1 引言(Introduction)

我国有大、中型煤矿约15000多座, 原煤年产量达3.50×10⁹ t(Liu et al., 2015).此外, 我国亦拥有大、中型金属矿山9000多座(常前发, 2010).煤矿或诸多金属矿产资源中常有硫铁矿伴生, 此类矿产资源在开采、加工和废矿石堆放等过程中, 伴生硫铁矿与氧气、水分和微生物(氧化亚铁硫杆菌等)接触而产生pH为2.0~6.0和富含Fe²⁺、Fe³⁺、SO₄^2-及部分其它重(类)金属离子的酸性矿山废水(Nicomrat et al., 2008；张明亮等, 2008；杨绍章等, 2011), 涉及的主要反应方程如下所示(Kefeni et al., 2017；Liu et al., 2015):

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

酸性矿山废水排放不仅造成矿山资源流失, 而且会对受纳废水的陆地和水生生态系统造成不可逆破坏, 导致生态系统生物多样性和生物量锐减.蒋万祥等(2008)证实, 三峡水库湖北库区周围高岚硫铁矿产生的酸性矿山废水对高岚河大型底栖动物群落结构造成了严重破坏.姚海元等(2007)研究发现, 农田土壤无脊椎动物的多样性因受酸性矿山废水污染而减少.因此, 从源头揭示硫铁矿生物氧化过程, 探究H⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、SO₄^2-的释放规律对有效防控其造成的环境污染具有积极意义.值得一提的是, 虽然上述与酸性矿山废水相关的主要化学反应(反应式(1)~(6))在含氧水环境中即可发生, 然而, 氧化亚铁硫杆菌等微生物的参与却由于加速反应(2)而促进硫铁矿生物氧化.研究证实, 氧化亚铁硫杆菌参与下的硫铁矿生物氧化速率可达到化学氧化速率的50~60倍(钟慧芳, 1987), 并且酸性矿山废水环境中常被证实有氧化亚铁硫杆菌的存在(龚文琪等, 2007；陈炳辉等, 2010), 故探究氧化亚铁硫杆菌对硫铁矿的生物氧化规律对揭示自然条件下酸性矿山废水污染物释放特征具有重要意义.前人已在氧化亚铁硫杆菌生物氧化硫铁矿领域取得了一定的研究成果, 除揭示氧化亚铁硫杆菌可快速加速硫铁矿氧化进程外, 针对Fe²⁺、Fe³⁺、NH₄⁺等阳离子及初始pH对硫铁矿生物氧化的影响(何良菊等, 1999；孙小俊, 2010)、溶解氧对硫铁矿生物氧化的影响(Gleisner et al., 2006)、氧化亚铁硫杆菌胞外聚合物介导硫杆菌在硫铁矿表面的吸附行为(Liu et al., 2006；Chandraprabha et al., 2013)、氧化亚铁硫杆菌对硫铁矿表面的侵蚀效果(蒋磊等, 2007)及硫铁矿氧化表面电化学行为(孙小俊, 2010；Gu et al., 2012)等研究视角均已涉及.

实际上, 自然环境中煤矿或诸多金属矿产资源中伴生硫铁矿周围的氧化亚铁硫杆菌数量并不相同, 此外, 与硫铁矿接触的地表水或地下水中所存在的作为微生物营养的无机离子差别亦迥异.然而, 氧化亚铁硫杆菌密度与营养供给对硫铁矿生物氧化过程中典型污染物(H⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、SO₄^2-)释放的影响却鲜见报道.鉴于此, 本研究通过探究氧化亚铁硫杆菌密度与营养(无铁改进型9K培养基)供给对硫铁矿生物氧化过程中H⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、SO₄^2-的释放规律, 为进一步揭示酸性矿山废水的形成规律提供参考.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 供试药品与仪器

本研究所涉及的邻菲罗啉、盐酸羟胺、氯化钾、硫酸铵、硝酸钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、无水乙酸钠、氯化钡、氧化钙均为分析纯.

