2018, Vol. 38
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2. 四川大学华西医院麻醉研究室, 成都 610041;
3. 四川大学华西医院消化疾病研究室, 成都 610041
2. Department of Anesthesiology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041;
3. Division of Digestive Diseases, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041
随着现代工业技术的发展, 土壤重金属污染日益严重.在诸多危害土壤生态环境的重金属元素中, 六价铬Cr(Ⅵ)是国际公认的致癌金属物, 一旦污染环境很难自然修复, 严重危害生态环境和人类健康, 研究铬污染的脱污修复技术对于环境保护和人类健康具有重要意义.目前, 土壤重金属污染修复方法主要包括物理、化学和生物修复等方法(Dönmez et al., 2005).其中, 生物修复因具有高效、低成本和无二次污染等优势被广泛应用, 而其中的微生物修复技术利于改善生态环境, 具有良好的应用前景, 现已成为环境修复技术领域中的研究热点之一(Morgan et al., 2005).微生物主要通过吸附沉淀、溶解、转化等作用来减少环境中重金属的含量(曹书苗, 2016), 此外, 微生物的生长繁殖能更高地强化重金属在植物体内的转移分布, 不会滞后植物根系对土壤根系环境的适应期.有研究表明, 将微生物与植物修复技术相结合提高了植物的生物量和重金属积累量(Langella et al., 2014), 对土壤重金属污染修复具有重要意义.目前已发现较多对铬具有耐受性的细菌菌株, 但对于放线菌在促进修复植物生长潜能方面的研究却比较少.
土壤微生物包括与植物根部相关的自由微生物、共生根际微生物, 它们是根际生态区的完整组成部分(Khan, 2005), 根际微生物可以通过有效定殖, 重寄生, 产生抗生素、植物生长调节素等机制促进植株生长, 包括分泌吲哚乙酸(IAA)、含铁细胞合成、溶磷、固氮等(Whipps, 2001), 通过产生几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶、磷酸酶等, 抵抗病原菌的侵染(纪春艳等, 2008), 提高植物的抗逆性, 使植物更好地生长.放线菌作为植物根际微生物群落的重要组成部分, 其所产生的抗菌物质和其它生理活性物质的比例也显著高于根际周围土壤来源的放线菌(Basil et al., 2004).此外, 放线菌产生的孢子能够耐热和抗干燥, 可以在不利环境下长期存活, 产生的菌丝体在植物体内的定殖能力较强, 这就有利于诱导寄主产生系统抗性抵御其它微生物的侵害(Li et al., 2014).近年来根际放线菌引起许多学者的关注, 特别是放线菌、重金属和植物三者之间的关系, 有研究发现, 放线菌可以提高金属污染区的植物修复作用, 减轻土壤污染对植物的毒害, 使植物可以进行自我修复(Benimeli et al., 2011).也有研究表明, 重金属环境中的放线菌具有耐重金属的作用, 如铜污染区土壤中分离出对铜具有耐受性的放线菌(Albarracín et al., 2005), 在镉污染土壤中分离出对镉具有耐受性的放线菌(周赓等, 2017)等.因此, 从Cr(Ⅵ)污染矿区植株根际土中分离获得具有耐Cr(Ⅵ)、抗菌和促生能力的菌株具有可行性.虽然对金属矿区放线菌已经有了一定的研究, 但针对重金属矿区植物根际放线菌的研究报道较少.本研究以攀枝花矿区糙野青茅根际土为对象, 旨在分离样品中的放线菌, 筛选出耐重金属Cr(Ⅵ)的菌株, 并研究其抗菌活性、促生能力、产胞外水解酶能力等, 为重金属Cr(Ⅵ)污染土壤的生物修复挖掘出具有价值的功能菌株.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料 2.1.1 样品糙野青茅植物采自攀枝花铬污染矿区(26°05′~27°21′N, 101°08′~102°15′E) (每千克土中含Cr(Ⅵ)385.47 mg), 随机选取3个样方, 每个样方面积约1 m2, 在每个样方中随机选取3株糙野青茅植株进行根际土采集, 根际土壤的采集参照Clegg等(1997)的方法进行.
