20世纪80年代末兴起的纳米技术成为一场新的技术革命，对各学科领域及生产生活都产生了深远的影响.金属氧化物纳米材料由于其独特的物理化学性质，如表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应等，被广泛用作杀菌剂(Dastjerdi et al., 2010;Foster et al., 2011) 、催化剂(Marugan et al., 2010;Guo et al., 2011) 、涂层(Miklecic et al., 2015)和化妆品(Singh et al., 2014)等.例如，Talebian等(2014) 研究发现，nSnO₂在可见光和紫外光诱导下对大肠杆菌均有很好的杀菌效果.Koohestani等(2015) 报道了4种不同几何形态的nTiO₂对甲基橙和氰化物的催化降解性能，其中，网络状的nTiO₂催化性能最好.目前，这类纳米材料受光激发生成的载流子和活性氧化物种被认为是其具有杀菌、催化性能的主要原因(Li et al., 2012) .金属氧化物纳米材料在给人们生活带来方便的同时也产生了一些负面影响.在生产、运输及使用过程中，纳米金属氧化物会通过雨水的冲刷、风的侵蚀等进入环境介质，并通过呼吸、皮肤接触、食物链等进入生物体，引发新的环境、健康和安全问题(王大力等, 2012;陈安伟等, 2014) .目前，普遍认可的毒性来源是活性氧化物种所引起的氧化应激和氧化损伤(Lin et al., 2009) .活性氧化物种(Reactive Oxygen Species，ROS)是一类含氧的化学反应活性很高的分子，包括羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O₂^-·)、单线态氧(¹O₂)和过氧化氢(H₂O₂)等.研究表明，ROS会造成DNA和肝细胞损伤，破坏核酸、脂类、蛋白质等生物大分子的结构，从而对机体造成伤害(Du et al., 2004; Ahamed et al., 2016) .

电子顺磁共振(Electron Paramagnetic Resonance，EPR)是一种研究含有未成对电子物质最有效的方法.在检测过程中，EPR不会影响实验体系中的物理化学反应，因此，可以得到真实反应过程中的物质结构信息及动力学规律(王翠平等, 2013) .EPR已被广泛应用在生物学、医学、物理学等许多领域(Abbas et al., 2016; Wang et al., 2016; Konstantatos et al., 2016) .近年来已有将EPR用于检测纳米金属材料产生瞬时态自由基研究的报道(Xu et al., 2011;He et al., 2014) .由于自由基具有高的反应活性，大都寿命很短，通常通过加入自旋捕捉剂或自旋标记物的方法进行检测.加入的自旋捕捉剂会与自由基形成具有相应特征峰且相对稳定的自旋加合物，从而通过特征峰来判断自由基的种类(He et al., 2014) .通过EPR自旋捕捉和自旋标记技术，不仅能够得到光生电子和每种ROS加合物的特征谱图从而获得其种类和生成量，还可以直接获得其动力学信息，掌握每种物质在不同时间内产生的情况.

本文选择5种广泛应用于工业且具有灭菌特性的纳米金属氧化物nAl₂O₃、nCuO、nFe₂O₃、nTiO₂和nZnO作为目标物进行实验，通过EPR技术研究紫外光诱导下每种金属氧化物悬浮液生成的光生电子和活性氧化物种的种类，并对比不同金属氧化物受光激发后生成活性物种的能力.同时，采用EPR技术捕捉光生电子和ROS，进一步验证EPR自旋捕捉和自旋标记技术在纳米材料受光激发生成ROS方面的应用，并在理论上解释纳米金属氧化物受光激发生成ROS的机制，以期为预测和评价纳米金属氧化物的催化性能及环境风险提供一定的理论支持.

nFe₂O₃、nAl₂O₃和nZnO购自Aladdin公司；nCuO购自Adamas公司；nTiO₂(P25) 购自Sigma公司，粒径为(35±10) nm；磷酸二氢钠(NaH₂PO₄，GR)购于天津市大茂化学试剂厂；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄，AR)购自天津市光复精细化工研究所；5, 5-二甲基-1-毗咯琳-氧化物(5, 5-Dimethy-1-pyrroline N-oxide，DMPO)购买自Dojindo公司；二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide，DMSO)购自于AccuStandard公司；4-氧代-2, 2, 6, 6-四甲基-1-哌啶基氧基(4-Oxo-2, 2, 6, 6-tetramethyl-1-piperidinyloxy，4-Oxo-TEMP)和2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-氧基(2, 2, 6, 6-Tetramethylpiperidine-1-oxyl，TEMPO)购买于Sigma公司.