2.2 供试硫铁矿

供试硫铁矿为市场购置样品, 供试样品经磨碎过100目筛(即制备0.154 mm硫铁矿样品), 收集, 备用.经XRF-1800型X射线荧光光谱仪(Shimadzu, Kyoto, Japan)分析, 供试样品主要元素(质量分数>1%)含量如下：Fe 41.4%、S 42.3%、O 12.7%、Si 1.51%.对该供试样品用X射线衍射光谱仪(D8 Advance A25, Bruker, Germany)分析其衍射图谱(图 1), 证实该样品所得X射线衍射峰的出峰位置与强度与粉末衍射标准联合委员会(JCPDS, 2002)提供的FeS₂标准衍射图谱(PDF No. 42-1340)相一致.

2.3 供试氧化亚铁硫杆菌的活化、浓缩与计数

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌菌株Acidithiobacillus ferrooxidans LX5(A. ferrooxidans LX5, CGMCC No.0727)由南京农业大学固体废弃物研究所提供.在系列容积为250 mL的锥形瓶中, 将前期在4 ℃保存的A. ferrooxidans LX5菌液15 mL接种于15 mL浓缩10倍的改进型9K液体培养基中(张莎莎等, 2016), 补充去离子水至150 mL, 用浓硫酸调节体系pH在2.50左右, 8层无菌纱布封口, 置于28 ℃、180 r·min^-1的气浴恒温振荡器(SHZ-82, 常州润华电器有限公司)中培养至体系Fe²⁺完全氧化.将所得菌液用定性中速滤纸(抚顺市民政滤纸厂)过滤, 再次取15 mL富含硫杆菌的滤液重复上述活化过程.待体系Fe²⁺再次氧化完全时结束活化.随后将所得微生物菌液用滤纸抽滤, 将所得滤液使用Neofuge23R台式高速离心机(上海力申科学仪器有限公司)在12000 r·min^-1、4 ℃条件下离心15 min(Zhang et al., 2017), 将所得白色菌体用pH约为2.50的H₂SO₄溶液浓缩得到A. ferrooxidans LX5浓缩溶液, 制备硫杆菌浓缩液所用硫酸体积为初始待离心滤液总体系的1/30.换言之, 浓缩菌液中A. ferrooxidans LX5密度为初始待离心滤液中菌密度的30倍.通过平板计数法(王世梅, 2007)可知, 本研究A. ferrooxidans LX5浓缩液中硫杆菌密度为5.30×10⁸ cells·mL^-1.

2.4 硫铁矿生物氧化试验

准确称量5.00 g粒径为0.154 mm的硫铁矿(FeS₂)样品置于18个250 mL锥形瓶中, 共设置6个处理.各处理设置如下：①加入去离子水150 mL(记为CK)；②在体系中加入2 mL A. ferrooxidans LX5浓缩溶液, 并补充去离子水至150 mL, 换言之, 体系硫杆菌浓度被稀释75倍, 即体系A. ferrooxidans LX5密度为0.70×10⁷ cells·mL^-1(记为0.70×10⁷ cells·mL^-1处理组)；③加入4 mL A. ferrooxidans LX5浓缩溶液, 并补充去离子水至150 mL, 体系A. ferrooxidans LX5密度为1.40×10⁷ cells·mL^-1(记为1.40×10⁷ cells·mL^-1处理组)；④加入6 mL A. ferrooxidans LX5浓缩溶液, 并补充去离子水至150 mL, 体系A. ferrooxidans LX5密度为2.10×10⁷ cells·mL^-1(记为2.10×10⁷ cells·mL^-1处理组)；⑤加入4 mL A. ferrooxidans LX5浓缩溶液及7.5 mL浓缩10倍的无铁改进型9K液体培养基(无机盐组成如下(g·L^-1)：K₂HPO₄ 0.58、(NH₄)₂SO₄ 35.0、Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.168、KCl 1.19及MgSO₄·7H₂O 5.83), 补充去离子水至150 mL, 体系A. ferrooxidans LX5密度为1.40×10⁷ cells·mL^-1(记为1.40×10⁷ cells·mL^-1+50% Fe-free 9K处理组)；⑥加入4 mL A. ferrooxidans LX5浓缩溶液及15 mL浓缩10倍的无铁改进型9K液体培养基, 补充去离子水至150 mL, 体系A. ferrooxidans LX5密度为1.40×10⁷ cells·mL^-1(记为1.40×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理组).用硫酸调节所有体系pH至4.00左右, 使用8层无菌纱布封口后将所有体系置于28 ℃、180 r·min^-1的SHZ-82型气浴恒温振荡器中进行硫铁矿生物氧化实验, 每个处理设置3个重复.在硫铁矿氧化第0、1、4、7、10、13及16 d测定各体系pH值, 并摇匀后取1 mL溶液过0.22 μm滤膜, 分析滤液中总Fe、Fe²⁺、SO₄^2-浓度.需要说明的是, 硫铁矿生物氧化周期较长, 硫铁矿生物氧化试验期间用称量法在每次采样前定期补充蒸发所损失的水分.硫铁矿生物氧化第16 d后, 将体系生物氧化后的硫铁矿样品用定性滤纸过滤, 分析其矿物矿相及形貌.选择2.10×10⁷ cells·mL^-1处理组、1.40×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理组两体系所得酸性废水, 利用CaO对其进行中和实验, 考察废水pH中和至7.00左右时, 体系总Fe离子、SO₄^2-的去除效果, 并观察所得中和残渣的矿物形貌.

