1 引言(Introduction)

近几十年来, 随着我国工业化进程的不断加速, 涉及重金属排放的行业越来越多, 包括矿山开采、金属冶炼、化工、印染、皮革、农药、饲料等, 再加上一些污染企业的违法开采、超标排污等问题突出, 使重金属污染现状日趋严重.2014年4月, 环境保护部和国土资源部(2014)公布的全国土壤污染状况调查结果显示, 全国土壤总的点位超标率为16.1%, 其中, 重金属镉是最主要的污染物, 镉的点位超标率达到7.0%, 远远超过其他污染物.湘江流域也已经成为湖南全省重金属污染的重灾区, 其中, 污染物镉的超标率高达64%, 污染情况最为严重.

如何有效治理重金属镉污染是人类治理环境污染的一项重大难题.传统的物理化学修复技术存在费用昂贵、破坏土壤生态环境和易造成二次污染等问题, 因此, 采用生物修复技术治理重金属镉污染受到了广大科研工作者和政府部门的青睐(Abhilash et al., 2012; Hashim et al., 2011).其中, 微生物具有个体微小、比表面积大、繁殖快、代谢能力强、种类多、分布广、适应性强和容易培养等优势, 在镉污染治理中具有独特的地位(Lin et al., 2005; Wu et al., 2014).耐镉微生物可以通过钝化土壤中重金属镉的活性或影响作物对镉的吸收, 降低重金属镉对作物的毒害作用；有些耐镉的根际微生物则能够通过提高超富集植物对镉的吸收从而应用于镉污染的土壤修复中；同时, 具有镉吸附作用的微生物还能有效应用于镉污染水体的修复与治理中(Chang et al., 2014; Cocozza et al., 2014; Jing et al., 2014; Muehe et al., 2015; Schütze et al., 2014).近年来, 越来越多的耐镉微生物通过传统的分离筛选手段被分离得到, 这些细菌主要属于Pseudomonas sp.(Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas plecoglossicida和Pseudomonas putida等)、Aeromonas caviae、Bacillus circulans、Bacillus cereus、Bacillus megaterum、Enterobacter sp.、Staphylococcus xylosus、Enterococcus faecalis、Streptomyces pimprina、Streptomyces rimosus、Escherichia coli、Geobacillus stearothermophilus、Mycobacterium sp.和G. thermocatenulatus Pantoea sp.等(Huang et al., 2014; Leedjärv et al., 2008; 林晓燕等, 2015; 潘风山等, 2014; Shamim et al., 2014; Vijayaraghavan et al., 2008; Wu et al., 2014).虽然目前报道的耐镉微生物种类较多, 但这些菌株仍存在耐镉和/或吸附镉的能力不强, 遗传稳定性不高, 菌体生长及吸附条件窄等诸多不足, 因此, 有必要进一步开展耐镉微生物资源的挖掘工作.

本研究以湖南省多地镉污染土壤的混合样品为材料, 从中分离筛选获得一株在液体培养基和固体培养基中能够分别耐受45 mmol·L^-1和50 mmol·L^-1 Cd²⁺的细菌, 结合形态学、生理生化及分子鉴定等方法, 初步鉴定该菌株为链霉菌(Streptomyces sp.), 命名为Streptomycessp. strain CdTB01；同时, 研究培养基种类、装液量、培养温度、初始pH、接种量及NaCl质量分数等因素对strain CdTB01生长的影响, 进一步探讨温度、pH、NaCl质量分数和镉离子浓度等因素分别对Streptomycessp. strain CdTB01湿菌体和干菌粉吸附Cd²⁺的影响, 以期为链霉菌Streptomycessp. strain CdTB01在镉污染废水处理中的应用提供一定的理论技术支持.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料与培养基

土壤样品采集于湖南省浏阳市镇头镇、湘西凤凰县、古丈县及泸溪县等镉污染土壤.采样点去除5~10 cm表层土壤, 用梅花形五点采样法采取土壤样品, 将各样品等量均匀混合, 按GB/T 17141—1997《土壤质量铅、镉的测定》中石墨炉原子吸收分光光度法测定样品中镉的含量(下同), 结果为20.63 mg·kg^-1.