本研究是在常温条件下通过Bruker EMX EPR spectromemter进行测定，以100 W汞灯(Oriel；GmbH&Co.KG，Darmstadt，Europe)作为光源诱导纳米金属氧化物产生光生电子及ROS，其波长为265~800 nm，并用pH=5.6的磷酸缓冲溶液(PBS)来控制实验体系的pH.对于EPR测定，用直径0.55 mm的毛细管抽取50 μL待测样品，将毛细管插入EPR管底部，再将EPR管放置在谐振腔中心位置，打开汞灯，进行在线光照.所有的EPR测定参数如下：中心磁场3367 G，扫场宽度100 G，调制频率100 Hz，调制幅度1 G，扫描次数5，微波功率21.45~21.95 mW，时间常数163.84 ms，扫场时间40.96 ms.

对于ROS的测定，将每种自旋捕捉剂或自旋标记物与0.2 mg·mL^-1的纳米金属氧化物悬浮液混均，并记录在光照0、2、5和8 min时的EPR谱图.为了进一步确定每种ROS的种类，选择0.03 mmol·L^-1的TEMPO作为光生电子的标记物来检测光生电子的生成；48 mmol·L^-1的DMPO用于捕捉·OH和O₂^-·从而判断是否有·OH和O₂^-·的生成；30 mmol·L^-1的4-oxo-TEMP作为¹O₂的捕捉剂来测定¹O₂的产生.为了进一步验证O₂^-·的生成，还加入了·OH的猝灭剂DMSO.DMSO可以被·OH氧化形成二甲基砜(Methyl-Sulfonyl-Methane，MSM)，从而消耗掉·OH.

先前的研究表明(Li et al., 2012;Jia et al., 2014;He et al., 2016)，当纳米金属氧化物受到强光照射，其吸收的能量高于自身带隙时，价带电子受光激发跃迁至导带形成载流子，即导带电子(e^-)和价带空穴(h⁺).导带电子具有强还原性，能够与吸附在表面的O₂反应生成O₂^-·.空穴与吸附的H₂O或OH^-通过氧化反应生成·OH，具体如图 1所示.

图 1(Fig. 1)

图 1 纳米金属氧化物光诱导产生载流子和活性氧化物种 Fig. 1 Photogenerated carriers and active oxidation species of nano-metal oxides nanoparticles

其中，带隙(E_g)是指导带(E_c)和价带(E_v)之间的能量差，不同的纳米金属氧化物有着不同的带隙.一般来说，金属氧化物纳米材料光诱导产生ROS (·OH、O₂^-·和¹O₂)的种类与自身的电子能带结构及生成不同ROS所发生反应的氧化还原电位(E⁰)有密切的联系.通过比较纳米金属氧化物的E_c、E_v和其表面吸附物质的E⁰，可以在理论上预测每种纳米材料生成ROS的种类和能力(Jia et al., 2014;He et al., 2016) .

图 2显示了5种纳米金属氧化物的能带结构与每种ROS氧化还原电位的比较.以标准氢电极(Normal Hydrogen Electrode，NHE)作为参比，在水溶液中溶解氧/超氧阴离子电对(O₂(aq.)/O₂^-·)的氧化还原电位是-0.2 eV，单线态氧/溶解氧电对(¹O₂/O₂)的氧化还原电位是1.88 eV，水/羟基自由基电对(H₂O/·OH)的氧化还原电位是2.2 eV (Li et al., 2012) .体系中要生成O₂^-·，则纳米材料光生电子的电位需低于-0.2 eV，才有足够的还原性将O₂还原为O₂^-·.同样的，体系中若有¹O₂和·OH生成，说明该材料光生空穴的电位一定大于1.88 eV和2.20 eV，才有足够的氧化能力将O₂和H₂O (OH^-)氧化为¹O₂和·OH.

图 2(Fig. 2)

图 2 五种纳米金属氧化物的能带结构与每种ROS的氧化还原电位 Fig. 2 Band structures of the five kinds of nano-metal oxides and the redox potential of each ROS

光生电子是纳米金属氧化物受光激发产生的一个很重要的中间产物，具有强还原性，对于光催化降解等性能有着至关重要的影响.本实验通过TEMPO作为EPR自旋标识剂对光生电子进行表征.前人研究表明(He et al., 2014)，TEMPO不仅不与金属氧化物自身反应，同时与光诱导产生的空穴及ROS也不发生反应，是一种很稳定的光生电子标识剂，本实验也得到了相同的结果.从图 3a可以看到，TEMPO纯溶液在光照2 min及TEMPO-nTiO₂混合体系未光照条件下的EPR谱图与未经光照的TEMPO纯溶液的EPR谱图基本相同，说明光照对TEMPO并无影响，且在光照条件下也不与TiO₂金属氧化物发生反应.但TEMPO-nTiO₂混合体系光照2 min后发现，其EPR强度降低，这是由于nTiO₂受光激发生成了光生电子，并通过反应TEMPO + e^-→ TEMPOH生成没有顺磁性的物质TEMPOH，从而降低了EPR谱图的强度.这也是TEMPO能够作为光生电子自旋标记剂的原因.