2.5 测定方法

溶液pH使用数显式酸度计(pHS-3C)进行测定；采用邻菲罗啉比色法测定溶液中Fe²⁺、总Fe离子浓度(刘奋武等, 2014)；SO₄^2-浓度采用硫酸钡比浊法测定(鲍士旦, 2000).为了保证实验质量控制, 选择标准铁溶液(批号：102407, 浓度1000 mg·L^-1)与标准硫酸盐溶液(批号：102007, 浓度5000 mg·L^-1)随机在实测样品中进行加标回收实验, 获得总Fe与SO₄^2-加标回收率分别为96.0%~105.1%与102.1%~109.6%.矿物矿相通过X射线衍射仪(D8 Advance A25, Bruker, Germany)扫描矿物特征衍射峰, 将矿物出峰位置与粉末衍射标准联合委员会提供的JCPDS标准卡片(JCPDS, 2002)相匹配, 分析矿物矿相.利用热场发射扫描电子显微镜(SEM, JSM-7001F)观察矿物形貌.

2.6 数据处理与绘图

使用Microsoft Excel(2010版本)进行数据分析, 获得每个数据点的平均值及标准偏差, 并使用Origin7.5软件对实验所得数据进行制图.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 氧化亚铁硫杆菌密度与营养供给对硫铁矿生物氧化过程H⁺释放的影响

氧化亚铁硫杆菌密度与营养供给对硫铁矿生物氧化过程H⁺释放的影响如图 2所示.在对照(CK)体系, 无氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans LX5)引入, 体系硫铁矿主要发生的是化学氧化过程.经过16 d的生物氧化过程, 对照体系pH从初始的4.00逐渐降低至2.34, H⁺浓度从初始的1.00×10^-4 mol·L^-1增加至4.57×10^-3 mol·L^-1.可见, 16 d的化学氧化过程使得体系H⁺有一定程度增加.这一现象与前人研究结果相类似, Tabelin等(2017)将0.50~0.71 mm硫铁矿置于去离子水中, 硫铁矿样品以10%矿浆浓度在25 ℃、80 r·min^-1条件下化学氧化7 d, 体系pH可从初始的约5.5降低至约3.5.由于本研究中硫铁矿样品颗粒更细, 培养转速较快, 且反应周期较长, 所以导致其pH下降幅度更大.

