2018, Vol. 38
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2. Division of Plant Sciences, University of Missouri, Columbia, MO65211, USA;
3. 湖南师范大学生命科学学院, 长沙 410000
2. Division of Plant Sciences, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA;
3. School of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410000
铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是一种淡水水域常见蓝藻，会在适宜环境条件下种群暴发形成微囊藻水华(Preston et al., 1980；Robert, 2008；Paerl et al., 2013).铜绿微囊藻水华频繁暴发不仅与适宜的外界环境有关，更主要是因为铜绿微囊藻特殊的生活史，即遇到外界环境胁迫时会形成营养休眠体，沉降至水域底泥表层，以休眠方式度过环境恶劣期，当外界环境胁迫解除后铜绿微囊藻休眠体又会启动复苏，从底泥表层上迁至水体中，再次伺机暴发水华(Reynolds et al., 1981; Neilan et al., 2013).大量研究表明，底泥表层铜绿微囊藻休眠体是富营养化水体频繁暴发微囊藻水华的主要根源(Takamura et al., 1984; Wan et al., 2008).底泥表层铜绿微囊藻休眠体对浮游蓝藻生物量及表层水华的形成具有两方面的作用：一是作为浮游微囊藻生长的种源(Ståhl-Delbanco et al., 2003)，二是作为浮游微囊藻生物量的补充(Rossetti et al., 2010).因此，要揭示铜绿微囊藻水华频繁暴发的深层原因与机理，就要从铜绿微囊藻休眠体复苏环节着手，只有探明种源复苏的过程和机理，才有可能从源头上防控铜绿微囊藻水华的暴发.长期以来，环境科学领域的科研人员就铜绿微囊藻休眠体复苏的各种影响因子及作用机理展开了广泛研究，这些复苏相关影响因子主要集中在营养盐(Ståhl-Delbanco et al., 2003; Schone et al., 2010)、温度(Cáceres et al., 1984; 谭啸等，2009；Jähnichen et al., 2011)、光照强度(Brunberg et al., 2003；陶益等，2005)、底泥生物扰动及水动力(Tsujimura et al., 2000; Yamamoto, 2010)等方面.淡水水域底泥表层是铜绿微囊藻休眠体越冬或休眠的主要场所，而底泥表层的菌群种类丰富，休眠体和菌群及其周围环境构成了一个复杂的“底泥-水域”生态系统.本课题组曾从冲天湖(位于湖南省常德市鼎城区石拱桥镇东北侧，是一个面积约15.7 km2的典型淡水湖泊，枯水期平均水深1.35 m，丰水期平均水深1.80 m，系西洞庭湖水系，近年来频繁暴发春季微囊藻水华)底泥分离出1株优势菌E.sp013，并对铜绿微囊藻休眠体进行底泥复苏模拟实验，结果发现，E.sp013菌能促进铜绿微囊藻休眠体复苏(邹万生等，2017).为更深入探讨该湖底泥菌群对铜绿微囊藻休眠体复苏的影响和可能的作用机理，本文在上述环境因子条件下利用3株冲天湖底泥优势菌(1株微小杆菌Exiguobacterium.sp013，2株芽孢杆菌Bacillus.spD06与Bacillus.spD24)，按照不同配比对铜绿微囊藻休眠体进行复苏模拟实验，重点对菌群条件下的铜绿微囊藻休眠体光合效率进行探讨，并利用基因测序和差异性表达从分子水平对光合效率的变化机理进行部分揭示.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料 2.1.1 实验用培养液与底泥实验所用培养液为处理后的冲天湖湖水，湖水用10 μm网孔径的钢筛进行过滤预处理后带回实验室；底泥同样选取冲天湖浅层底泥，用网孔径125 μm的钢筛过滤预处理后带回实验室.为排除湖水与底泥中原生动植物及其他微生物对实验结果的干扰，对带回实验室的湖水和底泥采取灭菌(121 ℃，30 min)操作，同时为充分满足实验菌群与铜绿微囊藻休眠体复苏过程中的营养需求，在每1000 mL灭菌的湖水中分别加入20 mmol·L-1 NaNO3和4 mmol·L-1 K2HPO4各1 mL，改良后的湖水和底泥在4 ℃条件下冷藏备用(邹万生等，2017).
2.1.2 实验用菌株用于复苏实验的3株细菌均筛选自冲天湖表层底泥，2株芽孢杆菌Bacillus.spp(编号分别为Ba.spD06与Ba.spD24)和1株微小杆菌Exiguobacterium.spp (编号为E.sp013).首先将3株细菌用淡水细菌专用FWA培养基(蛋白胨5 g、酵母膏1 g、磷酸铁0.01 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.3)进行扩大培养.培养至指数生长阶段时，利用醋酸纤维膜(0.22 μm, Φ47 mm, Japan)进行过滤浓缩，立即用实验用培养液(2.1.1节)进行驯化培养(20 ℃，12 h)备用.
2.1.3 铜绿微囊藻休眠体在冲天湖水域暴发春季水华时取水样带回实验室，对水样中的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞进行分离纯化，然后接种到已经灭菌的实验用培养液(改良湖水)中培养25 d，培养期间温度为25 ℃，光照强度为50 μmol·m-2·s-1，利用叶绿素(Chla)丙酮提取法测定藻液浓度后，将扩大培养的铜绿微囊藻藻液移入棕色广口瓶，贴通气封口膜静置于无菌冰箱中(4 ℃、黑暗)3个月，吸去上层清液，浓缩制备成休眠体藻泥，检测并记录休眠体浓度(用Chla表示)后备用(Thomas et al., 1986).
