2018, Vol. 38
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2. 清华大学环境与健康传感技术研究中心, 北京 100084
2. Center for Sensor Technology of Environment and Health, Tsinghua University, Beijing 100084
世界范围内开发利用核能在惠及人类的同时, 也带来了核污染的威胁(汪永平等, 2005), 近些年来世界范围内发生了多起严重核泄漏事件, 诸如1986年的切尔诺贝利核灾难及2011年日本福岛核电站爆炸事件等(杨新兴等, 2015), 这些都给当地及周围的人民生活和生态环境带来了巨大的放射性污染.另外, 铀矿开采引发的污染及事故也是重要的环境安全问题, 据统计, 每生产1 t金属铀, 会产生至少900 t的放射性废物(郝卿, 2013).我国的铀矿资源丰富, 主要集中在湘、粤、赣、桂等地, 这些地区是河流密集区域(许冬梅, 2009; 徐磊等, 2013).相关文献报道, 世界河流中铀的平均浓度为1.3 nmol·L-1, 对于流经矿区的河流中铀的浓度通常会达到10 nmol·L-1以上, 甚至更高, 给当地生态环境带来了潜在的放射性污染威胁(Palmer et al., 1993).
天然水体中铀主要是以四价及六价铀的化合物形式存在, 在水中形成铀离子、铀酰离子等, 并主要以铀酰离子的形式存在(李希村等, 1963).目前世界卫生组织、澳大利亚和加拿大已明确将铀列为优先控制的环境污染物(周斌, 2012).针对铀的检测技术手段有标准方法中的固体荧光法、分光光度法等(陈维国等, 1986), 也有放射性检测、离子色谱法、电感耦合等离子体质谱法及原子吸收光谱法等(Hou et al., 2008; Abbasi, 1989; Lorber et al., 1996; Gonzalez et al., 2008; Rani et al., 2013; Shaw et al., 2000; Shaw et al., 2004), 这些方法都是采用实验室分析条件并利用大型分析仪器来完成, 难以满足铀的高通量快速筛查及环境突发事件现场快速检测的需要, 因此, 亟待开发基于新原理的铀快速检测技术.
生物传感器是一类以生物功能材料作为敏感识别元件并结合换能元件构成的检测仪器, 其响应速度快, 操作简单, 可实现现场快速检测, 并且成本相对低廉, 是当前诸多领域的研发及应用热点(Rechnitz, 1987; 雷梓阁, 2015).2007年, 美国伊利诺伊大学香槟分校的Lu Yi研究组利用SELEX技术筛选出能与铀酰离子发生作用的脱氧核酶, 该脱氧核酶由底物链和酶链组成, 在铀酰离子存在的条件下会发生酶切反应(Liu et al., 2007).基于该成果, 科研人员研究构建出了一些生物传感器检测铀酰离子.但这些方法大都存在稳定性不佳及检测时间偏长等问题, 难以满足现场快速检测的需要(Lee et al., 2008; Jiang et al., 2013; Zhang et al., 2015; Zhang et al., 2016; Tang et al., 2013).本研究以铀酰离子为研究对象, 利用脱氧核酶的特异性催化反应, 结合本课题组自主研制开发的倏逝波光纤生物传感器, 研究建立可快速、灵敏、便捷检测铀酰离子的新方法, 以期为环境水体中铀酰离子的检测提供技术支撑.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 仪器与试剂仪器：倏逝波全光纤生物传感器(课题组自主研制)、日立CF16RXⅡ离心机、HCH-300经济型恒温金属浴、历元纯水仪、梅特勒pH计、梅特勒微量天平、三洋低温冰箱、Eppendorf移液枪、康宁Axygen离心管、超净工作台、烘箱、600 μm光纤(自主设计加工)、光纤耦合胶、黑漆.