2.1.2 培养基分离培养基：高氏一号(袁红莉等, 2009), 加入制霉菌素30 mg·L-1, 重铬酸钾30 mg·L-1；
筛选培养基：LB(细菌)、PDA(真菌) (袁红莉等, 2009), 蒙金娜培养基(田宏等, 2004).
2.1.3 试剂本研究所用IAA显色液(Gordon et al., 1951)、SA液、CAS检测液(Shin et al., 2001; 荣良燕等, 2011)的配制均参考相关文献.刚果红、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶等均购自上海生物工程有限公司.
2.1.4 抗菌活性指示菌株植物病原真菌：黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、玉米弯孢菌(Curvularia lunata)、赤霉菌(Gibberella saubinetii)；病原细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia Coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均由四川农业大学植物病理实验室提供.
2.2 方法 2.2.1 放线菌的分离、纯化采集到的新鲜根际土样用无菌水制成10-4~10-7菌悬液, 涂布在固体分离培养基上, 放置于28 ℃生化培养箱中培养, 分离到的放线菌于高氏一号培养基上进行纯化和斜面保种, 将保种好的菌株置于4 ℃冰箱保藏.
2.2.2 菌株的形态学观察观察分离的27株菌在平板上的生长形态, 通过革兰氏染色(袁红莉等, 2009)对菌株进行光学显微形态观察；采用插片法获取放线菌样本, 再进行干燥、镀金(Kumar et al., 2011; Prakash et al., 2014), 在扫描电镜(Zeiss EVO 18)下进行扫描形态观察, 初步鉴定其是否为放线菌.
2.2.3 耐Cr(Ⅵ)菌株的筛选将分离出的纯菌株接种于K2Cr2O7浓度为0、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg·L-1的高氏一号平板上, 3次重复, 28 ℃培养5~7 d, 记录生长情况.
(1) 不同Cr(Ⅵ)浓度对放线菌去Cr(Ⅵ)率的影响
筛选出对Cr(Ⅵ)耐受性较强的放线菌接入高氏一号液体培养基, 28 ℃摇床培养5~7 d, 制成种子液.离心弃上清后加蒸馏水, 调节其OD值一样, 按1 %(V/V)的接种量加入含K2Cr2O7的高氏一号液体培养基中, K2Cr2O7浓度达到100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg·L-1, 28 ℃摇床培养3~5 d, 采用原子吸收分光光度法测定上清中残留Cr含量(白艳丽等, 2008; 杨文玲等, 2013).
(2) 不同培养时间对放线菌去除Cr(Ⅵ)的影响
根据代表菌株在不同Cr(Ⅵ)浓度的去Cr(Ⅵ)率, 确定最适Cr(Ⅵ)浓度, 选择去Cr(Ⅵ)能力较高的菌株按照(1)的方法接入含该Cr(Ⅵ)浓度的高氏一号液体培养基中, 以不接菌的含K2Cr2O7的高氏一号液体培养基作为空白对照, 3次重复, 28 ℃摇床培养1、2、3、4、5、6、7、8 d, 取2 mL菌液离心取上清, 采用原子吸收法测定上清液中的Cr(Ⅵ)含量.
2.2.4 分子生物学鉴定筛选出的耐铬菌株, 按照Ming等(2009)的方法提取菌株总DNA并进行PCR扩增.PCR产物送往生工生物工程上海(股份)有限公司进行测序, 测序获得的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对, 确定分离菌株的分类地位, 利用MEGA 6.0(Tamura et al., 2013)软件构建N-J系统发育树.
2.2.5 放线菌抗菌活性检测菌株抗菌活性采用对峙生长法进行测试：取真菌菌饼(d=5 mm)置于固体PDA培养基中心, 距真菌菌饼3 cm的上下左右各接一株放线菌的菌饼(d=5 mm), 设3次重复, 28 ℃培养5~7 d, 观察记录抑菌圈大小.取病原细菌菌悬液涂布于固体LB培养基, 将带有根际放线菌的菌饼(d=5 mm)移植到LB板上, 每板接5个, 设3次重复.37 ℃培养5~7 d, 观察记录抑菌圈大小.