2.2 实验方法 2.2.1 复苏实验设计复苏实验按菌株配比分成4个混合菌群组进行，即在无菌条件下用实验培养液稀释3种菌株至同一浓度(3×109 cfu·mL-1)，按不同体积比分为4个混合菌组，体积比VE.sp013:VBa.spD06:VBa.spD24=2:1:1为Mix-1，VE.sp013:VBa.spD06:VBa.spD24=1:2:1为Mix-2，VE.sp013:VBa.spD06:VBa.spD24=1:1:2为Mix-3，VE.sp013:VBa.spD06:VBa.spD24=1:1:1为Mix-4，混合菌组的菌浓度等同，再设一个对照组(不加菌).各取10 mL上述混合菌液和10 mL铜绿微囊藻休眠体藻液移入装有380 mL底泥(已经预处理)的特制圆柱形玻璃器皿中(Φ15 cm，高50 cm)，再将6320 mL实验用培养液沿圆柱玻璃器皿壁缓慢加入玻璃器皿中(防止培养液快速下流冲动休眠体和底泥)，最后用无菌通气封口膜(Φ 25 cm)进行盖封.对于对照组(CK)，用10 mL实验用培养液代替10 mL稀释菌液.所有实验组和对照组玻璃器皿同时置于人工气候箱(MMM Climacell, Germany)中培养15 d，光照强度为10 μmol·m-2·s-1 (与冲天湖春、秋季节底泥表层自然光强相当)，光暗比为12 h:12 h，温度设10、15、20和25 ℃4个梯度.除15 ℃条件下混合组Mix-4设5个平行样外(为满足基因测序所需剂量)，其余每个组设3个平行样.当复苏实验开始，立即从玻璃器皿中用微型封闭式底泥采样器(Beeker，PU-SEN)取2 g底泥测定出起始细菌浓度(6×107 cfu·g-1，以鲜重计)、铜绿微囊藻休眠体浓度(用叶绿素a表示，Chla 0.7 μg·g-1，以鲜重计)，然后每3 d于中午12：00定时取样进行指标检测.在培养的第1、2、3、4、5、6和7 d取样测定铜绿微囊藻休眠体细胞光合效率.同时，为考察较低温度下(15 ℃)菌群对铜绿微囊藻休眠体光合效率影响的基因表达差异，实验的第3、5和7 d对15 ℃条件下混合菌组Mix-4进行底泥取样，浮提预处理后对铜绿微囊藻休眠体基因测序，每次取样时间点为中午12：00.
2.2.2 底泥中铜绿微囊藻休眠体的浮提采用浮提方法将底泥中的铜绿微囊藻休眠体提取、分离出来，以测定其叶绿素a浓度(Chla)和光合系统的光合效率.具体操作参照文献(Verspagen et al., 2004)方法进行，即将5 g底泥样用20 mL硅石胶态悬浮液percoll(30%percoll配制：30%的percoll原液+10%的NaCl(质量分数8.5%)+60%的双蒸水)进行充分混匀后，用离心机进行离心(1800 r·min-1, 15 min)，将分层的上层液体(下层为底泥)用孔径为25 μm的醋酸纤维滤膜进行过滤，将捕获的微囊藻休眠体再与5 mL实验用液体培养基(2.1.1节)进行充分混匀.
2.2.3 细菌浓度与叶绿素a(Chla)的检测对于所有处理组(加菌组TR)和对照组(无菌组CK)，实验开始的第3、6、9、12和15 d从玻璃器皿中取底泥样和底泥表层水样(上覆水)进行细菌总浓度和叶绿素a的测定.底泥样用于测定各组的细菌浓度，方法采用吖啶橙荧光染色法(AO-F)，即取1 g湿底泥用实验用培养液稀释100倍，再取0.1 mL稀释液涂布在载玻片上，用95%的乙醇固定5 min，滴加0.01%吖啶橙(将1%吖啶橙原液用pH=7.0的PBS溶液稀释10倍)染色5 min，镜检观察计数，具体步骤参照文献(Yang et al., 2015)方法.底泥样与上覆水样均用于检测复苏的铜绿微囊藻藻细胞，以叶绿素a(Chla)为参数进行表示，检测方法采用丙酮提取法，即用移液枪吸取2 mL含铜绿微囊藻休眠体细胞的藻液置于10 mL离心管中，于12000 r·min-1下离心5 min，用移液枪吸去上清液.藻饼于2 mL 80%丙酮中重悬浮，然后用锡箔纸完全包裹10 mL离心管，并置于光线较暗处55 ℃水浴放置30 min，于12000 r·min-1下离心5 min，吸出上清液转移至10 mL刻度试管中，并用80%丙酮定容于5 mL，测定663 nm处的光吸收值，测定结果按照公式CA=OD663/82计算出叶绿素的含量CA(mg·L-1)，再换算成μg·g-1(以鲜重计)，具体步骤参照文献(Berrendero et al., 2016).
