1 引言(Introduction)

酸性矿山废水(AMD)不仅酸度高, 同时含有大量Fe、硫酸根及重(类)金属元素(Wei et al., 2013；Vhahangwele, 2016；Wu et al., 2016).此类废水不仅会腐蚀井下管道及排水泵等设备, 亦将严重污染地表水及土地资源, 因而引起国内外学者的广泛关注(Liu et al., 2013).目前, AMD主要采用石灰中和法治理(Song et al., 2014；Meschke et al., 2015；Lee et al., 2016).但因石灰需要量较大导致处理成本高, 且中和产物Fe(OH)₃、Fe(OH)₂、CaSO₄等易黏附在石灰表面而影响中和效率, 并导致大量废渣产生, 带来二次污染风险.因此, 探索Fe、硫酸根及重(类)金属元素的安全、环保去除对治理AMD具有重要意义.

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)能够高效催化酸性硫酸盐环境中Fe²⁺向Fe³⁺转化, 并伴随着Fe³⁺水解产生施氏矿物、黄铁矾等次生铁矿物(宋永伟等, 2013；Zhu et al., 2013).具体反应式如下：

(1)

(2)

(3)

式中，M⁺为K⁺、NH₄⁺、Na⁺等一价阳离子.

施氏矿物具有纳米级粒度和不规则孔道结构, 比表面积多在100~200 m²·g^-1, 且富含羟基、硫酸根等基团(Jönsson et al., 2005；Waychunas et al., 2005；Bang et al., 2005).黄铁矾具有不溶于稀酸, 易于沉淀、洗涤和过滤等优点, 也是性能优异、稀有昂贵的赭黄色无机颜料(周顺桂等, 2004), 且在作为固定化载体时有助于A.ferrooxidans生物膜的形成(Karamanev, 1991；Elgersma et al., 1993；Dutrizac, 1996；Gómez et al., 2000).已有的研究结果证实, 施氏矿物和黄铁矾对重(类)金属离子均有较大的吸附及共沉淀作用, 是较为理想的吸附材料(Gan et al., 2015；Mihone et al., 2015；Zhang et al., 2016), 对重金属废水的治理具有潜在应用价值.由上启示, 生物成因施氏矿物和黄铁矾不仅可以有效去除Fe、硫酸根, 还可通过吸附或共沉淀方式清除有毒元素.促使酸性硫酸盐环境中Fe向次生铁矿物转变具有一定的科学研究价值.

影响次生铁矿物形成的因素很多, 其中最主要的是溶液的酸度、反应时间、反应温度、能源物质Fe²⁺浓度、一价阳离子种类/浓度、晶种种类等(Dutrizac et al., 1976；Dutrizac, 1999；邓志明等, 2002).根据化学方程式(1)~(3)可知, 施氏矿物和黄铁矾生物合成的实质是 Fe₈O₈(OH)₆SO₄或MFe₃(SO₄)₂(OH)₆的过程, Fe³⁺作为中间产物, 其供应速率决定了次生铁矿物的形成.因此, 笔者推测, A. ferrooxidans介导的次生铁矿物的矿相和矿量可能主要受体系中酸效应、Fe²⁺浓度、及Fe与M的比例3个因素的调控.已有研究表明, 提高K⁺浓度有助于黄钾铁矾的形成而不利于施氏矿物生成(Bigham et al., 1996；Gramp et al., 2008；Liao et al., 2009).柏双友等(2011)也曾考察过K⁺、NH₄⁺、Na⁺共存体系下的生物成矿, 但只收集到黄钾铁矾和施氏矿物的混合物, 并未发现黄铵铁矾和黄钠铁矾.可见, 3种阳离子促进Fe向次生铁矿物转变的能力迥异.然而, 在矿物合成及矿相转变报道中, 以黄钾铁矾居多, 而黄钠铁矾和黄铵铁矾则相对较少.其中, Na⁺促进Fe和硫酸根的成矿能力如何？次生铁矿物相与矿物量之间有何联系？其在调控施氏矿物和黄钠铁矾形成方面是否起到很大作用？这些疑问尚需进一步证实.

鉴于此, 本研究以去除AMD中Fe、硫酸根及重(类)金属元素为目的, 通过A.ferrooxidans介导的生物矿化法, 研究不同AMD环境下Na⁺对体系Fe²⁺氧化率、总Fe沉淀率、次生铁矿物矿相等的影响.以期为促使酸性硫酸盐环境中Fe向次生铁矿物的转变和调控提供必要的理论依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 供试材料

改良9K培养基：(NH₄)₂SO₄ 3.5 g, KCl 0.119 g, K₂HPO₄ 0.058 g, Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.0168 g, MgSO₄·7H₂O 0.583 g, 蒸馏水1000 mL, pH 2.5, 121 ℃灭菌30 min.

