1 引言(Introduction)

镍(Ni)是植物生长必需的微量元素，适量Ni可促进作物生长，过量Ni对作物有毒害作用(刘国栋，2001；朱京涛等，2008；杨红超等，2011；李雪等，2015).作物吸收Ni不仅会影响其生长发育，同时其产品通过食物链进入人体也会产生健康危害(王夔，1992；刘易科等，2012).因此，研究土壤-作物系统中Ni的剂量-效应关系具有重要意义，其中，人们对作物Ni毒害效应的研究尤为关注.目前，关于谷物中Ni的食品卫生标准尚未制定，一般以作物减产10%时的土壤总Ni含量作为Ni的无观察效应浓度值.但由于土壤理化性质上的差异，造成土壤中不同结合形态Ni组成成分差异所带来的生物可利用性不同，加之由于作物品种之间在遗传属性、Ni敏感性和抗逆性上的差异，致使已有研究提出的小麦作物Ni无观察效应浓度指标均存在一定差异(蒋德福等，1987；张素霞等，1991；黄锦孙等，2012；白英等，2014)，为指导不同土壤类型和作物资源利用带来不便.因此，实现作物毒害效应的早期诊断，作为作物重金属毒害效应诊断评价方法的有益补充具有重要价值.已有研究表明，各种作物对重金属的反应，以及不同生育期对重金属的敏感程度和中毒反应有所不同，并且以作物的苗期最为敏感(青长乐等，1992).目前，已有学者成功运用小麦幼苗(三叶期)毒性指标表征了土壤Cd对小麦作物的毒害(杨林书等，1996)，而研究小麦发育前期生理指标Ni毒害效应与成熟期小麦籽实产量之间关系的系统报道较少，有关小麦外源Ni毒害效应的早期诊断技术尚未见报道.因此，本试验以春小麦“冀张春3号”品种为试材，采用盆栽试验方法，研究外源Ni对小麦三叶期幼苗生长发育和成熟期籽实产量的影响及相互关系，进一步探明外源Ni对小麦作物的生理效应和毒害机制，实现外源Ni胁迫环境下小麦作物资源毒害效应的早期诊断和评价，为小麦作物栽培生产和土壤资源安全性评价提供科学依据.

2 材料和方法(Materials and methods) 2.1 供试土壤和指示作物

背景土壤采自河北科技师范学院作物试验站，褐土，pH值为6.83，有机质为16.75 g · kg^-1，全N量为1.10 g · kg^-1，全P量为0.76 g · kg^-1，全K量为15.90 g · kg^-1，过3 mm筛孔备用.试验土壤采用土壤模拟污染方法，外源Ni投加量分别为0、25、50、100、200、400 mg · kg^-1，以不添加Ni作为对照，添加试剂为NiSO₄·6H₂O，同时按N 0.2 g · kg^-1、P₂O₅ 0.1 g · kg^-1和K₂O 0.1 g · kg^-1施肥量将CO(NH₂)₂、KH₂PO₄和K₂SO₄分别施入试验土壤中作为底肥，将Ni盐和化学肥料配成溶液后采用喷雾形式与土壤充分混合，并封于塑料袋中厌氧培养30 d，使土壤中Ni元素吸附达到完全平衡.各处理土壤样品经风干、研磨处理后测定其全量Ni和有效态Ni(4种提取试剂)的含量，具体值见表 2.供试作物品种为春小麦品种—冀张春3号.

2.2 盆栽试验

试验在具有遮雨设施的网室内自然光照条件下进行，将吸附平衡后的各处理剂量土壤充分混合均匀后，分别装入28 cm×40 cm(直径×高)的营养瓷盆中，每盆为一小区，每剂量处理3次重复.挑选籽粒饱满、大小均匀的小麦种子于2014年3月13日直播于土壤，每盆播种50~60粒，待第一片真叶长出后定苗，每盆35株.按常规要求进行管理，土壤湿度保持田间持水量的75%±2%.分别于小麦三叶期和成熟期采集小麦全植株样品，每盆3株，并将植株的根系、茎、叶、籽粒等组织器官分解处理，其中，三叶期幼苗茎和叶合并处理，分别测定其鲜质量，然后经80 ℃(籽粒)或105 ℃(根系和茎叶)杀青处理后，在65 ℃或70 ℃恒温条件下烘干至恒重，并称其干质量.样品经组织研磨仪研磨处理后，置于自封袋中保存待测.