分离培养基：10 g胰蛋白胨, 10 g氯化钠, 5 g酵母提取物, 12 g琼脂粉, 加CdCl₂·2.5H₂O母液, 使Cd²⁺浓度为10 mmol·L^-1, 加蒸馏水至1000 mL, 121 ℃灭菌20 min, 置于4 ℃保存备用.

筛选驯化培养基：10 g胰蛋白胨, 10 g氯化钠, 5 g酵母提取物, 12 g琼脂粉, 加CdCl₂·2.5H₂O母液, 使培养基中Cd²⁺浓度分别为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 mmol·L^-1, 加蒸馏水至1000 mL, 121 ℃灭菌20 min, 4 ℃保存备用.

其他培养基：LB培养基、葡萄糖-天门冬酰胺液体培养基、马铃薯葡萄糖培养基、高氏培养基、马铃薯蔗糖培养基、甘油培养基、察氏培养基.

2.2 主要仪器与试剂

实验所用CdCl₂·2.5H₂O、氯化钠等化学试剂均为国产分析纯；T4 DNA Ligase、Rapid ligation buffer、DNA marker、Taqmster mix DNA Ploymerase、PGEM-T Easy Vector(大连TaKaRa)；磁珠法微生物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工).

使用的主要仪器有：生化培养箱(天津泰斯)、恒温摇床(上海精宏)、超净工作台(江苏净化)、通风橱(南方现代)、电子天平(梅特勒-托利)、湿热灭菌锅(SANYO)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、PCR仪(Eppendorf Ag)、高速离心机(湖南湘仪)等.

2.3 耐镉细菌的分离、筛选、驯化与稳定性分析

向250 mL三角瓶中倒入100 mL ddH₂O, 加入10 g镉污染混合土壤样品, 30 ℃条件下200 r·min^-1振荡培养1 h；然后静止10 min, 取上层悬液分别稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7, 再吸取各稀释液0.1 mL, 涂布在含Cd²⁺的分离培养基上, 30 ℃倒置培养3~7 d；挑取单菌落逐步递增转接到Cd²⁺浓度为10~55 mmol·L^-1的筛选驯化液体培养基上培养3 d, 取0.1 mL上述培养液涂布于含更高Cd²⁺浓度的筛选驯化固体培养基, 观察培养基上有无菌落长出, 重复上述操作得到一株镉耐受性最高的菌株.最后将该菌株接种到分别含50 mmol·L^-1 Cd²⁺的蔡氏、高氏和PDA固体培养基中进行传代培养20代, 观察菌株生长和耐镉情况.

2.4 耐镉细菌的鉴定 2.4.1 形态学观察和生理生化特征

通过形态学观察及生理生化特征, 对筛选获得的耐镉细菌进行鉴定(周德庆, 2006; 布坎南等, 1984).

2.4.2 分子鉴定

采用试剂盒提取耐镉细菌的总DNA, 以此为模板扩增细菌16S rDNA序列.引物：27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′, 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR反应体系：10×buffer 5 μL, Ex Taq 0.25 μL, dNTP 4 μL, 引物各2 μL, 模板2 μL, ddH₂O补至50 μL.PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 共32个循环；再72 ℃延伸10 min.PCR扩增产物回收后连接到pMD18-T vector上, 经鉴定后送华大基因进行测序.测序结果利用Blast进行网上比对, 最后用MEGA 6.0软件选用邻近法构建系统进化树.

2.5 耐镉细菌培养条件的优化

分别以培养基(LB培养基、葡萄糖-天门冬酰胺液体培养基、马铃薯葡萄糖培养基、高氏培养基、马铃薯蔗糖培养基、甘油培养基、察氏培养基)、装液量、温度、初始pH、接种量和NaCl等为单因素, 通过测定菌株在特定培养条件下的细胞干重, 从而确定耐镉菌株生长的优化条件.