图 3(Fig. 3)

图 3 不同金属氧化物产成光生电子的EPR谱图(a, b)和TEMPO的消耗率(c) Fig. 3 EPR spectrum of photoproduced electrons from different nano-metal oxides (a, b) and the consumption rate of TEMPO (c)

图 3b显示了不同金属氧化物光照2 min时生成光生电子的EPR谱图.从图 3b中可以很明显地看到，nTiO₂和TEMPO混合体系的EPR谱图强度最低，说明nTiO₂在光照条件下生成的电子最多.5种纳米金属氧化物产生光生电子的能力为：nTiO₂>nCuO>nZnO>nFe₂O₃>nAl₂O₃.通过积分得到每种氧化物产生光生电子的大致情况，即通过TEMPO的减少间接反映光生电子的生成情况(图 3c).其中，nTiO₂消耗了65.66%的TEMPO，是5种氧化物中消耗TEMPO最多的；其次是nCuO (37.41%)、nZnO (22.02%)、nFe₂O₃(7.64%)和nAl₂O₃(0.45%).产生光生电子的能力受到物质本身带隙结构的影响，带隙越低，价带电子跃迁至导带所需的能量越少，则越容易形成光生电子.从图 2可以看到，5种金属氧化物的带隙为nCuO (E_g=1.7 eV)＜ nFe₂O₃(E_g=2.2 eV)＜ nTiO₂(E_g=3.2eV)、nZnO (E_g=3.2 eV) ＜nAl₂O₃(E_g=8.5 eV).但nTiO₂和nZnO体系中光生电子的产生量并没有像预期中低于nCuO和nFe₂O₃，其原因可能是锐钛型nTiO₂对紫外光有很强的吸收能力(畅文凯, 2013)，而nZnO可能具有高的电子转移率(Chang et al., 2016) .

·OH是ROS中最重要的组成部分，具有强的氧化性.本研究以DMPO作为捕捉剂，对·OH和O₂^-·进行表征.图 4显示了不同金属氧化物体系在光照条件下产生的DMPO/·OH加合物的EPR谱图.DMPO的PBS体系和金属氧化物-DMPO混合体系(除nCuO体系之外)在未光照时均没有EPR信号.在nCuO体系中，未进行光照时就有少量·OH生成，且体系中碳中心自由基的信号强度(六重峰)较强.在光照2 min后，DMPO的PBS体系、nCuO体系和nTiO₂体系均出现了1:2:2:1的特征峰，该特征峰是DMPO与·OH反应形成的加合物DMPO/·OH的EPR谱图.说明在光照2 min时，PBS溶液中会有少量的·OH生成，同时在nTiO₂体系出现了DMPO/·OH的特征谱图(图 4a)，说明nTiO₂也有·OH生成.nCuO体系中·OH的生成量明显增加(图 4b)，碳中心自由基的信号大幅度降低.但在光照2 min 时，nAl₂O₃和nZnO的EPR信号强度与DMPO的PBS体系中的一样，说明nAl₂O₃和nZnO体系中并没有生成·OH.延长光照时间，发现在光照5 min时，nAl₂O₃和nZnO开始有·OH生成，但生成量很少(图 4c和4d)；光照至8 min时，·OH的生成量缓慢增加.但nFe₂O₃在光照过程中并没有生成·OH (图中未给出).从图 2可知，5种金属氧化物nAl₂O₃(E_v=5.58 eV)、nCuO (E_v=2.39 eV)、nFe₂O₃(E_v=2.66 eV)、nTiO₂(E_v=2.97 eV)和nZnO (E_v=3.08 eV)的价带电位均高于H₂O/·OH的氧化还原电位(E_g=2.2 eV)，说明这5种金属氧化物所产生的空穴均有足够的氧化能力将H₂O氧化生成·OH.实验结果显示，nFe₂O₃在光照过程中并没有生成·OH，该结果与Guichard等(2012) 的报道的一致，Guichard等指出，用EPR对自由基进行表征时，nFe₂O₃需要额外加入中间分子(H₂O₂和抗坏血酸)才能生成自由基.从图 4a和b中可以看出，nTiO₂产生的·OH的信号强度明显高于nCuO，这可能是因为nTiO₂(E_v=2.97 eV)的价带电位高于nCuO (E_v=2.39 eV)，有更强的氧化性从而产生更多的·OH.尽管nAl₂O₃(E_v=5.58 eV)和nZnO (E_v=3.08 eV)的价带电位高于nTiO₂(E_v=2.97 eV)，但有文献指出，nAl₂O₃对自由基有猝灭作用(Parham et al., 2016)，nZnO在PBS中会形成Zn₃(PO₄)₂而发生团聚造成其分散性变差，同时PO₄^3-会抑制空穴的转移，阻止空穴与H₂O反应生成·OH (Ng et al., 2013) .