2.2.4 铜绿微囊藻休眠体光合效率检测在开始实验后的第1、2、3、4、5、6和7 d，从各处理组(加菌组)和对照组(无菌组)中取5 g底泥样进行微囊藻休眠体叶绿素荧光光合效率测定.休眠体浮提具体步骤同2.2.2节.在光照强度小于1 μmol·m-2·s-1条件下充分暗适应15 min，让休眠体所有电子门均处于开放态，打开测量光得到Fo，此时给出一个饱和脉冲(2200 μE·m-2·s-1，500 ms)，所有电子门就都将用于光合作用的能量转化为荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm.根据Fm和Fo计算出PSII的最大量子产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了藻类的光合效率(Hodoki et al., 2011).
2.2.5 休眠体基因测序与基因表达差异利用Trizol(Invitrogen, USA)提取铜绿微囊藻不同处理时间点的组织RNA；用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs、DNA polymerase I和RNase H合成二链cDNA，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA.纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择.进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库，用Illumina HiseqTM2000对以上建好的铜绿微囊藻测序文库进行测序，对原始序列数据进行过滤与拼接，最后对基因功能进行注释和预测，利用FPKM法计算每条基因的表达量，采用DESeq对基因的表达水平进行分析，定义FDR < 0.05时为显著差异表达基因.
2.2.6 数据的统计与分析细菌浓度、复苏微囊藻细胞和休眠体的最终数据以平均值±标准差(X±SD)表示，数据作图采用Excel2010，数据统计分析采用SPSS13.0软件，试验期藻菌的动态变化情况采用单因素方差分析(ANOVA)及Duncans多重比较分析处理，p < 0.05表示差异达到显著水平.
3 实验结果(Results) 3.1 底泥中菌浓度变化不同温度下各组菌浓度变化如图 1所示.在温度10 ℃条件下，各混合菌组底泥中总菌浓度自接种(实验开始)起逐渐上升，其中，Mix-1菌组和Mix-4菌组在实验第3 d总菌浓度均达到最大值，分别为101×106和90×106 cfu·g-1(以鲜重计，下同)，之后菌浓度开始逐渐下降.Mix-2和Mix-3菌组底泥菌浓度分别在实验第6 d和第12 d达到最大值，分别为82×106和91×106 cfu·g-1，稍下降后维持在一个稳定水平(图 1a).在15、20和25 ℃条件下，底泥中总菌浓度变化趋势与10 ℃条件下相近(图 1b~1d).整个实验期中，不同温度下各菌组的总菌浓度从高到低大致排列顺序为Mix-1组、Mix-4组、Mix-2组和Mix-3组.
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| 图 1 不同温度条件下复苏实验过程中混合菌组菌浓度变化(a.10 ℃, b.15 ℃, c.20 ℃, d.25 ℃) Fig. 1 Dynamics of total bacterial densities in the sediment under different temperature conditions during recruitment |
实验开始第6 d，处于15、20和25 ℃环境条件下底泥中的铜绿微囊藻休眠体开始复苏并进入上覆水中，底泥中Chla含量开始逐渐下降直到第15 d(图 2)，且相同条件下处理组底泥中叶绿素a含量与对照组均存在显著性差异(p < 0.05).15 ℃时，Mix-4组底泥中Chla含量显著低于其他菌组(p < 0.05)，但其他菌组彼此之间无显著性差异(p>0.05).20 ℃时，各菌组底泥中Chla含量之间无显著性差异(p>0.05)，25 ℃时Mix-4组底泥中Chla含量显著低于Mix-3组(p < 0.05).
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| 图 2 不同温度条件下复苏实验过程中底泥Chla含量变化趋势(a.10 ℃, b.15 ℃, c.20 ℃, d.25 ℃) Fig. 2 Chlorophylla concentration of M. aeruginosa cells in sediment |
10 ℃时仅处理组(菌组)能检测到铜绿微囊藻休眠体复苏(Chla下降)，对照组(无菌组)Chla含量基本维持初始水平.同时，实验末期10 ℃条件下各菌组底泥中Chla含量均显著高于15、20和25 ℃条件下各菌组底泥中Chla含量.
复苏实验过程中，培养容器上覆水的叶绿素a浓度变化如图 3所示.除10 ℃条件下对照组外，其他组的上覆水体中均能检测到复苏的铜绿微囊藻藻细胞(用Chla表示)，且在培养第6~12 d，Chla浓度逐渐增加，说明底泥中的休眠体开始复苏进入上覆水体中.15 ℃时，Mix-4组水体中藻浓度显著高于其他菌组和对照组.至复苏实验结束，20 ℃和25 ℃条件下各处理组上覆水体中的藻浓度显著高于10 ℃条件下，说明温度对铜绿微囊藻休眠体的复苏有一定的影响.