其中, 倏逝波全光纤生物传感器是依据本课题组的专利技术《全光纤倏逝波生物传感器》(公开号：CN1873450A)进行开发.该仪器主要包含激光发射单元、激光传输及荧光接收光路单元、样品流路单元、荧光采集装置单元及数据处理装置单元等几个模块.脉冲激光器发射出激光, 通过光纤连接器进入到光纤探头中, 在光纤探头的表面形成倏逝场, 倏逝波激发修饰在光纤探头表面标记有荧光基团的功能核酸从而发射出荧光, 部分荧光通过光纤探头进入光纤连接器, 在光纤连接器的多模光纤一端射回.收集得到的荧光经过滤光片滤除后, 绝大部分荧光经光电二极管的探测将光学信号转换成为电学信号, 电学信号经由锁相放大器放大后由计算机进行相关数据分析, 其具体的结构与构造如图 1所示.
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| 图 1 全光纤倏逝波仪结构原理图(a)与实物图(b) Fig. 1 Schematic (a) and pictures (b) of evanescent wave all-fiber optical biosensor platform |
试剂：2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(英文简称MES)购自麦克林试剂公司, 纯度为99.5%;醋酸酰铀为优级纯; 氯化钠、氯化镁、氯化锰、氯化铬均购自麦克林试剂公司, 均为优级纯; 铜、铅、汞、砷(Ⅴ)标准液(100 μg·mL-1)由国家有色金属及电子材料分析测试中心提供; 氯化铁、硫酸钛购自国药化学试剂公司, 均为分析纯; 氢氟酸、10×PBS缓冲液、无水甲苯、无水乙醇、十二烷基硫酸钠、浓硫酸、浓硝酸、氢氧化钠购自北京化工厂, 均为分析纯; 3-氨丙基三乙氧基硅烷(英文简称APTES)购自Sigma, 纯度99%;戊二醛(英文简称GA)购自Sigma, 纯度99%;甘氨酸购自Sigma, 纯度99%.
底物链DNA序列为：5′-Cy5.5-ACTCACTAT rA GGAAGAGATG -BHQ2-3′, 以下简称为SDNA; 酶链DNA序列为：5′-CATCTCTTCAGTCGGGTAGTTAAAC CGACCTTCAGACATAGTGAGT-BHQ3-3′, 以下简称为EDNA; 光纤修饰DNA序列为：5′-NH2C6-TTTTTTATAGTGAGT-3′, 以下简称为XS-DNA.以上核酸为自行设计, 均由上海生工生物工程公司合成, 所有序列均为HPLC纯, 其中, Cy5.5为荧光基团, BHQ2及BHQ3均为淬灭基团.
2.2 缓冲溶液及标准溶液配制MES缓冲液：3.9 g MES, 7.02 g NaCl, 400 mL高纯水, NaOH溶液调pH至5.5, 缓冲液的各项参数为：MES 50 mmol·L-1, NaCl 300 mmol·L-1, pH=5.5.
铀酰离子标准溶液：醋酸酰铀溶于10 mmol·L-1稀硝酸制得, 浓度分别为0、5、10、15、20、25、50、75、100、125、250、375、500 nmol·L-1.
2.3 实验原理和设计本研究设计开发了一种两步法的反应策略, 即“均相反应, 固相杂交”的检测方案, 在实验中, 首先在液相中完成铀酰离子与脱氧核酶的酶切反应, 释放出一条带有荧光基团标记的DNA短链, 然后将混合液通入光纤倏逝波生物传感器中, 依据碱基互补配对原则, 光纤表面的核酸探针捕获上述混合体系中的荧光标记DNA单链, 完成信号的收集与放大, 整个检测过程实现了将对于铀酰离子的检测转变为对于单链DNA的检测, 实验原理设计如图 2所示.这种检测策略有以下两点突出优势：①脱氧核酶与铀酰离子在均相中完成反应, 大大缩短了检测时间; ②将反应过程与杂交过程彼此分离开, 便于实现调控与优化条件.
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| 图 2 UO22+两步法检测策略示意图 Fig. 2 Scheme of the two-step strategy for the detection of UO22+ |
实验中所用的石英玻璃光纤由内至外是由纤芯、包层、涂覆层及套塑层所构成, 前处理过程中首先使用刀片将光纤表面的套塑层与涂覆层刮除掉5 cm左右, 使其露出一端的包层, 将上述光纤包层露出端及与该包层露出端连接的一段涂覆层一同垂直插入30%(质量分数)氢氟酸刻蚀, 经过反应获得锥形光纤探头, 结构如图 3所示.