0.70×10⁷ cells·mL^-1处理组硫铁矿经过16 d的生物氧化, pH降低至2.16, H⁺浓度增加至6.92×10^-3 mol·L^-1, 即H⁺释放量为对照的1.51倍.同理, 当硫铁矿生物氧化体系A. ferrooxidans LX5初始密度为1.40×10⁷和2.10×10⁷ cells·mL^-1时, 体系最终H⁺释放量分别为对照的2.88和3.31倍.在A. ferrooxidans LX5密度为1.40×10⁷cells·mL^-1硫铁矿氧化体系, 当按无铁改进型9K液体培养基半量和全量浓度供应营养时(即1.40×10⁷ cells·mL^-1+50% Fe-free 9K处理组和1.40×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理组), 体系pH可最终降低至1.37和1.44, H⁺浓度分别为1.40×10⁷ cells·mL^-1处理组H⁺释放量的3.24和2.75倍.可见, 相对于半量无铁改进型9K液体培养基的引入, 全量无铁改进型9K液体培养基的引入在一定程度上抑制了系H⁺的释放.

3.2 氧化亚铁硫杆菌密度与营养供给对硫铁矿生物氧化过程总Fe离子释放的影响

各处理体系总Fe离子浓度随培养时间呈近似线性增加趋势(图 3a).由于初始点调节体系pH使得硫铁矿发生化学氧化, 各处理体系初始总Fe离子浓度均约为20 mg·L^-1.对照(CK)体系在16 d的硫铁矿化学氧化过程中, 总Fe离子浓度呈小幅缓慢增加趋势, 在第16 d达到376 mg·L^-1.相对于对照体系, 0.70×10⁷ cells·mL^-1体系总Fe离子浓度增加并不明显.然而, 当体系A. ferrooxidans LX5初始密度分别为1.40×10⁷和2.10×10⁷ cells·mL^-1时, 体系最终(氧化至第16 d)总铁离子浓度分别达到701和935 mg·mL^-1, 是无A. ferrooxidans LX5引入对照(CK)体系最终释放总Fe离子浓度的1.86和2.49倍.营养供给可大幅度提高总Fe离子的释放效率.在A. ferrooxidans LX5密度为1.40×10⁷ cells·mL^-1的硫铁矿氧化体系, 当按无铁改进型9K液体培养基半量或全量浓度供应营养时, 硫铁矿生物氧化16 d后, 体系总Fe离子浓度可达到3683和3204 mg·L^-1, 是相应无营养成分引入体系的5.25或4.57倍.造成上述结果的原因可能是由于体系无营养成分引入时, 微生物无法完成正常繁殖过程, 且微生物活性越来越弱, 致使硫铁矿生物氧化受限.若以Fe²⁺为能源物质时, 氧化亚铁硫杆菌世代时间需要几小时或十几小时(周顺桂等, 2002).而当体系有充裕营养供给时, A. ferrooxidans LX5能够顺利生长, 且维持较高的生物活性, 进而加速硫铁矿生物氧化, 体系产生的Fe²⁺可为A. ferrooxidans LX5不间断地提供能源物质, 且被氧化为Fe³⁺而进一步氧化硫铁矿, 以此循环促进总Fe离子大幅度溶出.可见, 与体系初始A. ferrooxidans LX5密度相比较, 酸性矿山废水体系中可供微生物生长利用的营养成分多寡是决定酸性矿山废水体系总Fe释放速率的关键因素.

各处理体系Fe²⁺浓度随硫铁矿氧化时间变化关系如图 3b所示.在无营养成分引入的硫铁矿氧化体系, 各处理体系Fe²⁺浓度随时间呈近似线性增长趋势.对比图 3a与图 3b可以得出, 在无营养成分引入的硫铁矿氧化体系, 体系中总Fe离子主要以Fe²⁺离子存在.例如, 在对照(CK)、0.70×10⁷、1.40×10⁷与2.10×10⁷ cells·mL^-1体系硫铁矿氧化至16 d时, 体系Fe²⁺浓度分别为352、367、619与672 mg·L^-1, 分别为相应体系总Fe离子浓度的93.6%、98.4%、88.3%与71.9%.可见, 随着体系A. ferrooxidans LX5接种密度的增加, 体系总Fe离子中Fe³⁺所占比例越来越大, Fe²⁺所占比例越来越小.且这一结论在有改进型9K培养基引入体系得到很好的验证.在1.4×10⁷ cells·mL^-1+50% Fe-free 9K和1.4×10⁷cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理体系中, 体系从开始培养至16 d结束, 体系Fe²⁺浓度一直维持在10~80 mg·L^-1较低水平范围.