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| 图 3 不同温度条件下复苏实验过程上覆水体Chla浓度的变化趋势(a.10 ℃, b.15 ℃, c.20 ℃, d.25 ℃) Fig. 3 Chlorophyllaconcentration of M. aeruginosa cells in water column |
铜绿微囊藻休眠体在不同温度条件下的光合效率(Fv/Fm)动态变化如图 4所示.10 ℃时，菌组和对照组(无菌组)光合效率Fv/Fm值在实验开始的前3 d均先逐渐上升然后趋平，至实验结束时菌组和对照组最大光合效率Fv/Fm值排列顺序(从高到低)为：Mix-4组>Mix-1组>Mix-2组>Mix-3组>对照组，对应的Fv/Fm值分别为0.47、0.42、0.37、0.35和0.24.10 ℃时菌组之间及菌组与对照组之间的差异显著，Mix-4菌组光合效率Fv/Fm值显著高于其他菌组和对照组(p < 0.05).Mix-2菌组与Mix-3菌组无显著性差异(p>0.05)，但均显著高于对照组(图 5a).
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| 图 4 不同温度条件下铜绿微囊藻休眠体细胞光合效率Fv/Fm的变化(a.10 ℃, b.15 ℃, c.20 ℃, d.25 ℃) Fig. 4 Fv/Fm values in different bacterial groups under different temperatures during the first 5 days |
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| 图 5 不同温度条件下120 h后铜绿微囊藻休眠体细胞光合效率Fv/Fm的差异性(a.10 ℃, b.15 ℃, c.20 ℃, d.25 ℃；不同小写字母表示组间Fv/Fm具显著性差异(p < 0.05) Fig. 5 Fv/Fm difference in photosynthetic efficiency of Microcystis aeruginosa dormant cells after 120h treatment at different temperatures |
15 ℃时，菌组的光合效率Fv/Fm值快速升高，其最大值均显著高于对照组(p < 0.05).Mix-4菌组的Fv/Fm值显著高于其他菌组和对照组(p < 0.05)，其他菌组无显著差异(p>0.05)，但均显著高于对照组(p < 0.05)(图 5、图 6).当温度高于20 ℃时，各菌组的Fv/Fm与对照组基本趋势几乎一致，实验后4 d都一直在缓慢上升，最高Fv/Fm值为0.65，在20和25 ℃条件下各菌组与对照组并无显著性差异.
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| 图 6 不同菌组与对照组的铜绿微囊藻休眠体细胞光合效率Fv/Fm(a.Mix-1, b.Mix-2, .c.Mix-3, d.Mix-4；*表示同温下菌组与无菌组Fv/Fm具有显著性差异(p < 0.05)) Fig. 6 Fv/Fm difference in photosynthetic efficiency of Microcystis aeruginosa dormant cells between treatments and control groups |
实验结果表明，铜绿微囊藻休眠体的光合系统活性恢复(修复)受温度影响，当环境温度适宜时铜绿微囊藻休眠体的光合系统修复与环境微生物E.sp013、Ba.spD06和Ba.spD24无明显相关性.但当环境温度较低时或对铜绿微囊藻生长具有低温胁迫时，E.sp013、Ba.spD06和Ba.spD24混合菌群能显著增强铜绿微囊藻休眠体的光合系统修复能力(图 6).
3.4 基因功能注释结果与分析通过拼接总共得到5803803条平均长度Unigene，其中共有462988个基因被注释到KO数据库中.根据这些基因参与的KEGG代谢通路进行分类(图 7)，结果表明，在细胞过程中运输和分解代谢(Transport and catabolism)、细胞生长和死亡(Cell growth and death)注释的基因占主要部分，在环境信息处理类、遗传信息处理类和有机系统类中分别是信号转导(Signal transduction)、折叠、分类和降解、翻译(Folding, sorting and degradation Translation)、内分泌系统(Endocrine system)注释到的基因个数最多，而在代谢类中碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)和氨基酸代谢(Amino acid metabolism)占前三.
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| 图 7 铜绿微囊藻unigenes的KEGG分类图(注：纵坐标为KEGG代谢通路的名称，横坐标为注释到该通路下的基因个数及其占被注释上的基因总数的比例；将基因根据参与的KEGG代谢通路分为5个分支：细胞过程(A，Cellular Processes)、环境信息处理(B，Environmental Information Processing)、遗传信息处理(C，Genetic Information Processing)、代谢(D，Metabolism)、有机系统(E，Organismal Systems)) Fig. 7 The KEGG classification of Microcystis aeruginosa unigenes |
对菌组(TR)和对照组(CK)不同复苏阶段的铜绿微囊藻基因表达情况进行比较.TR3相对于CK3有21条基因显著差异表达，18条上调、3条下调；TR5相对于CK5有418375条基因差异表达，TR7相对于CK7有207735条基因差异表达(表 1).
| 表 1 铜绿微囊藻在不同复苏时期的差异基因统计 Table 1 DEG statistics of Microcystis aeruginosa in different recruitment periods |
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对差异表达的基因进行KEGG富集分析，结果显示，TR5相对于CK5有418375条差异表达的基因显著富集在26条通路，发生显著富集(表 2).其中，有2334条基因的表达水平在Cell cycle通路(ko04111)中发生显著变化，其中包括1937条下调、397条上调.Cell cycle通路中多种重要的蛋白都发生显著变化，如周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cdc28)、信息素和受体转录因子(Mcm1)、调控蛋白(SWI5)等，这表明微囊藻TR5细胞分裂过程中细胞周期发生了变化，铜绿微囊藻增殖的速率可能有所改变.
| 表 2 TR5相对于CK5差异表达基因KEGG富集分析 Table 2 KEGG analysis of DEGs in TR5 vs CK5 |
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TR7相对于CK7有207735条基因显著差异表达，KEGG富集分析显示，这些基因显著富集在13条通路上(表 3).细胞周期Cell cycle通路仍然在TR7中显著富集，此外，Oxidative phosphorylation通路(ko00190)氧化磷酸化也发生了显著富集.1815条基因的表达水平在氧化磷酸化代谢通路中发生，包括1227条表达下调、588条表达上调.
| 表 3 TR7相对于CK7差异表达基因KEGG富集分析 Table 3 KEGG analysis of DEGs in TR7 vs CK7 |
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在Mix-4组混合菌的作用下，psaB、psbA、rbcL及ntcA基因表达显著上调，特别是psaB、psbA这两个基因的上调表达表明铜绿微囊藻休眠体光合作用系统受到外源刺激.