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| 图 3 经前处理后的光纤结构示意图 Fig. 3 Structure of the optical fiber handled and modified |
光纤表面修饰及功能核酸进行固定化的过程分为以下几个步骤, 其整个过程的反应原理如图 4所示.①光纤表面羟基活化：首先配制piraha溶液(浓H2SO4：30% H2O2(V/V)=3：1, 9 mL浓硫酸, 3 mL过氧化氢), 将光纤浸入其中, 在烘箱中加热(100~120 ℃)60 min(反应原理为：H2SO4 + H2O2＝H3O+ + HSO4-+ O); 然后用超纯水清洗, 直至清洗液pH值呈中性, 氮气吹干后将其置于干燥箱中70 ℃过夜.②光纤表面硅烷化：先从烘箱中取出光纤比色管, 在干燥器中放至室温, 用无水甲苯配制2%(体积比)APTES溶液, 并将光纤放入该溶液中室温反应1 h; 然后将甲苯洗光纤3次, 乙醇洗光纤3次, 并吹干, 烘箱中200 ℃烘干30 min.③光纤表面偶联化：先加入2.5%戊二醛水溶液(1 mL 25%戊二醛+9 mL超纯水), 室温条件下反应1 h; 然后用超纯水充分清洗, 氮气吹干.④功能核酸的固定化：将光纤浸泡在200 nmol·L-1 XS-DNA的1×PBS溶液中(pH=7.4), 4 ℃过夜.⑤光纤表面封闭处理：将光纤浸泡在封闭剂中进行封闭, 规定时间后取出, 用超纯水进行充分清洗, 在室温下用氮气吹干, 4 ℃干燥环境中保存备用.
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| 图 4 功能核酸固定化步骤流程图 Fig. 4 Schematic diagram for the surface modification of optical fiber |
在前期研究工作中确定的最优反应条件下(底物链SDNA与酶链EDNA的比例为1：2, 底物链SDNA浓度为100 nmol·L-1, 均相反应时间为6 min)(李弘杨等, 2017), 选取0、5、10、20、40、60、80、100、200、300、400 nmol·L-1共11个不同浓度的铀酰离子与脱氧核酶反应, 之后通入光纤倏逝波仪记录荧光信号强度的异同, 具体的反应步骤如下所示：①取10 μL SDNA与20 μL EDNA混合, 加入1970 μL缓冲液至2000 μL, 此时SDNA为500 nmol·L-1, EDNA为1000 nmol·L-1; ②将上述混合物加热至90 ℃保持3 min, 自然冷却至室温; ③取60 μL混合物与240 μL UO22+标准液混合, 放入0.5 mL离心管中混合, 终浓度SDNA为100 nmol·L-1, EDNA为200 nmol·L-1, 反应6 min; ④在光纤仪上预先设定进样程序, 将上述反应后的混合液泵入光纤仪进行检测, 记录荧光信号随铀酰离子浓度的变化, 每个浓度重复3次.
2.6 选择性测试选取As5+、Ca2+、Cd2+、Cu2+、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Pb2+、Fe3+、Ti4+等10种金属离子进行选择性测试, 并设置空白对照, 实验中, UO22+的浓度设置为100 nmol·L-1, 干扰金属离子的浓度设置为10 μmol·L-1 (100倍于铀酰离子的浓度), 具体的实验步骤如下所示：①配制各种离子的标准液, 称取一定质量标准物质或量取一定体积标准溶液, 使用缓冲液进行溶解, 将其配制成浓度为12.5 μmol·L-1的标准液(与DNA溶液混合后浓度为10 μmol·L-1); ②参照2.5节的实验步骤, 记录加入不同类型的金属离子时体系荧光强度的变化, 每种类型每种浓度的金属离子重复3次.