A. ferrooxidans休止细胞制备：将A. ferrooxidans接种在改良9K培养基中, 置于28 ℃、180 r·min^-1摇床中振荡扩培, 指数生长阶段后期停止培养(约2~3 d).将培养液经定性滤纸过滤以除去生成的铁沉淀物, 将滤液以10000×g的相对离心力(4 ℃、10 min)离心收集菌体, 并用pH 1.5的酸水(H₂SO₄配制)洗3次, 除去各种杂离子.将这些菌体悬浮于pH 2.5的酸水(H₂SO₄配制), 所得即为A.ferrooxidans浓缩菌液.采用双层平板计数法测得菌液密度为5×10⁸ cell·mL^-1.

2.2 试验设置

采用去离子水和1:1硫酸配制得到体积为135 mL、pH为2.6、2.3、2.0的若干酸性溶液, 移取15 mL A. ferrooxidans菌液, 使各溶液中A. ferrooxidans密度均为5×10⁷ cell·mL^-1.混合均匀后, 准确加入FeSO₄·7H₂O, 设置Fe²⁺浓度梯度为20、80和160 mmol·L^-1.根据Fe²⁺浓度调节各体系Na₂SO₄的加入量, 使得Fe/Na摩尔比分别为0.1、0.5、1.0、2.0, 依此共设置36个处理.将三角瓶置于28 ℃、180 r·min^-1摇床中进行生物氧化和水解成矿反应.期间定时观察菌液颜色变化并监测溶液中pH、Fe²⁺、TFe(总Fe)浓度.待培养至终点时, 观察记录各三角瓶中矿物的表观特征, 通过中速定性滤纸过滤, 并用稀H₂SO₄ (pH 2.0~3.0)和去离子水分别润洗2次, 以去除矿物表面吸附的离子.收集矿物经35 ℃烘干后进行称重和XRD测定.

2.3 测定方法与数据分析

采用pHS-3C精密pH计测定溶液pH值；Fe²⁺和总Fe浓度采用邻啡罗啉比色法测定；矿物相采用X射线衍射仪测定(XRD, Bruker D8), 测试工作条件为：管电压40 kV, 管电流40 mA, 扫描区间10°~80°(2θ), 步长0.01°, 扫描速率6°·min^-1, Cu靶.实验数据采用Origin 8.0软件作图分析.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 酸性体系颜色变化和收集矿物的表观特征

图 1为160 mmol·L^-1 Fe²⁺体系培养前后颜色的变化情况.因空气氧化Fe²⁺程度不同导致各酸性体系之间颜色存在差异, 溶液随pH降低由金黄色向浅绿色转变.经生物氧化成矿后, 各体系之间差异愈加明显.在Fe/Na摩尔比同水平下, 溶液最终颜色随初始pH降低而加深, 静置后上清液浊度也随之加大, 且在三角瓶内壁出现结垢现象, 说明合成矿物的颗粒度、沉降性、聚团程度等可能有所不同.从收集矿物的表观特征来看, 矿物颜色随Fe/Na摩尔比的提高而加深, 且pH越低, 形成矿物越少.当pH=2.0、Fe/Na=0.1时, 生物合成的矿物极少, 基本上不能收集检测, 说明在2.0~2.6酸度范围内, 高pH更有利于矿物的生成.

3.2 酸性体系pH变化

根据图 2可知, Fe²⁺浓度为160 mmol·L^-1时, 各处理间pH的变化过程基本一致, 大致呈先上升后下降的趋势, 并在0~48 h期间出现峰值.这与Fe²⁺作为能源物质先被A. ferrooxidans氧化(消耗H⁺, pH升高)和后期Fe³⁺水解成矿(释放H⁺, pH降低)密切相关.Fe/Na摩尔比对pH的变化也有一定影响, 表现出Fe/Na摩尔比越大, pH值峰值越小, 培养终点酸度也越大.随着成矿反应的持续进行, Fe/Na摩尔比为0.5、1.0、2.0体系最终pH值分别下降至2.45、2.39、2.32, 而Fe/Na=0.1时则下降幅度较小.分析认为, 出现这种“两极分化”可能有两方面原因：其一, Na₂SO₄作为中性盐, 当Na⁺浓度过高时, 由于反应体系渗透压的变化以致菌体水分大量流失而失去活性, A. ferrooxidans氧化Fe²⁺能力较弱, 间接抑制氧化产物Fe³⁺的水解成矿过程, 导致pH只升不降或下降幅度较小.其二, 根据反应式(2)、(3)可知, 生物成因施氏矿物在消耗等量Fe³⁺时所产生的H⁺比黄铁矾更多, 说明适量Na⁺的参与可能会改变次生铁矿物的合成行为, 使得Fe³⁺水解成矿过程更有利于向施氏矿物偏移, 从而导致酸效应过程存在一定的差异.