4 讨论(Discussion) 4.1 不同温度和菌群条件下铜绿微囊藻休眠体复苏在富营养化湖泊中，只要底泥表层温度不低于底栖菌的生长阈值它们就会开始增殖，即使相对较低温度条件下(如低于8 ℃)一些底泥菌(如奢冷菌)也会快速生长和繁殖(Cires et al., 2013).在该模拟复苏实验中，E.sp013、Ba.spD06和Ba.spD24菌不仅能在15、20和25 ℃条件下快速生长，在10 ℃条件下也能生长和增殖，并在实验第3 d达到最大浓度，随着铜绿微囊藻休眠体的复苏开始逐渐下降，这一实验结果表明3株底泥菌能适应较低温度环境(图 1).实验中底泥菌群能在前3 d快速生长和增殖，应得益于底泥中铜绿微囊藻休眠体弱复苏，因为休眠体在实验的第6 d才开始缓慢复苏，这一段时间刚好给了菌群快速增殖时机.较高浓度的铜绿微囊藻细胞(休眠体复苏后)不仅能与菌群进行营养竞争，同时部分铜绿微囊藻细胞解体会释放出微囊藻毒素，能强烈抑制细菌的生长和增殖(Cires et al., 2013; Boltovskoy et al., 2013).同时，在同一温度条件下，实验末期各菌组底泥中的Chla含量显著低于对照组(图 2)，这说明复苏实验过程中菌组的铜绿微囊藻休眠体的复苏率显著高于对照组(无菌组).
铜绿微囊藻休眠体对温度变化比较敏感，往往在环境温度适宜的条件下才会复苏，一旦环境温度下降微囊藻细胞又会形成休眠体以度过不利的外界环境时期(Ihle et al., 2005; Ma et al., 2016).然而，目前学术界对铜绿微囊藻休眠体复苏所需的最低温度阈值并没有一致结论.Yamamoto(2009)认为铜绿微囊藻休眠体能在5 ℃条件下维持活性，在温度达到9 ℃时开始复苏，并认为这是一些湖泊在早春也暴发微囊藻水华的原因.有部分学者认为铜绿微囊藻休眠体复苏的最低门槛温度约为15 ℃，低于这一温度铜绿微囊藻休眠体无法复苏(Tsukada et al., 2006; Lehman et al., 2010).实际上具体的复苏温度都是从实验室的控制实验或野外调查所得出的结果，室内控制实验一般排除了诸多的外界环境因素，如底泥菌群、原生动植物等，而野外调查面临许多不可控的因素，如水动力、地理位置环境等(Cao et al., 2008)，而且不同地域的底泥和水体有其各自的理化性质和生态特征，彼此存在差异(Misson et al., 2012; Fontana et al., 2016).本模拟复苏实验中，在10 ℃条件下，6 d后能从菌组上覆水体中检测到复苏的铜绿微囊藻细胞，而在对照组(无菌)却没能检测到复苏的藻细胞(图 3a)，这一结果表明底泥菌群在较低环境温度条件下能刺激(或激发)铜绿微囊藻休眠体复苏且与菌群的种类及占比有关(菌组间的休眠体复苏率存在差异).
4.2 底泥菌对微囊藻休眠体光合效率的影响底泥中铜绿微囊藻休眠体复苏进入水体这一过程与铜绿微囊藻休眠体细胞的光合效应有很大关系，因为光照强度也是铜绿微囊藻休眠体复苏的重要环境因子(Reynolds et al., 1981).同时，长期的低温和黑暗胁迫在一定程度上对休眠的铜绿微囊藻光合系统(PSII)具有损伤作用.当春季环境温度开始逐渐上升，浅水区底泥表面接受到适当的光照，许多铜绿微囊藻细胞休眠体的光合作用开始缓慢修复和恢复，并在底泥表面开始生长，缓慢增殖，形成新的群体，对于铜绿微囊藻而言，这个光强的阈值应不低于5 μmol·m-2·s-1 (Brunberg et al., 2002).Lehman等(2010)研究了瑞典的Limmaren湖(平均深度4.7 m，最大深度7.8 m)在夏季(6—9月)的蓝藻复苏情况，底泥表面光强40 μmol·m-2·s-1时底泥中的铜绿微囊藻复苏率显著高于光强1 μmol·m-2·s-1时，而更深的水体由于光照强度很弱休眠体根本无法复苏.但在适宜光照强度条件下，很多环境因子会影响底泥表层微囊藻休眠体细胞的光合效率Fv/Fm，如水体理化性质、生物因素等(Neilan et al., 2013).从本实验中可以看出，温度和菌群对底泥中微囊藻休眠体的光合效率Fv/Fm有很重要的影响，特别是在低温条件下(10和15 ℃)，菌组光合效率显著高于对照组(无菌组)，这一结果表明，即使相对低温条件下铜绿微囊藻休眠体细胞的光合组织或系统受到一定损伤(Tan et al., 2009)，但在菌群存在条件下能提升其修复受损的光合系统的能力，加快恢复其光合活性，这也证实了处于胁迫状态下的铜绿微囊藻休眠体光合系统的修复受到外界环境因子的影响(Hodoki et al., 2011).有研究表明，细菌的生长会分泌次代谢产物和分解底泥有机物，它们改变了底泥的理化性质和营养状态(Yang et al., 2015)，富营养化的水域底泥有助于铜绿微囊藻休眠体光合效率Fv/Fm的提升(Sun et al., 2016).这很可能也是冲天湖水域频繁暴发春季铜绿微囊藻水华的主要原因.