2.7 重复性测试固定好功能核酸的传感光纤必须实现可多次使用, 只有这样本研究建立的检测方法才具有应用价值.因而, 有必要通过连续的重复试验考察光纤的信号重复再生性能.实验中, 参照2.5节的实验步骤, 利用100 nmol·L-1 UO22+与脱氧核酶体系反应100次, 通入倏逝波光纤传感器中测量信号变化.
2.8 实际水样测试实验中, 参照2.5节的实验步骤, 选取丹江口水库水进行实际水样加标回收实验, 使用实际水样分别配制40、80、160、200 nmol·L-1的UO22+标准液.为保证离子强度不变, 所用缓冲液中MES与NaCl的浓度均提高1倍, DNA样品与水样按1：1比例混合(与DNA溶液混合后UO22+的终浓度依次为20、40、80、100 nmol·L-1), 记录各个浓度样品加入后并通入光纤仪后信号的变化, 每个浓度均重复3次.
3 结果与讨论(Results and analysis) 3.1 铀酰离子两步法检测策略的实现根据两步法的反应策略, 首先在缓冲体系中完成底物链SDNA与酶链EDNA的杂交互补, 加入一定浓度的UO22+标准液, 控制酶切反应时间为6 min, 将上述混合液经由蠕动泵通入倏逝波光纤传感器中, 荧光信号随着混合液体的进入开始发生变化, 结果如图 5所示.根据图 5中的内容, 可将整个反应流程细化分为两个部分, 分别是固相捕获杂交过程Ⅰ(图中①~②之间的反应过程)和活化过程Ⅱ(图中②~③, 以及③之后的反应过程).
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| 图 5 两步法检测铀酰离子的典型信号变化图 Fig. 5 Exemplary fluorescence intensity profile for two-step strategy of the UO22+ detection |
固相捕获杂交过程Ⅰ：酶切反应结束后, 液相体系中存在大量的带有Cy5.5荧光基团标记的DNA短链, 当将混合液通入倏逝波光纤传感器后(图中第①点), 光纤表面核酸探针(XS-DNA)捕获Cy5.5标记的荧光DNA短链, 信号出现较为明显的升高, 当信号值升到第②点附近时, 达到一个相对平衡的状态, 信号值上升幅度明显减小, 此时记录荧光值.
活化过程Ⅱ：当倏逝波光纤传感器的信号值达到平衡后, 上升幅度明显减小, 此时为了将光纤表面由核酸探针及荧光单链形成的双链体系解链, 向体系中泵入0.5%(质量分数)SDS溶液进行洗脱活化(图中第②点).SDS溶液作为阴离子表面活性剂, 可以与双链DNA体系发生较为强烈的静电作用, 导致双链DNA变性, 彼此分离.刚刚通入SDS溶液时, 荧光信号会有一个明显的下降, 随着时间的增加, 信号下降幅度减小.此时通入缓冲液进行冲洗(图中第③点), 随着光纤体系中SDS的减少, 荧光强度进一步下降, 并趋于稳定, 此时进行下一组实验.
3.2 检测限与线性范围的确定为了确定基于脱氧核酶体系的光纤倏逝波生物传感技术方法的检测性能, 向光纤传感器中通入0~400 nmol·L-1共11个浓度的铀酰离子, 考察检测方法的线性范围与检测限.如图 6所示, 随着UO22+浓度的不断升高, 体系的荧光信号值越来越强, 这表示该检测方法是一个“turn on”型检测模式.从图 6中可以看到不同浓度的铀酰离子与脱氧核酶反应结束通入光纤仪后, 光纤表面核酸探针捕获荧光短链的时间基本相同, 维持在300 s左右, 活化的时间为250 s左右, 整个固相检测用时为600 s, 约为10 min.根据之前的研究, 液相中铀酰离子与脱氧核酶的反应时间为6 min, 因而整个检测过程仅需16 min即可完成.