2.2.6 放线菌促生能力检测放线菌菌株产IAA能力测定参考Gordon等(1951)方法进行, 产铁载体能力的测定参照容良燕等(2011)方法进行, 溶磷能力测定参考田宏等(2004)方法进行.
根据耐Cr(Ⅵ)及促生结果选择综合效果较好的菌株SCAU9002、SCAU9008进行盆栽实验, 以所筛选的菌株能广泛应用为基础, 选择玉米作为研究对象, 初步探究其在重金属Cr(Ⅵ)胁迫下的促生效果.土壤采自成都附近的一个生态农业村, 无污染, 添加K2Cr2O7, 使土中Cr(Ⅵ)为300 mg·kg-1, 分别装到花盆中, 每盆约2.5 kg.共3组实验：接菌株SCAU9002、菌株SCAU9008及不接种菌株对照(CK).参照邓振山等(2012)的方法对玉米进行催芽、浸种、移栽, 每盆1株, 放在光照室中培养, 每天每盆浇水10 mL.分别在第3片和第5片真叶长出浇灌约50 mL放线菌菌悬液(3.8×108 CFU·mL-1)(Phieler et al., 2015; 侯伶龙等, 2010; 邓振山等, 2012), 对照处理灌溉50 mL无菌水, 每组3个重复.待玉米生长40 d后收获, 通过EPSON1680根系扫描仪(Epsn, LongBeach, USA)对各组样品根系进行扫描, 用WinRhizo2005a根系分析软件分析(孙三杰等, 2012; 刘世全等, 2014), 获得根系总根长、总根表面积、平均根系直径、根尖数、分支数等形态指标.同时测量玉米植株的株高、生物量.
2.2.7 放线菌产胞外酶能力检测将选取的菌株菌饼接于刚果红培养基上培养5~7 d, 有透明圈的为纤维素酶阳性(李静等, 2016)；分别将菌株点接于淀粉酶培养基、木聚糖酶培养基和蛋白酶培养基上培养5~7 d, 在以上培养基上能产生透明圈的分别为淀粉酶阳性、木聚糖酶阳性和蛋白酶阳性(钟雄明等, 2007).
2.2.8 放线菌抗逆能力分析pH耐受实验采用磷酸盐缓冲液与高氏一号培养基混合, 平板接种, 28 ℃培养5~7 d；菌株耐盐能力, 配制NaCl浓度分别为3%、5%、7%、10%、15%、20% (W/V)的高氏一号培养基, 接种放线菌菌株, 28 ℃培养5~7 d, 观察并记录结果.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 植物根际放线菌的分离、纯化从矿区植物根际土壤中共分离获得27株菌, 根据徐丽华等(2007)介绍的相关操作方法, 通过观察菌株菌丝、孢子形态, 及培养特征, 如气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、色素产生情况等, 对分离得到的菌株进行形态学初步鉴定.结果如图 1所示, 菌株在显微镜下表现出丝状菌丝(图 1a1、b1), 在扫描电镜下呈现出明显的孢子链, 为典型的放线菌形态(图 1a2、b2), 确定所分离获得的27株菌均为放线菌.
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| 图 1 菌株的光学显微形态及扫描显微形态 (a1、b1分别为菌株SCAU9008、SCAU9002的光学显微形态；a2、b2分别为菌株SCAU9008、SCAU9002的电镜扫描形态) Fig. 1 Microscopic morphology and the scanning electron micrograph of strains (a1, b1: Microscopic morphology of SCAU9008, SCAU9002, a2, b2: The scanning electron micrograph of SCAU9008, SCAU9002) |
观察菌株在含K2Cr2O7浓度不同的培养基上的生长状态, 主要包括菌丝、孢子形态以及色素产生情况, 并将其与在不含K2Cr2O7培养基上的生长状态进行比较, 初步判断菌株对Cr的耐受程度.结果显示(表 1), 27株供试菌有14株菌能在含500 mg·L-1的K2Cr2O7的高氏一号平板上生长, 随着Cr(Ⅵ)浓度的增加, 根际放线菌的长势逐渐变弱或不能生长.当Cr(Ⅵ)浓度达到800 mg·L-1时, 有4株菌(SCAU9002、SCAU9008、SCAU9009、SCAU9011)可以生长, 而当Cr(Ⅵ)浓度达到1000 mg·L-1时, 只有菌株SCAU9002、SCAU9008可生长, 表明这2株菌具有较强的耐Cr(Ⅵ)能力.