4.3 菌群条件下休眠体复苏基因表达差异铜绿微囊藻休眠体从底泥表层复苏进入上覆水体这个过程十分复杂，由于受到外界环境因子的影响，致使铜绿微囊藻休眠体的复苏率在不同环境中存在显著差异(Misson et al., 2012).外界环境的干扰或影响最终都要通过微囊藻休眠体本身的基因表达来体现(Karlson et al., 2012).从测序结果看，TR3相对于CK3只有21条基因显著差异表达，18条上调、3条下调.而第5 d TR5相对于CK5有418375条基因差异表达，TR7相对于CK7有207735条基因差异表达.说明在混合菌群的作用下，铜绿微囊藻休眠体的部分基因表达与无菌条件下的基因表达差异显著，可能正是由于这些基因的差异表达导致菌组与对照组复苏率差异显著.通过对差异表达基因进行KEGG富集分析，结果显示，TR5相对于CK5有418375条差异表达的基因显著富集在26条通路，发生显著富集(表 2)；且有2334条基因的表达水平在Cell cycle通路(ko04111)中发生显著变化，致使Cell cycle通路中多种重要的蛋白都发生显著变化.Cell cycle通路中蛋白主要包括依赖性蛋白激酶(Cdc28)、信息素和受体转录因子(Mcm1)及调控蛋白(SWI5)等(Trapnell et al., 2010)，主管着铜绿微囊藻休眠体细胞周期和无性生殖，影响着铜绿微囊藻休眠体的复苏速率(Huang et al., 2009).比对复苏实验结果，铜绿微囊藻休眠体从第5~6 d开始复苏，虽然这期间底泥表层检测的复苏率没有显著变化，但休眠体基因的表达差异已经显现，复苏后期菌组的复苏率显著高于对照组证实了复苏前期休眠体基因的差异表达.TR7相对于CK7有207735条基因显著差异性表达，KEGG富集分析显示，这些表达差异基因显著富集在13条通路上(表 3).细胞周期Cell cycle通路仍然在TR7中显著富集，此外，氧化磷酸化通路(ko00190)和内质网蛋白合成通路(ko04141)也发生了显著富集.这些基因通过调控多种蛋白酶的合成参与到氧化磷酸化通路中去，如NADH脱氢酶(Ndufa2)、琥珀酸脱氢酶(泛醌)、细胞色素b560(SDHC)、细胞色素c氧化酶(COX6B)等(Huang et al., 2009).氧化磷酸化是细胞产生ATP的重要反应，TR7中氧化磷酸化通路发生显著变化，表明其体内光合系统的应激反应和能量代谢水平发生改变，呼吸作用也发生改变(Qian et al., 2016).从差异性基因条的表达量看，基因psaB和psbA变化显著并且上调(UP)，基因psaB和psbA是与光合作用相关的蛋白基因(Dorais et al., 2014; Qian et al., 2016).同时，与催化固定C化相关的基因rbcL的表达量均发生上调，这些可能都是混合菌群的生长改变底泥表层水体的理化性质(Ståhl-Delbanco et al., 2003)和代谢产物的分泌导致休眠体光合系统(PSII)的应激反应(Wan et al., 2008)，使休眠体的光合效率提升.但本复苏模拟实验结果表明，只有在较低温度(10~15 ℃)条件下，菌组的光合效率才显著高于对照组，而较高温度下(20~25 ℃)两者无显著性差异，psaB、psbA和rbcL等基因在较高温度下是否也会有显著差异表达，还需要更进一步的深化研究.
5 结论(Conclusions)1) 菌组(由E.sp013、Ba.spD06和Ba.spD24组成的混合菌)铜绿微囊藻休眠体复苏率显著强于对照组(无菌组)，尤其在10 ℃条件下，菌群条件下铜绿微囊藻休眠体能复苏，而对照组没有复苏.在适宜温度条件下(20~25 ℃)，菌群对铜绿微囊藻休眠体光合系统的光合效率Fv/Fm无显著提升作用，而在较低的温度条件下(10~15 ℃)能显著提升其光合效率Fv/Fm，特别是Mix-4菌组的提升能力显著强于其他菌组和对照组.