2.3 分析方法

土壤和植株全Ni含量测定分别采用王水-HClO₄(V(HCl) : V(HNO₃) : V(HClO₄)=3 : 1 : 1) 和HNO₃-HClO₄(V(HNO₃) : V(HClO₄)=4 : 1) 混合酸消化处理；土壤有效态Ni提取采用文献(王鹏新，1993)中单一提取方法进行，即分别采用H₂O、HCl、CaCl₂、DTPA进行浸提处理.提取液浓度：H₂O(去离子水)、0.1 mol · L^-1HCl、0.1 mol · L^-1CaCl₂(pH=7.0)、0.005 mol · L^-1 DTPA-0.1 mol · L^-1 TEA-0.01 mol · L^-1 CaCl₂溶液(pH=7.30)；提取时间：DTPA为2 h，H₂O、HCl、CaCl₂均为1 h，土液比: m(土壤) : V(DTPA)=1 : 2，m(土壤) : V(H₂O，HCl，CaCl₂)=1 : 5，提取温度：均为恒温(25±1) ℃，往复振荡频率180次· min^-1.土壤和植株样品处理液均采用Optima2100DV等离子体发射光谱仪测定，其含量值均以干重计.

植株样品中可溶性糖含量测定采用碱性酒石酸铜滴定法(GB 5009.7—2016)，硝酸盐含量测定采用分光光度法(GB 5009.33—2010)，淀粉含量测定采用酸水解法(GB/T 5009.9—2008)，抗坏血酸(Vc)含量测定采用2, 6-二氯靛酚法(GB 5009.86—2016)，其含量值均以鲜重计.

生物富集系数是衡量土壤重金属被植物吸收难易程度的指标，其值越大表示该重金属越易被植物吸收.Ni生物富集系数(BCF)的计算见式(1).

(1)

式中，C_W为小麦某一器官中Ni含量(mg · kg^-1)，C_S为土壤中全Ni量(mg · kg^-1).

数据方差分析采用DPS7.05 Duncan新复极差法进行差异性显著测定，采用SPSS17.00软件进行数据相关分析.

3 结果(Results) 3.1 外源Ni对小麦三叶期幼苗生长发育及成熟期籽实产量的影响

由表 2可知，外源Ni抑制了小麦三叶期幼苗生长发育，降低小麦植株株高和茎叶鲜质量，且25 mg · kg^-1处理下表现较为明显，可能与土壤中外源Ni影响小麦种子萌发速度有关.同时抑制了小麦茎叶干物质的积累，其中，25和50 mg · kg^-1 Ni处理较对照分别下降9.47%和0.75%(p>0.05)，干鲜比值增加；100、200和400 mg · kg^-1Ni处理较对照分别下降22.24%、16.21%和23.99%，方差分析均达到显著水平(p < 0.05)，干鲜比值下降.表明适量Ni对小麦茎叶干物质积累影响较小，而过量Ni对干物质积累影响较大，外源Ni对小麦三叶期幼苗茎叶干质量影响的无观察效应浓度为100 mg · kg^-1.

外源Ni会降低小麦成熟期籽实千粒重和单区产量(表 2)，且表现为低剂量产量略下降，高剂量产量下降明显.其中，25、50 mg · kg^-1 Ni处理下，小麦千粒重较对照分别下降0.43%、0.61%(p>0.05)，单区产量较对照分别下降0.22%、1.94%(p>0.05)；100、200、400 mg · kg^-1处理下，小麦千粒重较对照分别下降7.29%、9.81%、12.07%，单区产量较对照分别下降15.32%、17.26%、19.77%，方差分析均达到显著水平(p < 0.05).各处理籽实千粒重和单区产量的降幅均值分别为0.32%、1.28%、11.30%、13.54%和15.92%，其中，Ni投加量≥100 mg · kg^-1时小麦成熟期籽实产量减产10%以上，由此可见，外源Ni对小麦成熟期籽实产量影响的无观察效应浓度为100 mg · kg^-1.结果显示，外源Ni对小麦成熟期籽实产量的影响与三叶期幼苗干物质量的影响规律一致，表明小麦生育前期三叶期幼苗生物产量变化与作物产量之间关系密切.