图 4(Fig. 4)

图 4 不同纳米金属氧化物在光照条件下产生的DMPO/·OH加合物的EPR谱图 Fig. 4 EPR spectra of DMPO/·OH adducts of different nano-metal oxides under lighting

为了进一步验证该体系是否有O₂^-·的生成，本研究在体系中加入了·OH猝灭剂DMSO，然后再进行EPR在线光照测定，实验结果如图 4所示.加入DMSO后，相同光照时间下的DMPO/·OH的EPR信号强度降低，同时出现了碳中心自由基的EPR信号(图 4a和4d)，但并没有出现DMPO与O₂^-·反应形成的加合物DMPO/·OOH的EPR特征峰(四重峰，强度比为1:1:1:1) .这可能是因为nCuO (E_c=0.69 eV)、nFe₂O₃(E_c=0.46 eV)和nZnO (E_c=-0.12 eV)的导带电位均高于O₂(aq.)/O₂^-·的氧化还原电位(E_g=-0.2 eV)，没有足够的还原能力将O₂还原为O₂^-·.对于nTiO₂(E_c=-0.28 eV)和nAl₂O₃(E_c=-2.95 eV)来说，这2种金属氧化物的导带价位均低于O₂(aq.)/O₂^-·的氧化还原电位(E_g=-0.2 eV)，应该具有足够的还原能力来还原O₂，但实验结果并未出现DMPO/·OOH的EPR特征峰，该实验结果与前人研究结果一致(Yin et al., 2012) .其原因可能是本实验在PBS体系中进行，存在大量的PO₄^3-，Ng等(2013) 指出，在nTiO₂体系中PO₄^3-不会抑制空穴与H₂O反应，而是会阻碍光生电子的转移，从而影响O₂^-·的生成，这也是nTiO₂在PBS体系中会生成大量·OH的原因.而nAl₂O₃光照生成的电子少，O₂^-·的生成量微弱，故观察不到.

4-oxo-TEMP与¹O₂反应能够生成具有三重峰(1:1:1) EPR信号的氮氧自由基TEMPO.从图 2可知，5种金属氧化物价带电位均高于¹O₂/O₂的氧化还原电位(1.88 eV)，说明这些金属氧化物可以与O₂反应生成¹O₂.图 5为光照2 min时4-oxo-TEMP 的PBS体系与不同金属氧化物体系中TEMPO的EPR谱图及信号强度.从图 5可以看出，nAl₂O₃、nCuO、nFe₂O₃、nTiO₂和nZnO体系中TEMPO的EPR信号强度高于PBS体系中的信号强度，说明这5种金属氧化物体系均有生成¹O₂，且生成量为nAl₂O₃>nCuO>nFe₂O₃>nZnO>nTiO₂.该实验结果与我们的预测结果相一致.体系中存在着如下的相互转化：

图 5(Fig. 5)

图 5 光照2 min时不同纳米金属氧化物上生成1O2的EPR信号强度 Fig. 5 EPR signal intensity of 1O2 from different nano-metal oxides at 2 min after irradiation

(1)

(2)

在光照条件下，光生电子会影响¹O₂所引起的EPR信号.从图 5可以看到，nTiO₂(E_v=2.97 eV)和nZnO (E_v=3.08 eV)的价带电位高于nCuO (E_v=2.39 eV)和nFe₂O₃(E_v=2.66 eV)，但nTiO₂和nZnO体系产生的¹O₂低于nCuO和nFe₂O₃体系(如图 5所示)，其原因可能是nTiO₂和nZnO在光照条件下生成的光生电子较多，消耗了TEMPO，导致EPR信号降低.nCuO在光照条件下生成的光生电子也较多，但加入TEMP后的EPR信号并未像nTiO₂和nZnO一样降低，可能是因为nCuO体系中生成的¹O₂更多，具体反应机理还需进一步研究.

本实验研究了nAl₂O₃、nCuO、nFe₂O₃、nTiO₂和nZnO 5种纳米金属氧化物在光照条件下产生活性物种的能力.通过EPR自旋捕捉和自旋标记技术，发现在光照过程中，不同的纳米金属氧化物产生光生电子的能力不同，5种金属氧化物产生光生电子的能力为：nTiO₂>nCuO>nZnO> nFe₂O₃> nAl₂O₃.同时，nAl₂O₃、nCuO、nTiO₂和nZnO能够生成2种ROS (·OH和¹O₂)，而nFe₂O₃只生成了一种ROS (¹O₂).电子能带结构是影响光生电子和ROS产生的重要原因，其次物质本身的一些特性，如对光的吸收、粒径的大小也会产生一定的影响.本实验结果可以为纳米金属氧化物催化性能及环境风险的预测和评价提供一定的理论支持.