毒理效应指标 (鲍艳宇等, 2008; Xie et al., 2011;徐秋桐等, 2015)，因此，本研究采用酶联免疫法 (ELISA) 结合种子发芽和根伸长试验探讨不同土壤四环素类抗生素降解规律及对小白菜生态毒性效应的差异，为环境中抗生素污染的阻断与蔬菜农产品安全提供理论依据.

2 材料与方法 (Materials and methods) 2.1 植物材料

小白菜种子早熟8号购买于浙江省农业科学院蔬菜研究所.

2.2 主要试剂

分析纯盐酸四环素 (TC) 购买于美国Sigma-Aldrich公司，分析纯盐酸土霉素 (OTC)和盐酸金霉素 (CTC) 使用阿拉丁试剂 (上海晶纯生化科技股份有限公司)，3种抗生素均为粉末，分子结构和基本性质分别见图 1和表 1 (Thiele Bruhn and Beck, 2005; Dolliver et al., 2008;张浩等, 2008; Lin et al., 2010).四环素类抗生素ELASA试剂盒购置于深圳市豫崧生物技术有限公司.

2.3 土培试验

试验于2015年10—12月在浙江大学紫金港校区网室进行，气温为10~20 ℃.砖红壤、红壤、青紫泥和黑土分别取自海南海口、广西南宁、浙江嘉兴和东北黑龙江的农田，取表层0~40 cm的土壤，土样室内风干后，土壤理化性质根据《土壤农化分析》方法测定 (鲍士旦, 2000)，具体数据见表 2，土壤中的四环素、土霉素和金霉素浓度均在检出限以下.锤土磨细后过10目土筛，将土样称取500 g土壤于塑料盆钵中，土壤四环素、土霉素和金霉素含量设置6个水平：0、2.5、5、10、15和20 mg·kg^-1，具体操作如下：首先配置抗生素母液，后稀释成设计浓度的溶液均匀喷洒于土壤上，逐层喷洒，充分混匀，平衡1 d后，播种0.3%高锰酸钾消毒过的早熟8号白菜种子，播种深度为2 cm左右，每盆播种25粒种子，期间按土壤含水量为田间最大持水量的70%进行浇水.于7 d和30 d后取样测定发芽率 (7 d)，生物量和根伸长长度平均值，设3个平行.7 d种子发芽率=发芽种子数/播种数×100%.

土壤抗生素降解试验：4种类型的土壤中加入3种抗生素，设置初始污染剂量为20 mg·kg^-1，混匀平衡后于处理7、14、21、28和30 d后取样，设3个平行.所取的土壤干样用磨土机磨碎后过100目筛，根据Aga等(2005) 的方法改进后采用ELASA试剂盒法测定土壤中四环素类抗生素的含量.土壤四环素类抗生素降解率 (η) 如式 (1) 所示.

(1)

式中, C_t为在t时间土壤中抗生素的含量 (mg·kg^-1)，C₀为初始的土壤抗生素的含量 (mg·kg^-1).

2.4 数据处理

试验结果采用SigmaPlot 10.0作图，利用SPSS16.0软件进行计算和分析，结果采用平均值±标准误 (Mean±SE) 表示，并使用One-Way ANOVA进行多重比较 (LSD) 分析，相关性采用Pearson进行分析.p＜0.05和p＞0.05分别表示差异性显著和不显著.

3 结果 (Results) 3.1 土壤四环素类抗生素对小白菜种子发芽和生物量的影响

由表 3可知，不同抗生素种类和土壤类型对小白菜发芽率有一定的影响.小白菜在四环素类抗生素污染的4种土壤中的发芽率均在82.00%以上.与对照相比，四环素和土霉素对4种土壤种植的小白菜的发芽率没有显著影响，3种抗生素对黑土中种植的小白菜的发芽率的影响不显著 (p＞0.05)；而当金霉素的剂量为20 mg·kg^-1时，砖红壤、红壤和青紫泥中种植的小白菜发芽的率显著下降，发芽抑制率分别为10.20%、13.68%和10.42%.图 2表明，不同类型对照土壤上种植的小白菜的生物量 (以强度计) 有较大差异，生长7 d和30 d时植株鲜重的规律为：黑土＞青紫泥＞砖红壤≈红壤.然而与对照相比，3种类型的抗生素对4种土壤中小白菜的生物量没有产生显著影响 (p＞0.05).土壤中3种四环素类抗生素的剂量与小白菜的发芽率和生物量之间没有显著的相关性 (p＞0.05).