3.2 外源Ni对小麦三叶期幼苗茎叶生理指标的影响 3.2.1 可溶性糖

外源Ni会影响小麦三叶期幼苗茎叶中可溶性糖含量的变化(图 1a)，其中，25和50 mg · kg^-1Ni处理下，小麦茎叶中可溶性糖含量较对照分别增加4.53%和0.11%(p>0.05)；100、200和400 mg · kg^-1Ni处理下，可溶性糖含量较对照分别下降12.32%、25.79%和32.00%，方差分析均达到显著水平(p < 0.05或p < 0.01).结果表明，适量Ni能增加小麦幼苗茎叶中可溶性糖含量，过量Ni会降低小麦幼苗茎叶中可溶性糖含量，外源Ni对小麦幼苗茎叶可溶性糖影响的无观察效应浓度为100 mg · kg^-1.

3.2.2 淀粉

外源Ni会增加小麦三叶期幼苗茎叶中淀粉的含量(图 1b)，其中，25 mg · kg^-1 Ni处理下淀粉含量增加最为明显，较对照增加67.00%(p < 0.01)；之后随Ni投加量的增加淀粉含量较对照增加的幅度有所下降，50、100和200 mg · kg^-1Ni处理下，淀粉含量较对照分别增加13.00%、24.00%和32.00%，方差分析均达到显著水平(p < 0.05或p < 0.01)；400 mg · kg^-1Ni处理下淀粉含量较对照增加3.00%(p>0.05).

3.2.3 硝酸盐

外源Ni对小麦三叶期幼苗茎叶中硝酸盐含量有影响(图 1c)，其中，25和50 mg · kg^-1Ni处理下，小麦茎叶中硝酸盐含量较对照分别增加1.60%(p>0.05) 和19.00%(p < 0.01)；100、200和400 mg · kg^-1Ni处理下，硝酸盐含量呈明显下降，较对照分别下降27.86%、22.10%和22.35%，方差分析均达到显著水平(p < 0.01).结果显示，小麦三叶期幼苗茎叶中硝酸盐含量变化与可溶性糖含量变化规律表现一致，外源Ni对小麦幼苗茎叶硝酸盐影响的无观察效应浓度为100 mg · kg^-1.

3.2.4 抗坏血酸(Vc)

外源Ni能够增加小麦三叶期幼苗茎叶中抗坏血酸的含量(图 1d)，其中，25 mg · kg^-1Ni处理下抗坏血酸含量增加幅度最大，较对照增加67.12%(p < 0.01)，之后随投加Ni量增加，抗坏血酸含量较对照增加幅度有所下降，50、100、200和400 mg · kg^-1Ni处理下，抗坏血酸含量较对照分别增加52.90%、29.40%、19.44%和38.26%，方差分析均达到显著水平(p < 0.01).结果显示，外源Ni对小麦三叶期幼苗茎叶中抗坏血酸的影响与淀粉影响规律一致.

3.3 外源Ni对小麦三叶期幼苗中Ni含量的影响

外源Ni可促进小麦三叶期幼苗Ni的吸收(图 2a)，随Ni投加量的增加，小麦幼苗根系和茎叶中Ni含量呈明显增加趋势(p < 0.01)，且根系中Ni含量明显高于茎叶中Ni含量(p < 0.01).0、25、50、100、200和400 mg · kg^-1处理下，根系中Ni含量分别为14.54、70.99、137.91、361.78、684.44、1145.26 mg · kg^-1；茎叶中Ni含量分别为3.04、7.03、5.89、15.37、17.21和38.35 mg · kg^-1.造成Ni含量明显差异的原因与Ni富集能力大小有关(图 2b)，随投加Ni量增加，根系Ni富集系数呈明显增加趋势，茎叶Ni富集系数呈明显下降趋势，其中，根系富集系数大于1，表明小麦三叶期幼苗根系吸收富集Ni的能力最强，小麦幼苗从土壤中吸收的Ni主要积累于地下根部.已有研究结果显示，小麦三叶期幼苗根系Ni累积分配率占整株的75.60%(任艳军等，2016).由此可见，外源Ni改变小麦三叶期幼苗各器官中Ni的吸收与分配，Ni含量变化可能是影响小麦三叶期幼苗茎叶干物质积累和成熟期籽实产量变化的重要因子.