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| 图 6 倏逝波光纤传感器检测不同浓度UO22+对应的特性曲线 Fig. 6 Temporal fluorescence responses in the presence of UO22+ at different concentrations with optical fiber evanescent wave biosensor |
为了更加清晰地得到荧光强度的变化规律, 将图 6中的各个铀酰离子浓度对应的荧光强度整理做成曲线图, 如图 7所示, 当铀酰离子浓度增长超过100 nmol·L-1时, 荧光强度增长的幅度明显减小, 逐渐趋于不变.铀酰离子的浓度在0~100 nmol·L-1之间有一个较好的线性区间, 将UO22+在0~100 nmol·L-1之间的浓度值与其对应的荧光强度数据进行线性拟合, 拟合方程为：y=1.965x+40.785, R2=0.9821, 根据基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差的方法确定检测限为0.5 nmol·L-1.
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| 图 7 本研究开发的检测方法的校正曲线(a)及铀酰离子低浓度范围内的线性拟合曲线(b) Fig. 7 Calibration curve of this detection method(a) and linear plot in low concentration range of UO22+ (b) |
本研究使用的脱氧核酶是由底物结合臂及催化序列两部分所组成, 底物结合臂通过碱基互补配对原则与底物进行结合, 在铀酰离子的作用下, DNA通过正确的方式进行折叠以保证中间过渡态的稳定, 进而形成催化活性中心, 底物链DNA与酶链DNA由于其所带负电荷被金属离子的正电荷屏蔽进而更加充分的结合, 随后底物链在定点处发生切割断裂, 完成酶切催化反应过程.
为了考察其他金属离子对于该检测方法的响应情况, 选取了As5+、Ca2+、Cd2+、Cu2+、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Pb2+、Fe3+、Ti4+ 10种金属离子进行选择性测试, 以确保该检测方法对于铀酰离子的特异性识别与检测.实验中设置铀酰离子的浓度为100 nmol·L-1, 干扰金属离子浓度为10 μmol·L-1(100倍于铀酰离子的浓度), 并设置不添加任何金属离子及铀酰离子的空白试验作为对照, 实验结果如图 8所示.从图中可以看出, 在干扰金属离子的浓度100倍于铀酰离子浓度的条件下, 相比于铀酰离子的响应信号, 该检测技术对于其他金属离子的响应十分微弱, 能够保证对于铀酰离子的特异识别与检测.
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| 图 8 本研究开发的检测方法选择性测试结果 Fig. 8 Selectivity tests of this detection method |
实验中, 利用100 nmol·L-1 UO22+与脱氧核酶体系反应, 将混合液通入倏逝波光纤传感器中, 重复100次, 记录荧光强度的变化, 实验结果如图 9所示.从图中可以看出, 光纤使用100次以上, 信号不会出现明显衰减, 能够达到检测的需求.
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| 图 9 本研究开发的检测方法重复性测试结果 Fig. 9 Repetitive tests of this detection method |
为了评价本研究中建立的方法对于检测环境水样的适用性, 选取了丹江口水库水进行了实际水样加标回收实验, 结果如表 1所示.丹江口水库水中的加标回收率为91.6%~94.6%, 相对标准偏差最大为2.1%.这表明本研究所建立的方法适用于水质较好的水源水的检测, 具有较好的环境水样适用性.
| 表 1 实际水样分析结果 Table 1 Detection of UO22+ spiked in water samples |
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1) 通过光纤表面羟基化、硅烷化及戊二醛偶联法的功能核酸修饰固定方法, 成功制备了可用于全光纤倏逝波仪器的脱氧核酶传感光纤.
2) 本研究设计了“均相反应, 固相杂交”的两步法铀酰离子脱氧核酶传感检测策略, 成功实现了利用光纤倏逝波生物传感器对于铀酰离子的检测, 整个检测过程仅需16 min即可完成, 对于铀酰离子的检测限低至0.5 nmol·L-1, 铀酰离子浓度在5~100 nmol·L-1之间有一个较好线性区间; 铅和汞等10种金属离子对于本检测方法无明显干扰, 该检测技术方法能够保证对于铀酰离子的特异识别与检测, 表现出了对于铀酰离子的良好选择性.
3) 传感光纤可重复使用100次以上, 不会有信号的明显衰减, 可有效降低检测成本.
4) 本研究成功实现了铀酰离子在环境水样中加标回收的检测, 在丹江口水库水样的加标回收率为91.6%~94.6%, 说明该方法具有较好的环境水样检测的适用性.
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