3.2 土壤四环素类抗生素对小白菜根长伸长的影响

由图 3可以看出，随着土壤中3种四环素类抗生素剂量的增加和作用时间的延长，小白菜根长发生了显著变化.短时间胁迫 (7 d)3种四环素类抗生素对4种土壤中小白菜的根长产生了显著的影响，未添加抗生素的土壤中小白菜的根长大小依次为砖红壤＞红壤＞青紫泥＞黑土，当添加抗生素大于5 mg·kg^-1时，土壤中小白菜的根长大小则变成为砖红壤＞青紫泥＞红壤＞黑土.当抗生素添加量为2.5 mg·kg^-1时，砖红壤、青紫泥和红壤中的小白菜根长开始显著升高 (p＜0.05)；对于黑土而言，四环素污染没有影响小白菜的根长，15 mg·kg^-1土霉素和5 mg·kg^-1金霉素使得小白菜根长开始显著增加 (p＜0.05)，其对根长的刺激效应为金霉素＞土霉素＞四环素 (p＜0.05).当3种抗生素添加为5~20 mg·kg^-1时，砖红壤、红壤和青紫泥中抗生素的剂量与小白菜的根长有显著的相关性 (p＜0.05)，低剂量条件下土壤中同一含量的四环素类抗生素对白菜种子根长的刺激作用大于对发芽率和生物量的作用.长时间的四环素类抗生素胁迫 (30 d) 对小白菜根长的影响作用在不同土壤中的差异减小.未添加抗生素的土壤中小白菜的根长大小依次为砖红壤＞黑土≈青紫泥≈红壤，当添加抗生素后小白菜的根长在不同土壤中规律变为砖红壤≈黑土>青紫泥≈红壤.尽管此时低剂量的四环素类抗生素促进了部分土壤中小白菜根长的伸长，但与对照相比差异并不显著.当四环素和金霉素添加量为20 mg·kg^-1时，与对照相比，土壤中小白菜的根长均显著下降 (p＜0.05)，在青紫泥、红壤和砖红壤中小白菜根长分别下降了17.99%、18.71%、20.23%和16.20%、16.80%、17.73%，黑土中小白菜的根长没有显著差异，同一抗生素对4种土壤中小白菜根长的抑制效应为砖红壤＞红壤＞青紫泥＞黑土.当土霉素添加量为20 mg·kg^-1时对4种类型的土壤中的小白菜根长抑制率没有显著影响，同一土壤中3种抗生素对根长的抑制效应为四环素≈金霉素＞土霉素.

3.3 土壤四环素类抗生素的降解与土壤理化指标的相关性

从图 4可以看出，随着时间的增加，3种四环素类抗生素在土壤中的含量逐渐降低，且不同土壤类型、不同抗生素的降解率有显著差异.土壤中添加抗生素7 d后四环素、土霉素和金霉素的降解率分别为32.10%~94.60%、76.90%~97.05%和49.65%~94.75%，30 d后其降解率分别为59.65%~97.40%、93.00%~98.85%和78.45%~98.15%；降解率呈现前期急剧降解，后期缓慢降解的规律.对于同一种抗生素而言，4种土壤中的降解率为黑土＞青紫泥＞红壤＞砖红壤，而对于同一种土壤而言，3种四环素类抗生素的降解率为土霉素＞金霉素＞四环素.

土壤中3种四环素类抗生素含量与土壤理化指标相关性分析表明，无论是短时间还是长时间污染，土壤中抗生素的含量与pH、有机质、氮、磷、钾含量和阳离子交换量都有显著的负相关关系，相关系数最高可达-0.989；3种四环素类抗生素的含量与砂粒和黏粒的含量没有相关性 (表 4).