2) 基因差异性表达分析表明，菌群条件下的差异表达基因显著富集在Cell cycle (ko04111)通道中，致使Cell cycle通路中多种重要的蛋白发生显著变化，如依赖性蛋白激酶(Cdc28)、信息素和受体转录因子(Mcm1)及调控蛋白(SWI5)等，特别是氧化磷酸化通路(ko00190)和内质网蛋白合成通路(ko04141)，与这些蛋白相关的基因psaB、psbA、rbcL及ntcA基因表达显著上调，特别是psaB、psbA这两个基因的上调表达表明光合作用受到刺激，可合成更多的能量供藻细胞生长，这可能是导致铜绿微囊藻休眠体复苏率提高的主要原因.
Berrendero E, Valiente E F, Perona E, et al. 2016. Nitrogen fixation in a non-heterocystous cyanobacterial mat from a mountain river[J]. Sci Rep, 6: 30920–30930.
|
Boltovskoy D, Correa N, Bordet F, et al. 2013. Toxic Microcystis (Cyanobacteria) inhibit recruitment of the bloom-enhancing invasive bivalve Limnoperna fortune[J]. Freshwater Biol, 58: 1968–1981.
DOI:10.1111/fwb.2013.58.issue-9
|
Brunberg A K, Blomqvist P. 2002. Benthic overwintering of Microcystis colonies under different environmental conditions[J]. J Plankton Res, 24: 1247–1252.
|
Brunberg A K, Blomqvist P. 2003. Recruitment of Microcystis (Cyanophycae) from lake sediments:The importance of littoral inocula[J]. J Phycol, 39(1): 58–63.
DOI:10.1111/jpy.2003.39.issue-1
|
Cáceres O, Reynolds C S. 1984. Some effects of artificially enhanced anoxia on the Microcystis aeruginosa Kütz emend Elenkin with special reference to the initiation of its annual growth cycle in lake[J]. Archivfur Hydrobiologia, 99: 379–397.
|
Cao H S, Tao Y, Kong F X, et al. 2008. Relationship between temperature and cyanobacterial recruitment from sediments in laboratory and field studies[J]. J Freshwater Ecol, 23(3): 405–412.
|
Cires S, Wormer L, Agha R, et al. 2013. Overwintering populations of Anabaena, Aphanizomenon and Microcystis as potential inocula for summer blooms[J]. J Plankton Res, 35(6): 1254–1266.
|
Dorais P, Stoichev T, Basto M C P, et al. 2014. Cyanobacterium Microcystis aeruginosa response to pentachlorophenol and comparison with that of the microalga Chlorella vulgaris[J]. Water Res, 52: 63–72.
|
Fontana A, Patrone V, Puglisi E, et al. 2016. Effects of geographic area, feedstock, temperature, and operating time on microbial communities of sixfull-scale biogas plants[J]. Bioresour Technol, 218: 980–990.
DOI:10.1016/j.biortech.2016.07.058
|
Hodoki Y, Ohbayashi K, Kobayashi Y, et al. 2011. Temporal variation in cyanobacteria species composition and photosynthetic activity in experimentally induced blooms[J]. J Plankton Res, 33: 1410–1416.
DOI:10.1093/plankt/fbr040
|
Huang D W, Sherman B T, Lempicki R A. 2009. Bioinformatics enrichment tools:paths towards the comprehensive functional analysis of largr gene lists[J]. Nucleic Acids Res, 37(1): 1–13.
DOI:10.1093/nar/gkn923
|
Huang D W, Sherman B T, Lempicki R A. 2009. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVIDE bioinformatics resources[J]. Nature Protocols, 4(1): 44–57.
|
Ihle T, Jahnichen S, Benndorf J. 2005. Wax and wane of Microcystis(Cyanophyceae) and Microcystins in lake sediment:a case syudy in Quitzdorf Reservoir(Germany)[J]. J Phycol, 41: 479–488.
DOI:10.1111/(ISSN)1529-8817
|
Jähnichen S, Long B M, Petzoldt T. 2011. Microcystin production by Microcystis aeruginosa:Direct regulation by multiple environmental factors[J]. Harmful Algae, 12: 95–104.
DOI:10.1016/j.hal.2011.09.002
|
Karlson A M L, Nascimento F J A, Sanna S, et al. 2012. Benthic fauna affects recruitment from sediments of the harmful cyanobacterium Nodularia spumigena[J]. Harmful Algae, 20: 126–131.
DOI:10.1016/j.hal.2012.09.001
|
Lehman P W, Teh S J, Boyer G L, et al. 2010. Initial impacts of Microcystis aeruginosa blooms on the aquatic food web in the San Francisco Estuary[J]. Hydrobiologia, 637: 229–248.
|
Ma J R, Qin B Q, Paerl H W, et al. 2016. The persistence of cyanobacterial(Microcystis spp.) blooms throughout winter in Lake Taihu, China[J]. Limnol Oceanogr, 61: 711–722.
|
Misson B, Latour D. 2013. Influence of light, sediment mixing, temperature and duration of the benthic life phase on the benthic recruitment of Microcystis[J]. Journal of Plankton Research, 34(2): 113–119.
|
Neilan B A, Pearson L A, Muenchhoff J, et al. 2013. Environmental conditions that influence toxin biosynthesis in cyanobacteria[J]. Environ Microbiol, 15(5): 1239–1253.
|
Paerl H W, Otten T G. 2013. Blooms bite the hand that feeds them[J]. Science, 342: 433–434.