3.3 生成矿物的XRD图谱

图 3为Fe²⁺浓度在160 mmol·L^-1时培养终点收集得到的次生铁矿物XRD图谱.参考JCPDS晶型黄钠铁矾和非晶型施氏矿物的标准图谱可知(Jönsson et al., 2005), 当Na⁺浓度满足要求时(Fe²⁺=160 mmol·L^-1, Fe/Na=0.5~0.1), 较低的初始pH有利于黄钠铁矾的形成, 表现在pH值由2.6下降至2.0时, 黄钠铁矾的部分衍射峰开始出现并逐渐增强(如2θ=15.84°、17.51°、28.57°、29.10°、40.25°、45.81°、49.68°等).Regenspurg等(2004)把这种酸效应现象归因于体系具备较高的Fe³⁺供应速率, 从而促进了黄铁矾的形成, 但本试验结果表明并非如此, 在pH=2.0时Fe²⁺氧化率极低.前已述及, 当Na⁺浓度在A. ferrooxidans耐受范围内时, 生物成因次生铁矿物的合成过程可能受其浓度高低的影响, 而高浓度Na⁺则会抑制A. ferrooxidans的Fe²⁺生物氧化活性, 从而间接阻碍Fe³⁺的水解成矿过程.因此, 根据反应式(2)、(3)可知, 1 mol Fe³⁺水解生成施氏矿物可释放出2.75 mol的H⁺, 而1 mol Fe³⁺水解生成黄铁矾却只能释放出2 mol的H⁺.相比之下, 过低的pH值可能对施氏矿物合成行为的抑制作用更大, 从而导致黄钠铁矾更易形成.王长秋等(2005)在用化学方法合成黄钾铁矾时也报道过相似现象.

根据衍射峰位置及强度(2θ=35.16°)判断, 各处理下所获得次生铁矿物中均含有非晶型施氏矿物(Bigham et al., 1994).其中, 当Fe/Na摩尔比为1.0、2.0时, pH在2.0~2.6范围内均收集到纯净施氏矿物.而当Na⁺浓度上升至320 mmol·L^-1时(Fe/Na=0.5), 次生铁矿物的合成途径开始向黄钠铁矾转变, 且其特征衍射峰随着Na⁺浓度提高愈加明显.Bai等(2012)研究结果表明, 在Fe²⁺浓度为160 mmol·L^-1溶液中, 当K⁺≥1.60 mmol·L^-1(即Fe/K≤100)时就出现黄钾铁矾的衍射峰.而本试验中Fe/Na的摩尔比则需要达到0.1才能实现, 说明Na⁺的成矾能力远小于K⁺.

3.4 酸性体系Fe²⁺、总Fe的变化情况

研究考察了初始pH=2.0时, 酸性体系Fe²⁺浓度和Fe/Na摩尔比对Fe²⁺氧化和总Fe沉淀去除的综合影响.由图 4可知, 当Na⁺浓度在A. ferrooxidans耐受范围内时, 160、80、20 mmol·L^-1的Fe²⁺分别在72、48、48 h内被完全生物氧化.当Fe/Na=0.1时, Fe²⁺浓度为160、80 mmol·L^-1处理的生物氧化性均受到抑制, 最终Fe²⁺氧化率分别只有2.11%和3.61%.而由Fe²⁺浓度为160 mmol·L^-1处理可知, 当Fe/Na=0.5时(Na⁺浓度320 mmol·L^-1), 虽然Fe²⁺能够在72 h时基本被氧化完全, 但与Fe/Na=2处理相比, 其生物氧化过程相对延迟, 表现在0~24 h内出现微生物延滞期.通过比较可以判断, A. ferrooxidans对Na⁺的耐受浓度临界值在320~800 mmol·L^-1之间, 完全抑制的浓度阈值还有待进一步考察.