| 表 1 耐铬根际放线菌初筛 Table 1 The resistance to Cr (Ⅵ) initial screening results of the rhizosphere actinomycetes |
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将耐Cr(Ⅵ)能力较强的4株放线菌(SCAU9002、SCAU9008、SCAU9009、SCAU9011)接入不同K2Cr2O7浓度的高氏一号液体培养基中培养5 d后，结果表明(图 2), 在Cr(Ⅵ)浓度为300 mg·L-1时, 4株菌对Cr(Ⅵ)的去除率最高, 分别为69.23%、71.56%、41.56%、40.15%.Cr(Ⅵ)浓度小于300 mg·L-1时, 放线菌对Cr(Ⅵ)的去除能力随Cr(Ⅵ)浓度的增加而增加, 而Cr(Ⅵ)浓度大于300 mg·L-1时, 放线菌对Cr(Ⅵ)的去除率随Cr(Ⅵ)浓度的增加逐渐减小, 表明Cr(Ⅵ)浓度小于300 mg·L-1, 能促进菌株对Cr(Ⅵ)的去除率, 超过300 mg·L-1就会抑制菌株对铬的去除率.
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| 图 2 菌株SCAU9002、SCAU9008、SCAU9009和SCAU9011在不同铬浓度下的铬去除率 Fig. 2 Effect of chromium concentration on Cr6+ removal capacity of SCAU9002, SCAU9008, SCAU9009 and SCAU9011 |
将耐Cr(Ⅵ)能力最为突出的2株菌(SCAU9008、SCAU9002)接入K2Cr2O7浓度为300 mg·L-1的高氏一号培养基中培养.Cr(Ⅵ)的去除率表明(图 3), 随着培养时间的增加, 2株放线菌对Cr(Ⅵ)的去除率逐渐增大, 培养至6 d时菌株对Cr的去除率达到最大, 分别为78.41%和81.17%, 但继续培养则表现出对Cr(Ⅵ)的去除率逐渐减小.由此可以得出, 这两株根际放线菌在300 mg·L-1 Cr(Ⅵ)浓度下, 去Cr(Ⅵ)率的最佳培养时间为6 d.
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| 图 3 培养时间对菌株SCAU9008和SCAU9002去铬率的影响 Fig. 3 Effect of culture time on Cr6+ removal capacity of SCAU9008 and SCAU9002 |
对14株具有耐Cr(Ⅵ)能力的菌株进行16S rRNA基因测序分析, 并基于16S rRNA基因序列构建N-J系统发育树(图 4), 14株菌分属于链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)和冢村氏菌属(Tsukamurella) 3个属, 其中大多数菌株属于链霉菌属(Streptomyces), 占耐Cr(Ⅵ)放线菌总数的85.7%, 为攀枝花矿区糙野青茅根际土耐Cr(Ⅵ)放线菌的优势菌群.
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| 图 4 分离菌株16S rRNA基因序列的系统发育N-J树 Fig. 4 Phylogenetic N-J tree based on16S rRNA gene sequences showing the positions of isolate rhizospheric actinobacteria |
14株根际放线菌促生能力检测结果表明(表 3), 8株菌能够在CAS培养基上产生橘红色透明圈的菌株, 进一步液体复筛, 结果证实, 这8株菌均具有产铁载体能力, 其中菌株SCAU9003、SCAU9009、SCAU9013表现出较强的产铁载体能力.此外, 10株菌(71.4%)在蒙金娜培养基上产生透明圈, 说明其具有溶磷作用, 其中菌株SCAU9002、SCAU9006和SCAU9009的水解圈直径分别达15.4、13.2和13.5 mm, 表现出较强的溶磷效果；14株菌都能够产IAA, 其中菌株SCAU9004产IAA的能力最大, 培养5 d后IAA产量达到42.85 mg·L-1；菌株SCAU9002、SCAU9006、SCAU9008、SCAU9009、SCAU9013同时具有3种促生功能.说明糙野青茅根际放线菌在促进植物生长方面具有很大潜力.