2.6 耐镉细菌吸附镉的特性分析 2.6.1 不同条件下耐镉菌株湿菌体对Cd²⁺的吸附能力

湿菌体的制备：耐镉菌株在马铃薯蔗糖液体培养基的优化生长条件下培养24 h, 5000 r·min^-1离心10 min收集菌体, ddH₂O清洗3遍, 除去菌体中的水分, 获得耐镉菌株湿菌体.用1.0 g湿菌体在100 mL溶液中进行吸附试验.

Cd²⁺吸附率的测定：将湿菌体处理过的样品进行消化后, 采用TAS-986原子吸收分光光度计火焰法测定其镉含量.以温度、pH、NaCl浓度和Cd²⁺浓度为单因素, 检测湿菌体在各种条件下对Cd²⁺的吸附率, 具体公式如下：

式中, C₀为Cd²⁺初始浓度(mg·L^-1), C_e为吸附后Cd²⁺浓度(mg·L^-1).

2.6.2 不同条件下耐镉菌株干菌体对Cd²⁺的吸附能力

将上述制备的湿菌体置于115 ℃下烘干8 h, 经碾磨成粉后使用.用0.1 g干菌体在100 mL溶液中进行吸附试验, 其余同2.6.1节.

3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 耐镉细菌的筛选

采用微生物纯培养的方法从镉污染的混合土样中分离筛选耐镉能力强的细菌, 初步筛选获得24株耐受镉能力强的菌株, 通过进一步复筛驯化最终获得一株耐镉能力非常强的菌株, 将其命名为CdTB01.CdTB01能够在含Cd²⁺浓度为45 mmol·L^-1的PDA液体培养基中生长, 传代培养20代后仍能在含50 mmol·L^-1 Cd²⁺的高氏、蔡氏和PDA固体培养基中生长(图 1), 表明该菌株不但耐受镉浓度高, 而且耐镉的遗传稳定性很好.

3.2 耐镉细菌的鉴定 3.2.1 形态学观察和生理生化特征

耐镉菌株CdTB01在马铃薯蔗糖固体培养基上的菌落形态特征为深褐色、易挑起、易碎菌、中央凸起, 无气生菌丝, 基内菌丝灰色, 产生可溶性深褐色色素, 是革兰氏阳性菌, 菌株部分生理生化特征见表 1.

3.2.2 分子鉴定

耐镉菌株CdTB01 16S rDNA测序结果提交NCBI进行Blastn比较, 结果显示, 其与链霉菌属(Streptomyces sp.)有99%的同源性.采用MEGA 6.0软件构建系统发育树, 结果如图 2所示.从图 2可以看出, 耐镉菌株CdTB01与菌株Streptomyces panaciradicis strain 1MR-8的亲缘关系最近.综合形态学鉴定、生理生化试验及16S rDNA序列同源性分析表明, 耐镉菌株CdTB01属于链霉菌属, 将其命名为Streptomycessp. strain CdTB01(NZ_CP013743).