4 讨论(Discussion) 4.1 Ni对小麦生长发育的影响

Ni是植物脲酶蛋白结构的必需组成成分(Eskew et al., 1983)，适量Ni有利于植物氮素代谢，促进干物质积累(Patrick et al., 1987)；过量Ni则不利于光合代谢，减少光合产物的积累与贮存，进而产生毒害作用(Gajewska et al., 2006).研究结果表明，Ni投加量 < 100 mg · kg^-1时，小麦三叶期幼苗茎叶生物产量和成熟期籽实产量均未明显下降，且干鲜比值增加；Ni投加量≥100 mg · kg^-1时，小麦三叶期幼苗生物产量和成熟期籽实产量均明显低于对照，差异均达到显著水平(p < 0.05).造成小麦成熟期籽实产量下降与小麦生长发育前期(三叶期)毒害效应密切相关，相关分析结果显示，小麦三叶期幼苗茎叶生物产量与籽实产量变化表现出显著的正相关关系.表明小麦作物外源Ni毒害效应作用于整个生育期，尤其在小麦幼苗生长发育阶段(三叶期)表现出与小麦成熟期籽实产量Ni毒害的一致性，本研究认为，造成小麦幼苗茎叶生长受到抑制与茎叶中Ni吸收积累有关.结果表明，外源Ni使土壤中有效态Ni(4种提取形态)含量明显增加(表 1)，有效态Ni易被植物吸收和利用，因此，造成小麦根系和茎叶中Ni含量的明显增加，且二者之间表现出显著的正相关关系(r=0.951~0.996, p < 0.01).由此说明，造成小麦三叶期幼苗毒害和成熟期籽实产量明显下降是作物体内Ni毒害所致，这与白英等(2014)的研究结果一致.

试验结果表明，过量Ni抑制小麦植株生长发育，造成叶绿素含量降低，光合能力下降(李雪等，2015；Kupper et al., 1998；Ewais, 1997)，引起植物体内贮存的光合产物(水溶性碳水化合物)可溶性糖含量明显下降(图 1a)；同时，影响根系对氮素营养的吸收和同化，造成小麦茎叶细胞中吸收的硝酸盐含量减少(图 1c)，植株利用氮素的能力下降，降低了氮源积累速度(梁永超等，1999；齐泽民等，2001).由于碳源、氮源积累速度降低，最终导致植物生长发育受到抑制(卞雅姣等，1985；Lee et al., 1979；Fan et al., 1999).相关分析结果显示，外源Ni与茎叶干质量和可溶性糖含量均呈显著负相关，但与硝酸盐含量的相关性不显著(表 3).同时研究认为，可溶性糖是淀粉合成的底物，其含量的高低与淀粉积累密切相关(Echeverria et al., 1997).结果显示，外源Ni投加量低时，小麦幼苗茎叶中可溶性糖含量增加(图 1a)，其淀粉含量随之增加(图 1b)，外源Ni投加量高时，可溶性糖含量下降，淀粉含量仍表现积累趋势.多项研究认为，淀粉与可溶性糖含量之间存在一定的关系，但中间过程可能比较复杂(刘晓冰，1996)，从外源Ni与淀粉之间的相关性不显著已得到验证(表 3).抗坏血酸(AsA)又名维生素C，对于植物自身的抗氧化作用、光保护及调节生长发育等具有生理功能作用，可以直接清除植物体内因氧代谢、光合作用及环境胁迫等产生的活性氧(ROS)，保护植物有机体氧化胁迫所造成的伤害(Smirnoff, 1996；Alscher et al., 1997).本文试验结果中小麦幼苗体内抗坏血酸含量的增加可能是外源Ni胁迫的应激生理反应结果.