| 表 3 根际放线菌促生能力及抗逆能力 Table 3 Plant growth and resilience promoting of the rhizosphere actinomycetes |
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根据菌株耐Cr(Ⅵ)、促生能力的研究结果, 选择综合效果较好的菌株SCAU9002、SCAU9008进行盆栽促生实验, 初步探究在重金属胁迫下其对玉米的促生效果.玉米生长及根系形态特征统计结果表明(图 5, 表 2)：当土壤中Cr(Ⅵ)浓度为300 mg·kg-1时, 菌株SCAU9002和SCAU9008处理下玉米的生长情况均优于对照组(CK), 株高分别高出对照组24.62%和18.78%, 地下平均生物量分别高出对照组154.52%和163.32%, 地上平均生物量分别高出对照组111.63%和100.31%；与对照组相比, 实验组的总根长、总根面积、平均根系直径、根尖数、分指数等各项指标均大于对照组, 表明在土壤重金属胁迫下, 放线菌SCAU9002和SCAU9008不仅可以促进玉米植株的生长, 提高植株的生物量, 还能促进玉米根系的生长, 表现出较好的促生效果.
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| 图 5 菌株对玉米的促生效果 (a.SCAU9002；b.SCAU9008) Fig. 5 The growth promoting effect to align="center"orn of strians (a. SCAU9002; b. SCAU9008) |
| 表 2 玉米植株生物量及根系形态特征 Table 2 Weight and root feature of corn |
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14株根际放线菌产胞外水解酶活性检测结果表明(表 3), 14株菌(100%)具有纤维素降解能力, 9株菌(64.3%)的降解能力很强；8株菌(57.1%)具有淀粉降解能力；3菌株(21.4%)具有分解木糖的能力；3株菌(21.4%)具有很强的蛋白降解能力；菌株SCAU9004、SCAU9006、SCAU9012、SCAU9013、SCAU9014同时具有3种及以上产胞外水解酶的能力.
3.6 根际放线菌抗菌活性检测对具有抗重金属Cr(Ⅵ)能力的14株根际放线菌进行抗菌活性检测, 结果如表 3所示.菌株SCAU9006除了黄瓜炭疽病原菌以外, 对其余6种病原菌都有抑制作用, 对赤霉菌的抑制作用最强；菌株SCAU9012对病原细菌无抗性, 但对赤霉菌和黄瓜炭疽病菌的抗性很强.其余菌株抗菌活性不明显.
3.7 根际放线菌pH、盐度生长范围由表 3可知, 除菌株SCAU9007, 其余13株菌在5.0~8.0的pH范围内均可生长, 具有较广泛的pH生长范围.所有菌株在5% NaCl的培养基中均能生长；菌株SCAU9002、SCAU9005、SCAU9012、SCAU9014能在7% NaCl下生长.结果表明, 本研究分离的放线菌具有较好的抗逆性.