3.3 耐镉细菌CdTB01培养条件的优化

为了对耐镉细菌CdTB01的培养条件进行优化, 分别以培养基种类、装液量、培养温度、pH、接种量和NaCl质量分数等单因素为研究对象, 探讨分析耐镉菌株CdTB01的培养条件.由图 3a可知, CdTB01菌株在马铃薯蔗糖培养基中生长最快, 当培养时间为1 d时, 马铃薯蔗糖培养基中菌体生长量达到其他培养基中菌体生长量的2~3倍, 因此, 选取马铃薯蔗糖培养基作为培养耐镉菌株CdTB01的培养基进行下一步研究.装液量通常影响着菌体生长过程中的溶解氧量, 从图 3b可知, 在250 mL的三角瓶中, 装液量从50 mL增大到90 mL时, 单位体积菌体生物质量随装液量的增加逐渐上升；装液量从90 mL增大到100 mL, 单位体积菌体生物质量反而下降, 说明装液量在90 mL时耐镉菌株CdTB01对培养基和溶解氧的利用效率最佳, 故在250 mL的三角瓶中选取装液量为90 mL.温度的选择对微生物的生长有非常大的影响, 培养温度的过高或过低往往都会对菌体中各类酶的活性造成不同程度的抑制, 由图 3c可知, 当培养温度为30 ℃时, CdTB01菌体生物质量最高, 表明该温度为耐镉链霉菌CdTB01的最佳生长温度.pH对微生物细胞膜通透性、胞内酶促反应、胞内物质电离性等均有很大影响, 从图 3d可知, 无论初始pH是4.0还是11.0, 耐镉链霉菌CdTB01均能够生长, 说明该菌株可生长的pH范围较广, 但初始pH值为6.0时, CdTB01菌体的生物质量最高, 最适合菌体生长.微生物在生长过程中, 随着个体数量的增多, 代谢产物的大量积累, 必然会出现资源竞争等问题从而影响微生物的生长, 因此, 接种量对微生物的生长也有重要影响.由图 3e可知, 当接种量为6.0%~8.0%时, 耐镉链霉菌CdTB01生长量较大且差异性不显著, 因此, 该菌株的适宜接种量为6.0%.NaCl质量分数与微生物维持细胞渗透压密切相关, 从图 3f发现, 耐镉链霉菌CdTB01生物质的量随着NaCl质量分数(0~2.0%)的增加而逐渐减小, 说明NaCl对该菌株的生长有一定的抑制作用.综上可知, 耐镉链霉菌CdTB01优化后的培养条件为：马铃薯蔗糖培养基, 在250 mL的三角瓶中装液量90 mL, 培养温度30 ℃, 初始pH=6.0, 接种量6.0%, NaCl质量分数0%.

3.4 耐镉细菌CdTB01吸附镉的特性 3.4.1 耐镉链霉菌CdTB01湿菌体吸附Cd²⁺的特性

微生物吸附包括活细胞和死细胞的吸附, 细胞是否具有活性对其吸附重金属镉有着较大的影响.通常活性微生物的吸附速率较慢而且可逆性差.有研究表明, 不同环境条件下生长出的菌体活细胞的重金属离子吸附能力差别较大.从图 4a中可以看出, 当温度为30 ℃, 链霉菌CdTB01湿菌体对Cd²⁺吸附率达到最大值为11.20%；当温度小于30 ℃时, Cd²⁺吸附率随温度升高而迅速提高；当温度大于30 ℃时, Cd²⁺吸附率随温度升高而略微下降.图 4b显示, pH为8.0时, 链霉菌CdTB01湿菌体对Cd²⁺的吸附率为19.60%, 是pH为5.0时吸附率的4倍, pH为9.0时吸附率的2倍.图 4c为NaCl质量分数对链霉菌CdTB01湿菌体Cd²⁺吸附率的影响, 当溶液中NaCl质量分数(0.5%~1.5%)较低时, 对Cd²⁺具有较大的吸附率, 其中, NaCl质量分数为1.0%时达到最大吸附率26.80%, 随着NaCl质量分数的不断增加(大于1.5%时), Cd²⁺吸附率迅速降低.从图 4d中可知, 当Cd²⁺浓度为20~100 mg·L^-1时, 链霉菌CdTB01湿菌体对Cd²⁺的吸附率随Cd²⁺浓度增加而缓慢升高, 在Cd²⁺浓度相对较低的环境中, 菌体对Cd²⁺的吸附可能主要以胞内结合为主；随着Cd²⁺浓度不断升高(在100~500 mg·L^-1之间), Cd²⁺吸附率迅速提高, 当Cd²⁺浓度为500 mg·L^-1时, 链霉菌CdTB01对Cd²⁺吸附率达到44.78%, 此时Cd²⁺除了胞内结合外, 胞外吸附可能也发挥了一定的去除作用；进一步提高环境中Cd²⁺浓度(在500~900 mg·L^-1之间), 由于环境中存在大量的Cd²⁺, 使得Cd²⁺的胞内结合作用达到饱和, 大量Cd²⁺被吸附在菌体表面, 同时由于相对高浓度的Cd²⁺存在抑制了菌体的生长, 因此, 导致了Cd²⁺吸附率迅速下降；继续增大Cd²⁺浓度(900~2100 mg·L^-1之间), 胞外吸附作用也达到饱和, 此时菌体生长也严重受到抑制, 菌体对Cd²⁺的吸附率也随Cd²⁺浓度增加而逐渐降低.总结上述结果可知, 链霉菌CdTB01湿菌体最佳Cd²⁺吸附条件为：温度30 ℃, pH=8.0, NaCl质量分数1.0%, Cd²⁺浓度500 mg·L^-1, 该菌在最佳吸附条件下的Cd²⁺去除率为44.78%.