由图 5可知, 当酸性体系pH和Fe²⁺浓度一定时, 若A. ferrooxidans活性未受到抑制, 则Fe/Na摩尔比在0.5~2.0范围内时对体系总Fe浓度的变化影响较小.这与K⁺存在较大差异, 柏双友等(2010)发现, 在Fe²⁺浓度为80 mmol·L^-1时, Fe/K摩尔比在25~200之间均能够促使约31%的总Fe以次生铁矿物的形式沉淀去除, 当提高K⁺浓度至Fe/K=10时, 经生物反应72 h后, 总Fe累积沉淀率超过40%.另外, 160、80、20 mmol·L^-1 Fe²⁺体系的总Fe浓度分别在72、48、48 h时趋于稳定, 至培养终点时平均总Fe沉淀率分别为20.04%、16.43%、0.99%.由此易知, 初始Fe²⁺浓度越高, Fe³⁺供应速率越快, 越有利于体系总Fe的沉淀去除.根据Fe³⁺供应速率v=(x₂－x₁)/(t₂－t₁)(式中, x₁表示t₁时间的Fe³⁺浓度, x₂表示t₂时间的Fe³⁺浓度)可以算出, 在Fe²⁺被完全氧化时间节点内, 160、80、20 mmol·L^-1体系对应的Fe³⁺供应速率分别为2.22、1.67、0.42 mmol·L^-1·h^-1, 这也为上述现象提供了合理的解释.进一步分析表明, 总Fe沉淀率的变化趋势与体系Fe²⁺的氧化过程基本一致, 说明Fe³⁺的水解过程可能伴随着Fe²⁺的生物氧化才能进行, 一旦Fe²⁺氧化完全, 则次生铁矿物的合成也随即终止, 其机理有待进一步研究.

3.5 矿物质量比较

除了总Fe浓度变化能够表征酸性体系总Fe沉淀去除效果外, 次生铁矿物质量可以更直观地反映A. ferrooxidans生物氧化成矿效果.如图 6所示, 收集矿物质量随着初始pH的降低而出现减少的现象, 这与次生铁矿物的特性有一定的关系.由图 3可知, Na⁺成矾能力较弱, 各处理产物以施氏矿物居多, 而施氏矿物为典型的球形海胆结构, 易于溶质扩散和矿物溶解(Dold, 2003；Loan et al., 2005；李浙英等, 2011).刘奋武等(2013)在酸性环境下考察了施氏矿物的稳定性, 结果表明, pH体系从3.0下调至2.0后, 施氏矿物在72 h内的溶解率从3.34%猛增至61.46%.依此可以推断, 要使得总Fe沉淀率提高, 对反应体系pH的适当调控至关重要.

另外, 从初始Fe²⁺浓度角度来看, 提高Fe²⁺浓度有助于矿物的大量合成, 这与图 5结果相吻合.但从Fe/Na摩尔比方面分析, 会发现图 5与图 6之间存在“矛盾”.前已述及, Fe/Na摩尔比在0.5~2.0范围内时对体系总Fe浓度的影响较小, 总Fe沉淀率曲线基本重合.而由图 6则发现在Fe/Na=0.5时能够获取更多的次生铁矿物, 随着Na⁺浓度减少而呈下降趋势.分析认为, 这与次生铁矿物的合成行为具有一定的关系, 由图 3可知, 当Fe/Na ≥0.5时, 收集矿物开始出现黄钠铁矾衍射峰.而从反应式(2)、(3)来看, 若次生铁矿物按反应式(2)或(3)单独进行时, 则单位Fe³⁺所合成纯黄铁矾质量应为纯施氏矿物的1.5倍以上, 这也为次生铁矿物产量的增加提供了可能.综上, 虽然Na⁺成矾能力较弱, 其浓度变化对酸性体系总Fe沉淀去除效果“贡献”较小, 但适量的Na⁺仍有助于生物成因次生铁矿物的合成.根据反应式(3)可知, Na⁺的介入可促使酸性硫酸盐环境体系中更多SO₄^2-以次生铁矿物的形式去除.

4 结论(Conclusions)

1) Na⁺浓度在A. ferrooxidans耐受范围内时, 其不影响Fe²⁺氧化及总Fe沉淀去除效果.160、80、20 mmol·L^-1的Fe²⁺分别在72、48、48 h内被完全氧化, 培养终点时平均总Fe沉淀率分别为20.04%、16.43%、0.99%.

2) 在Fe²⁺浓度160 mmol·L^-1体系中, 当Fe/Na摩尔比为1.0、2.0时, pH在2.0~2.6范围内合成次生铁矿物均为纯净施氏矿物.当Na⁺浓度提高至320 mmol·L^-1时(Fe/Na=0.5), 次生铁矿物的合成途径开始向黄钠铁矾转变, 且其特征衍射峰随着Na⁺浓度继续提高表现地愈加明显.