与传统的化学、物理修复土壤重金属污染的方法相比, 生物修复技术具有高效、无污染等优点.植物修复土壤重金属污染是常见的生物修复法, 但大多数超富集植物具有生长缓慢、生物量小、根系扩展深度有限、对金属有选择性及从根部到地上部的重金属转移率低等缺陷, 导致实际修复效率低和修复时间长(Puschenreiter et al., 2001), 向土壤中接种微生物能够有效提高植物对重金属的吸附能力和吸附效率(Rojas-Tapias et al., 2012; Phieler et al., 2015).微生物通过胞外沉淀和固定、细胞内聚合及氧化还原等作用, 改变土壤重金属的赋存状态, 降低重金属对植物的毒害, 对植物吸收和积累重金属具有重要影响(曹书苗, 2016).侯伶龙等(2010)发现鱼腥草根部接种高耐镉能力的放线菌后, 提高了镉在鱼腥草地上部的积累, 促进植物对隔的富集作用；Phieler等(2015)对具有耐重金属能力的放线菌研究发现, 接种放线菌能够促进高粱的存活率和对镉及钴的富集率.本研究从糙野青茅根际土中筛选获得的14株耐Cr(Ⅵ)放线菌中, 菌株SCAU9002和SCAU9008对Cr(Ⅵ)具有强耐受能力, 相同的接种量下对Cr(Ⅵ)的去除率略高于从同一环境同一植物中分离获得的细菌(廖萍等, 2015), 且在重金属Cr(Ⅵ)的胁迫下, 菌株SCAU9002和SCAU9008对玉米的生长具有明显促进作用, 表明具有耐受重金属能力放线菌的存在可以大大降低重金属对植物的毒害作用.放线菌不仅能通过分泌生长素(IAA)、赤霉素(GA)等植物激素、产生铁载体、固氮作用等直接促进植物的生长发育(Ribeiro et al., 2012; 田婧等, 2016), 还能通过与病原菌竞争有限的生活空间和营养, 抑制病原菌生长从而增强植物抵御病害的能力间接促进植物生长(Bacon et al., 2001), Cr(Ⅵ)耐受菌株的抗菌活性检测发现小单孢菌SCAU9012对供试病原真菌均有抗菌活性, 对黄瓜炭疽病菌的抗性尤为突出, 表现出广谱的抗菌活性.此外, 根际放线菌所产生的代谢产物能刺激宿主植物的生长发育, 提高宿主植物对生物胁迫的抵抗能力, 并能通过产生相关细胞壁降解酶等胞外分泌物来提高植物自身对致病菌的防卫能力(田婧等, 2016), 在增强宿主抗逆性、强化植物重金属富集能力等方面起着至关重要的作用(Chen et al., 2014).值得注意的是, 本研究筛选获得具有强耐Cr(Ⅵ)和促生能力的链霉菌SCAU9002同时具有纤维素降解能力和淀粉水解能力, 链霉菌SCAU9008同时具有纤维素降解能力和木糖降解能力, 表明对Cr(Ⅵ)有强耐受性的菌株也具有良好的产胞外酶的功能.
4 结论(Conclusions)1) 本研究从攀枝花矿区植物根际土共筛选获得14株具有耐重金属Cr(Ⅵ)的放线菌, 经过形态学和16S rRNA基因测序, 菌株SCAU9011被鉴定为冢村氏菌属(Tsukamurella), 菌株SCAU9012被鉴定为小单孢菌属(Micromonospora), 其余12株被鉴定为链霉菌属(Streptomyces).
2) 耐Cr(Ⅵ)能力较强的4株放线菌(SCAU9002、SCAU9008、SCAU9009、SCAU9011)在Cr(Ⅵ)浓度为300 mg·L-1时, 对Cr(Ⅵ)的去除率是最佳的, 分别为69.23%、71.56%、41.56%、40.15%.
当Cr(Ⅵ)浓度小于300 mg·L-1时, 放线菌对Cr(Ⅵ)的去除能力随Cr(Ⅵ)浓度的增加而增大, 而Cr(Ⅵ)浓度大于300 mg·L-1时, 放线菌对Cr(Ⅵ)的去除率随Cr(Ⅵ)浓度的增加而减小.当Cr(Ⅵ)浓度为300 mg·L-1时, 菌株SCAU9002和SCAU900培养6 d对Cr(Ⅵ)的去除率分别为81.17%和78.41%,
3) 菌株SCAU9002具有纤维素降解和淀粉水解能力, 菌株SCAU9008具有纤维素降解和木糖降解能力.这两株菌同时具有产铁载体、产IAA和溶磷能力, 具有较强的耐盐能力, 能生长的pH范围较广, 且在重金属Cr(Ⅵ)的胁迫下表现出明显的促生效果.经菌株SCAU9002和SCAU9008处理的玉米株高、生物量根系的发达程度均高于对照组.
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