换言之, 在任何一个时间点, 有改进型9K引入的硫铁矿氧化体系中总Fe几乎总是以Fe³⁺形态存在.可见, 酸性矿山废水形成过程中, 水环境中存在的无机营养对氧化亚铁硫杆菌的供应, 能够使得体系氧化亚铁硫杆菌快速氧化硫铁矿氧化过程中体系释放出的Fe²⁺, 进而加速硫铁矿生物氧化, 此外, 所形成酸性矿山废水中总Fe主要以Fe³⁺形态存在.反之, 如果水环境中无机营养缺乏, 则即使水环境中氧化亚铁硫杆菌密度高达2.10×10⁷ cells·mL^-1, 废水中总Fe主要以Fe²⁺形态存在.此外, 如果水环境中可供氧化亚铁硫杆菌利用的营养元素严重匮乏, 即使体系氧化亚铁硫杆菌密度达到0.70×10⁷ cells·mL^-1, 硫铁矿的氧化速率较自然状态下化学氧化不会有明显提高.

3.3 氧化亚铁硫杆菌密度与营养供给对硫铁矿生物氧化过程SO₄^2-释放的影响

尽管在生物氧化过程中, 硫铁矿中的硫素可能以S⁰、S_nO₆^2-等形态存在(Tu et al., 2017), 然而, 大量的硫元素转化成为SO₄^2-, 而使得SO₄^2-成为硫铁矿氧化产生酸性矿山废水中所含的主要污染物.例如, Tu等(2017)发现, 硫铁矿生物氧化过程中, 当体系SO₄^2-达到2600 mg·L^-1时, 体系S⁰、S_nO₆^2-等浓度仅为10~100 mg·L^-1.此处, 各处理体系SO₄^2-的释放量见图 4.

由于初始调节体系pH及A. ferrooxidans LX5浓缩菌液的引入, 使得对照(CK)、0.70×10⁷、1.40×10⁷与2.10×10⁷ cells·mL^-1体系初始SO₄^2-维持在250~300 mg·L^-1水平.对照体系经过16 d的硫铁矿化学氧化, SO₄^2-浓度缓慢增加至951 mg·L^-1.Tu等(2017)同样证实, 将硫铁矿置于无铁改进型9K液体培养基中, 硫铁矿确实可以在水中溶解氧的参与下发生缓慢化学氧化, 而使得体系SO₄^2-有缓慢增加趋势.与总Fe、Fe²⁺离子变化规律相类似, 初始菌密度0.70×10⁷ cells·mL^-1的体系并不能明显加速SO₄^2-的释放.而当体系A. ferrooxidans LX5接种密度为1.40×10⁷、2.10×10⁷ cells·mL^-1时, 体系在培养至第16 d的最终SO₄^2-浓度分别为2218、3011 mg·L^-1.当体系引入半量或全量无铁改进型9K液体培养基时, 加速了体系SO₄^2-的释放程度.1.4×10⁷ cells·mL^-1+50% Fe-free 9K和1.4×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理体系培养至16 d时, 相对于初始时刻, 体系SO₄^2-浓度分别增加了14735.9和12054.0 mg·L^-1.与总Fe变化规律相类似, 相对于引入半量浓度无铁改进型9K培养基体系, 全量无铁改进型9K培养基的引入一定程度上抑制了SO₄^2-浓度增加.这可能是由于1.40×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理体系由于引入的K⁺、NH₄⁺量相对较多, 此类一价阳离子与体系SO₄^2-、Fe³⁺结合而生成较多的次生铁矿物黄铁矾, 黄铁矾的合成使得部分SO₄^2-、Fe³⁺进入固相, 进而减少了此类污染物向水环境中释放.为了进一步佐证这一观点, 本研究在16 d硫铁矿氧化过程结束后, 考查了不同体系所得氧化后硫铁矿的矿物形貌, 结果见图 5.