4 讨论 (Discussion)

小白菜种子发芽率主要是受种壳厚度、播种深度和土壤质地的影响，生物量则受种胚营养和土壤养分的影响，种子和土壤本身的性质对发芽率和生物量制约远大于四环素类抗生素的作用，短时间的抗生素胁迫不会对发芽率和生物量造成显著影响 (表 3和图 2)，表明小白菜种子发芽率和生物量不宜作为土壤四环素类抗生素污染的生态毒理学的敏感指标.当根系长出后，它是最先接触土壤的部位，根尖的生长点很容易受到污染物的影响，四环素类抗生素抑菌机理是与核蛋白体的30S亚单位结合，从而阻止氨酰基-tRNA同核糖核蛋白结合，抑制蛋白质合成 (Kohanski et al., 2010)，小白菜根系可能有类似结构的靶分子，因此根长对于四环素类抗生素的污染更加敏感 (图 3)，说明了3种四环素类抗生素对小白菜根长的作用大于其对发芽率和生物量的作用，这与前人的研究结果类似 (金彩霞等, 2009)，小白菜根长是更为敏感的土壤四环素类抗生素污染的评价指标.

对比前期的水培试验结果，水培条件下随着四环素类抗生素添加量的升高，小白菜根长基本上呈现低浓度促进高浓度抑制的规律，且随着浓度的增加，根长受抑制的程度加重，根伸长对3种抗生素的敏感性依次为金霉素＞土霉素＞四环素 (杨肖娥等, 2015)，可能是3种抗生素的结构的差别 (图 1)，导致了它们选择性的抑制不同蛋白质的合成，进而引起了3种抗生素毒性的差异 (Chukwudi, 2016).土培条件下，四环素类抗生素对根伸长的影响与水培的规律类似 (图 3)，然而在一定的剂量范围内，同一剂量的相同抗生素，水培下根长的抑制作用大于本研究中土培条件下的 (杨肖娥等, 2015)，主要是相对于水溶液而言，抗生素更容易吸附在土壤组分上 (如黏粒，有机质等) 而不易被植物吸收 (Liu et al., 2009)，说明土壤介质对抗生素的毒性有一定的缓冲作用，能够降低小白菜根系对其敏感性，四环素类抗生素在水环境中对小白菜的毒性更大.

在同一土壤和初始处理剂量条件下，胁迫7 d时，根伸长对3种抗生素的敏感性依次为金霉素＞土霉素＞四环素，除高浓度处理的红壤外其余3种土壤上均为刺激根伸长的效应，且刺激效应基本上为砖红壤＞青紫泥＞黑土，这可能是小白菜的一种抵抗四环素类抗生素初期胁迫的适应性反应，由于胁迫早期土壤抗生素剂量较高，幼苗根系对于胁迫更加敏感，导致同种抗生素污染下不同土壤类型上根长的差异较大；而胁迫30 d时，根伸长对3种抗生素的敏感性则变成四环素≈金霉素＞土霉素，可能是同一土壤上抗生素的降解率为土霉素＞金霉素＞四环素的缘故 (图 4)，这一结果与前人的研究结果不完全相同 (刘玉芳, 2012), 是因为抗生素含量通过酶联免疫方法测定，土壤中抗生素的含量可能是四环素类抗生素及其代谢产物的总和(Cháfer Pericás et al., 2011).此时不同土壤中根长对同一抗生素的敏感性表现为砖红壤＞红壤＞青紫泥＞黑土，不同类型的土壤上根长差异降低 (图 3)，一方面，随着时间的延长，3种抗生素的降解程度增加到60%~90%以上，另一方面，小白菜随着生物量的增加抵抗力增强，进而导致同种抗生素污染下不同土壤类型上的根长差异减少.可见土壤中四环素类抗生素对蔬菜作物的毒性是一个随时间动态变化的过程，抗生素的含量、种类和土壤本身的性质是引起这种变化最根本的原因.