4.2 小麦Ni的无观察效应浓度

有关作物中重金属的无观察效应浓度值，可以采用达标临界值，即可食部位达到食品卫生标准时的土壤重金属含量.由于谷物中Ni的食品卫生标准尚未制定，因此，一般以作物减产5%~10%时的土壤全量Ni或土壤有效态Ni含量等指标作为Ni的无观察效应浓度值，减产幅度的选择主要是产量的数额，数额大者取低限，数额小者取高限(青长乐等，1992).白英等(2014)研究发现，土壤中添加Ni的无观察效应浓度值为240 mg · kg^-1时，小麦各器官干重平均减少11.60%；张素霞等(1991)报道，盆栽实验小麦明显受害的Ni投加量为150 mg · kg^-1；蒋德福等(1987)研究发现，盆栽小麦土壤中添加Ni量为200 mg · kg^-1以后会对小麦产生明显抑制作用；黄锦孙等(2012)研究提出，祁阳土壤外源Ni对小麦籽粒的无观察效应浓度值为41.00 mg · kg^-1，当祁阳土壤外源Ni高于100 mg · kg^-1时小麦全部死亡.本研究发现，外源Ni对小麦三叶期幼苗茎叶干质量、可溶性糖和硝酸盐等生理指标与成熟期籽实产量影响的无观察效应浓度值一致，均为Ni投加量100 mg · kg^-1，超过该值，小麦三叶期幼苗茎叶干质量、可溶性糖、硝酸盐含量和成熟期籽实产量均呈显著下降，小麦籽实产量平均减少11.30%及以上，因此，试验确定外源Ni对小麦成熟期籽实产量影响的无观察效应浓度为土壤全Ni含量139.08 mg · kg^-1(含土壤背景值).这与文献(张素霞等，1991)报道中作物受害时土壤中Ni的无观察效应浓度值大多在50~150 mg · kg^-1范围内相吻合.由此表明，小麦Ni的无观察效应浓度值的差异可能与供试土壤环境和作物品种不同有关.

青长乐等(1992)研究报道，由于植物所表现的忍耐力和抗性的差异，即植物的重金属敏感度不同，各种植物对土壤重金属的反应皆以植物的苗期最为敏感，通过研究作物苗期生理指标毒害效应变化，实现作物重金属毒害的早期诊断.试验研究发现，外源Ni与小麦三叶期幼苗茎叶干质量和可溶性糖含量变化及与成熟期籽实产量变化均表现出显著的负相关关系(表 3)；同时发现小麦三叶期幼苗茎叶干质量、可溶性糖和硝酸盐等指标变化与成熟期籽实产量指标均表现显著的正相关关系(表 4)，由此研究提出，利用小麦三叶期幼苗毒害效应指标表征成熟期籽实产量Ni毒害是可行的.根据文献报道(青长乐等，1992；杨定清等，1994；马建军等，2006)，作物植株体内Ni、土壤有效态Ni (DTPA)、根系Ni均可作为小麦作物Ni的无观察效应浓度值.

5 结论(Conclusions)

外源Ni对小麦三叶期幼苗生长发育和成熟期籽实产量均有显著的影响，Ni投加量较低时，三叶期幼苗茎叶生物量和成熟期籽实产量无明显变化，三叶期幼苗茎叶可溶性糖、硝酸盐、淀粉和抗坏血酸(Vc)含量明显增加；Ni投加量较高时，三叶期幼苗茎叶生物量、可溶性糖和硝酸盐含量等指标明显下降，成熟期籽实产量显著减少，三叶期幼苗茎叶毒害效应指标与成熟期籽实产量指标具有显著的相关性，且无观察效应浓度一致.研究提出，小麦三叶期幼苗毒害效应指标可作为成熟期籽实产量Ni毒害的早期诊断指标，外源Ni对小麦成熟期籽实产量影响的无观察效应浓度为：土壤全Ni含量为139.08 mg · kg^-1(含土壤背景值)，土壤有效态Ni (DTPA提取)含量为21.59 mg · kg^-1，小麦幼苗茎叶Ni含量15.37为mg · kg^-1，小麦幼苗根系Ni含量为361.78 mg · kg^-1.有关其它土壤类型和作物品种外源Ni毒害的早期诊断指标尚有待进一步研究确定.