硫铁矿生物氧化后表面存在明显的侵蚀坑(蒋磊等, 2007；Garcia et al., 2007).在对照(CK)及0.7×10⁶ cells·mL^-1体系, 硫铁矿氧化后表面不存在明显的侵蚀坑.1.4×10⁷与2.1×10⁷ cells·mL^-1体系所得生物氧化后硫铁矿表面存在明显的侵蚀坑.而在1.4×10⁷ cells·mL^-1+50% Fe-free 9K与1.4×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K体系所得硫铁矿表面存在次生铁矿物覆盖硫铁矿的现象, 并且全量浓度无铁改进型9K培养基的引入导致次生铁矿物对硫铁矿覆盖尤为明显.结合反应环境, 该次生铁矿物应为黄铁矾.1.4×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理组次生铁矿物对硫铁矿的高密度覆盖较好佐证了图 2~4中pH、总Fe、SO₄^2-浓度在1.4×10⁷ cells·mL^-1+50% Fe-free 9K与1.4×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K处理中的变化规律.

3.4 硫铁矿氧化后所得酸性废水中和效果

2.10×10⁷ cells·mL^-1、1.40×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K两处理组所得酸性废水经CaO中和至约7.00时, 体系总Fe离子、SO₄^2-离子的去除效果及中和后所得中和残渣SEM照片如图 6所示.

可见, 将A. ferrooxidans LX5密度为2.10×10⁷ cells·mL^-1的硫铁矿氧化体系所得酸性矿山废水pH从初始的1.82中和至约7.00, 体系总Fe离子、SO₄^2-浓度分别从初始的935、3205 mg·L^-1降低至5、2348 mg·L^-1, 即总Fe离子与SO₄^2-去除率分别为99.5%、26.7%.将1.40×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K体系硫铁矿氧化所得酸性矿山废水pH从初始的1.44中和至约7.00时, 体系总Fe离子、SO₄^2-浓度分别从初始的3011、15258 mg·L^-1降低至7、3981 mg·L^-1, 即总Fe离子与SO₄^2-去除率分别为99.8%、73.9%.换言之, 即使酸性矿山废水被用石灰中和至约7.00时, 体系SO₄^2-仍然残留量较大, 需要给予足够重视.此外, 2.10×10⁷ cells·mL^-1中和体系由于体系SO₄^2-去除率较低, 所的中和残渣的SEM图中矿物形貌基本为铁氢氧化物的无定型形貌.而在1.40×10⁷ cells·mL^-1+100% Fe-free 9K体系SO₄^2-去除率较高, 中和残渣的SEM图中大多为以二水硫酸钙为主的长条形晶体形貌(Liu et al., 2015).

4 结论(Conclusions)

氧化亚铁硫杆菌密度与营养供给对硫铁矿生物氧化过程典型污染物(H⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、SO₄^2-)释放有重要影响.相对于氧化亚铁硫杆菌密度增加, 增加氧化亚铁硫杆菌养分供给更易促进硫铁矿氧化过程中典型污染物的释放.无养分供给情况下, 硫铁矿生物氧化体系中总Fe离子主要以Fe²⁺存在, 在养分充裕供给情况下, 硫铁矿生物氧化体系中总Fe离子主要以Fe³⁺存在, 然而, 过多的养分供给(如在本研究中的全量无铁改进型9K液体培养基供给), 体系合成的次生铁矿物对硫铁矿的覆盖作用会阻碍总Fe离子与SO₄^2-的释放.硫铁矿氧化后所得酸性废水经CaO中和至pH约为7.00后, 总Fe近乎全部去除, 而SO₄^2-去除率相对较低.可见, 酸性矿山废水采用CaO中和后, 应对排水中的SO₄^2-浓度给予足够重视.