DOI:10.1126/science.1245276
|
Preston T, Stewart W D P, Reynolds C S. 1980. Bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa overwinters on sediment surface[J]. Nature, 288: 365–367.
|
Qian H F, Pan X J, Chen J, et al. 2016. Analyses of gene expression and physiological changes in Microcystis aeruginosa reveal the phytotoxicities of three environmental pollutants[J]. Ecotoxicology, 21: 847–859.
|
Reynolds C S, Jaworski G H M, Cmiech H A, et al. 1981. On the annual cycle of the blue-green alga Microcystis aeruginosa Kütz.emend. Elenkin[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B:Biological Sciencess, 293: 419–477.
DOI:10.1098/rstb.1981.0081
|
Robert Edward Lee. 2008. Phycology[M]. Cambridge: Cambridge University Press.
|
Rossetti V, Schirrmeister B E, Bernasconi M V. 2010. The evolutionary path to terminal differentiation and division of labor in cyanobacteria[J]. Journal of Theoretical Biology, 262(1): 23–34.
|
Schone K, Jähnichen S, Ihle T, et al. 2010. Arriving in better shape:Benthic Microcystis as inoculum for pelagic growth[J]. Harmful Algae, 9(5): 494–503.
DOI:10.1016/j.hal.2010.03.005
|
Ståhl-Delbanco A, Hansson L A, Gyllstr m M. 2003. Recruitment of resting stages may induce blooms of Microcystis at low N:P ratios[J]. Journal of Plankton Research, 25(9): 1099–1106.
|
Sun Q Q, Zhu W, Li M, et al. 2016. Morphological changes of Microcystis aeruginosa colonies in culture[J]. Journal of Limnology, 75(1): 14–23.
|
苏玉萍, 李艳芳, 钟厚璋, 等. 2012. 山仔水库沉积物蓝藻复苏试验研究[J]. 环境科学学报, 2012, 32(2): 341–348.
|
Takamura N, Yasuno M, Sugahara K. 1984. Overwintering of Microcystis aeruginosa Kütz in a shallow lake[J]. Journal of Plankton Research, 6(6): 1019–1029.
DOI:10.1093/plankt/6.6.1019
|
Tan X, Kong F X, Zhang M Y, et al. 2009. Effects of temperature on phytoplankton recruitment and variations in phytoplankton community composition[J]. J Freshwater Ecol, 24: 339–341.
DOI:10.1080/02705060.2009.9664302
|
Thomas R H, Walsby A E. 1986. The effects of temperatures on recovery of buoyancy by Microcystis[J]. Microbiology, 132(6): 1665–1672.
DOI:10.1099/00221287-132-6-1665
|
Trapnell C, Williams B A, Pertea G, et al. 2010. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation[J]. Nat Biotech, 28: 511–515.
|
Tsujimura S, Tsukada H, Nakahara H, et al. 2000. Seasonal variations of Microcystis populations in sediments of lake Biwa Japan[J]. Hydrobiologia, 434(1/3): 183–192.
DOI:10.1023/A:1004077225916
|
Tsukada H A.2006.Study on the life history and the factor affecting the dominance of Microcystis in eutrophic lakes[D]. Kyoto: Kyoto University
|
谭啸, 孔繁翔, 于洋, 等. 2009. 升温过程对藻类复苏和群落演替的影响[J]. 中国环境科学, 2009, 29(6): 578–582.
DOI:10.3321/j.issn:1000-6923.2009.06.004 |
陶益, 孔繁翔, 曹焕生, 等. 2005. 太湖底泥水华蓝藻复苏的模拟[J]. 湖泊科学, 2005, 17(3): 231–236.
DOI:10.3321/j.issn:1003-5427.2005.03.007 |
Verspagen J M H, Snelder E O F, Visser P M, et al. 2004. Recruitment of benthic Microcystis(Cyanophyceae) to the water column:internal buoyancy changes or susupension?[J]. Journal of Phycology, 40: 260–270.
DOI:10.1111/j.1529-8817.2004.03174.x
|
Wan N, Tang J, Li Q M, et al. 2008. The responses of Microcystis to sediment environments and the assessment for its overwintering a simulation study in a novel device[J]. Fresenius Environmental Bulletin, 17(12b): 2146–2151.
|
Yamamoto Y. 2009. Effect of temperature on recruitment of cyanobacteria from sediment and bloom formation in a shallow pond[J]. Plankton & Benthos Research, 4: 95–103.
|
Yamamoto Y. 2010. Contribution of bioturbation by the red swamp crayfish Procambarus clarkia to the recruitment of bloom-forming cyanobacteria from sediment[J]. Journal of Limnology, 69(1): 102–111.
|
Yang C Y, Yi L, Zhou Y Y, et al. 2015. Illumina sequencing-based analysis of free-living bacterial community dynamics during an Akashiwo sanguine bloom in Xiamen sea, China[J]. Science Rep, 5: 8476–8486.
DOI:10.1038/srep08476
|
邹万生, 王智, 宋齐生, 等. 2017. 两株浅层底泥菌对铜绿微囊藻休眠体复苏的调控作用[J]. 环境科学学报, 2017, 37(11): 4160–4169.
|