3.4.2 耐镉链霉菌CdTB01干菌体吸附Cd²⁺的特性

尹华等(2015)在研究中发现, 死细胞对某些金属的吸附量比活细胞更高、更稳定, 而且死细胞通常不受环境体系中有毒物质的限制, 不需要营养物质, 受环境因子影响相对较小, 从应用的角度来看, 死细胞更具开发成吸附剂的潜力.图 5为不同条件下链霉菌CdTB01干菌粉对Cd²⁺的吸附率.图 5a中当温度在26~30 ℃之间时, 链霉菌CdTB01干菌粉对Cd²⁺的吸附率随温度的升高而增加, 但吸附率的提升效果并不显著；温度在30~34 ℃之间时, 吸附率随温度的升高而逐渐降低, 温度在30 ℃时, 链霉菌CdTB01干菌粉对Cd²⁺的吸附率达到最大值15.30%.图 5b表明, pH对CdTB01干菌粉吸附Cd²⁺的能力影响较小, 但当pH为9.0时吸附率达到最大值20.80%.图 5c显示, 在含有NaCl的环境中, 干菌粉对Cd²⁺的吸附受到严重干扰, 当NaCl质量分数为1.5%时的最大Cd²⁺吸附率仅为9.80%, 相比不含NaCl时的吸附率降低了1倍左右；有研究表明, 吸附液中存在的阳离子会与主要处理对象的重金属离子竞争吸附活性位点, 从而影响吸附剂的吸附效率.图 5d表明, 链霉菌CdTB01干菌粉对不同浓度Cd²⁺的吸附率随Cd²⁺浓度的增加而逐渐降低, 当Cd²⁺浓度为100 mg·L^-1时, 链霉菌CdTB01干菌粉的Cd²⁺吸附率达到70.45%, 对Cd²⁺的吸附量为70.45 mg·g^-1；当Cd²⁺浓度为900~2100 mg·L^-1时, 虽然链霉菌CdTB01干菌粉对Cd²⁺的吸附率影响不大, 但吸附量不断增加.综上所述, 外界环境因素对链霉菌CdTB01干菌粉吸附Cd²⁺的影响相对较小, 说明可能主要通过影响细胞表面组分和性质来对重金属的吸附造成影响, 链霉菌CdTB01干菌粉最佳Cd²⁺吸附条件为：温度30 ℃, pH=9.0, NaCl质量分数0%, Cd²⁺浓度100 mg·L^-1, 该干菌粉在最佳吸附条件下对Cd²⁺的吸附率达到70.45%.