微生物作用在抗生素降解中具有明显的优势 (李伟明等, 2012)，土壤中的微生物很大程度上可以促进四环素类抗生素的分解 (徐秋桐等, 2015)，一些微生物可以将四环素类抗生素等分解成无毒的成分 (刘元望等, 2016; Li et al., 2016; Park and Choung, 2007)，微生物降解是土壤抗生素降解的重要途径 (俞慎等, 2011).有研究表明，pH会影响菌株的生长代谢，降解四环素类抗生素的细菌、真菌等微生物生长的最为适宜的pH是6.5左右 (李伟明等, 2012; Teruya Maki and Yukihiro Munekage, 2006; Migliore et al., 2012)，此外有机质和营养元素可增加土壤微生物含量和种类 (Masciandaro et al., 2013;方一丰, 2006)，促进微生物的降解能力.本研究发现4种土壤中的pH为黑土＞青紫泥＞砖红壤＞红壤，有机质和氮磷钾含量为黑土＞青紫泥＞红壤＞砖红壤 (表 2)，与此同时，同一抗生素在4种土壤中的降解顺序为黑土＞青紫泥＞红壤＞砖红壤 (图 4)，相关性分析表明，土壤中抗生素的含量与pH、有机质、氮磷钾含量和阳离子交换量都有显著负相关关系 (表 4)，说明四环素类抗生素的降解与土壤适宜的pH、高有机质、氮磷钾含量和阳离子交换量有关，可能是土壤中这些因素中的一种或几种综合作用引起了微生物降解四环素类抗生素能力提高的结果，至于哪种因素占主导作用还需要进一步的研究.本研究中长时间四环素类抗生素污染的土壤上，对于同一种抗生素而言，砖红壤和黑土中的根长较之红壤和青紫泥更长，主要是由于砖红壤和黑土的砂粒百分含量较大，小白菜根系更容易在其中伸长，而红壤和青紫泥土壤砂粒的百分含量较少，根系伸长生长困难的原因所致.小白菜根长的抑制率为砖红壤＞红壤＞青紫泥＞黑土 (图 3)，一方面由于有机质和营养元素含量为黑土＞青紫泥＞红壤＞砖红壤 (表 2)，土壤理化性质的差异导致四环素类抗生素的降解率为黑土＞青紫泥＞红壤＞砖红壤，另一方面小白菜的鲜重为黑土＞青紫泥＞红壤≈砖红壤，植株生物量的增加对抗生素剂量的起到稀释效应，因此, 长时间的胁迫导致了四环素类抗生素对小白菜的根系的毒性效应为砖红壤＞红壤＞青紫泥＞黑土.说明对于不同的土壤类型而言，砂性土壤上小白菜根系更容易进行伸长生长，并且越是肥沃的土壤其降解四环素类抗生素的能力越强，抗生素对其上生长的蔬菜作物的毒性也会越弱.

5 结论 (Conclusions)

1) 小白菜根伸长对3种四环素类抗生素的敏感性强于发芽率和生物量，随着抗生素处理时间的延长和剂量的增加对根长的抑制效应加重.

2) 从小白菜根伸长对3种四环素类抗生素的敏感性来看，短时间低含量为刺激效应：金霉素＞土霉素＞四环素，长时间高含量为抑制效应：四环素≈金霉素＞土霉素.

3) 3种四环素类抗生素在不同土壤类型对小白菜根长伸长的效应来看，在不同土壤类型中短时间处理的刺激效应差异更大，且砂性土壤上小白菜根长更长.

4) 3种四环素类抗生素在4种类型的土壤中的降解规律为：同一种抗生素在不同土壤的降解率为：黑土＞青紫泥＞红壤＞砖红壤，肥力越高的土壤上四环素类抗生素的降解越快；同一种土壤不同抗生素的降解率为：土霉素＞金霉素＞四环素.四环素类抗生素的降解率呈现前期急剧下降，后期缓慢下降的规律.