相比于传统的化学、物理修复法, 微生物吸附有着其它修复技术无法比拟的特性.刘振扬等(2006)研究了啤酒酵母去除工业废水中Cd²⁺的过程, 其单位吸附量达到46.5 mg·g^-1.Limcharoensuk等(2015)从泰国锌矿山土壤中分离筛选得到的菌株Pseudomonas aeruginosa B237对Cd²⁺有明显的去除能力, 其单位生物量对Cd²⁺的最大吸附能力为16.89 mg·g^-1.白红娟等(2006)测定了球形红细菌H菌株对不同浓度镉的去除率, 当Cd²⁺浓度为320~160 mg·L^-1时, 其吸附率仅为18.8%~36.6%.根据微生物吸附Cd²⁺最明显的两大特性：胞内吸收和胞外吸附, 分别对链霉菌CdTB01湿菌体和干菌体吸附Cd²⁺的能力进行了研究, 发现温度和pH对链霉菌CdTB01湿菌体的Cd²⁺吸附率影响较大, 而对干菌体的Cd²⁺吸附率影响较小.NaCl质量分数可以提高湿菌体整体的Cd²⁺吸附率, 但对干菌体的Cd²⁺吸附率会造成严重的干扰, 因此, 在培养制备干菌体的菌株时, 不要在其生长环境中加入NaCl.Cd²⁺浓度对链霉菌CdTB01湿菌体和干菌体的影响都非常明显.实验表明, 链霉菌CdTB01湿菌体更适合处理Cd²⁺浓度范围为100~900 mg·L^-1的溶液, 该环境中Cd²⁺吸附率可以达到20%~45%.链霉菌CdTB01湿菌体在Cd²⁺浓度过低的环境中生长并没有受到Cd²⁺的抑制, 主要靠细胞壁上的吸附位点来吸附少量Cd²⁺, 因而吸附率并不高.而当Cd²⁺浓度过高时吸附率则显著下降, 原因可能主要是一方面链霉菌CdTB01湿菌体的生长受到抑制, 影响了胞内吸附过程所需要的能量；另一方面, 细胞壁上的吸附位点达到饱和.这与Huang等(2014)在研究蜡样芽孢杆菌在不同浓度的含镉环境中的不同抗镉机制时发现的结论一致, 即环境中Cd²⁺浓度较低时主要以胞内结合沉淀为主, 而Cd²⁺浓度较高时胞外吸附机制就会占主导地位.干菌体的吸附特性和湿菌体不同, 主要靠细胞壁和代谢产物上有效基团来对Cd²⁺进行吸附, 因此, 更适合低Cd²⁺浓度环境的吸附.结果显示, Cd²⁺浓度为100 mg·L^-1时, 干菌粉的吸附率达到70.45%, 对Cd²⁺的吸附量达到70.45 mg·g^-1.在实际治理镉污染过程中可以针对不同的含镉浓度环境, 来选择CdTB01湿菌体或干菌粉来进行治理.

4 结论(Conclusions)

1) 本研究从镉污染土壤中分离筛选获得一株在液体培养基和固体培养基中分别能够耐受45 mmol·L^-1和50 mmol·L^-1 Cd²⁺的细菌, 经形态学、生理生化和分子鉴定, 该菌株被鉴定为链霉菌属, 命名为Streptomycessp. strain CdTB01.

2) 利用单因素试验对耐镉链霉菌Streptomycessp. strain CdTB01的培养条件进行优化, 优化后的培养条件为：马铃薯蔗糖培养基, 在250 mL的三角瓶中装液量90 mL, 培养温度30 ℃, 初始pH=6.0, 接种量6.0%, NaCl质量分数0%.

3) 链霉菌Streptomycessp. strain CdTB01湿菌体吸附Cd²⁺的优化条件为：温度30℃, pH=8.0, NaCl质量分数1.0%, Cd²⁺浓度500 mg·L^-1, 吸附率为44.78%；干菌粉吸附Cd²⁺的优化条件为：温度30 ℃, pH=9.0, NaCl质量分数0%, Cd²⁺浓度100 mg·L^-1, 吸附率达到70.45%, 吸附量达到70.45 mg·g^-1.说明链霉菌Streptomycessp. strain CdTB01在重金属污水处理中具有重要的应用价值, 为合理利用微生物吸附剂来治理镉污染环境提供了科学依据.