2018, Vol. 38
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厌氧发酵技术不但能降低环境污染, 更能提供清洁能源, 目前已被广泛应用到实际生产中(甘荣等, 2017).木质纤维素结构复杂, 不利于微生物的附着, 导致其降解率低、厌氧消化时间长、易出现漂浮分层、池内结壳等问题, 因此, 在厌氧发酵前必须对其进行预处理(袁旭峰等, 2011).物理预处理是一种应用普遍、使用方便、综合投入低的预处理方式(辛岳凤, 2016).超声波预处理是物理预处理方式的一种, 能量输入是影响超声波预处理效果的主要因素, 适宜应用到厌氧发酵预处理中的能量输入范围在1000~16000 kJ·kg-1(以TS计)之间(Carrere et al., 2016).研究发现, 超声波预处理能量输入受预处理时间和预处理功率的影响, 单位能量输入在31~93 Wh·L-1之间时, 底物降解率能提高22%~53%, 甲烷产量能提高46%~71%(Cesaro et al., 2014).预处理的目的是与CK(未经预处理)相比能显著提高产气量, 尽管大量研究结果表明超声波预处理能够提高厌氧发酵产气量, 但超声波预处理是一种能量输入的预处理方式.若以CK的净能量产出为基础, 将处理组的净能量产出与CK的净能量产出的差值用能量效益表示(Zou et al., 2016b), 则能量效益的单位为kJ·kg-1 (以TS计).研究证实, 能量效益可以作为衡量超声波是否适宜对发酵原料进行预处理的标准, 但超声波预处理组的净能量产出是否大于CK(能量效益是否大于零)目前仍存在争议(Mottet et al., 2009), 因此, 研究厌氧发酵后的净能量产出和能量效益是十分必要的.
研究表明, 发酵初始底物中的C/N比(白杰等, 2015)、木质纤维素(范晓娟, 2013)、挥发性干物质(李靖等, 2012)对厌氧发酵会产生影响; 发酵过程中铵态氮、碱度、VFA(挥发性脂肪酸)含量、pH与日产气量有一定关系(邢杰等, 2014).但目前对于发酵过程中环境因素变化趋势的研究较多, 对于发酵环境对产气量影响大小排序及环境之间的相关性强弱研究较少.
为了弥补上述研究中存在的不足, 本研究将牛粪和玉米秸秆超声波预处理后进行混料厌氧发酵, 测定发酵初始环境和发酵过程环境中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH, 利用通径分析研究发酵初始环境对总甲烷产量的影响, 利用因子分析研究发酵过程环境与日产气量之间的关系.同时, 以总甲烷产量为目标, 利用响应面优化超声波预处理条件, 研究超声波预处理后的能量效益问题.旨在从发酵初始环境和发酵过程环境的角度探讨厌氧发酵甲烷产量提高的机理, 并且从能量效益方面分析超声波预处理是否适宜应用到厌氧发酵原料预处理中.以期为以后的科学研究提供基础数据, 并且为实际生产提供工艺参数.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料玉米秸秆采用当季收货后自然风干的最新秸秆, 新鲜牛粪来源于奶牛养殖场.玉米秸秆用9Z-2.5秸秆粉碎机粉粹成1~2 cm长的小段备用.沼液取自陕西省杨凌区西北农林科技大学沼气示范村沼气池, 取时将其摇匀.原料和沼液的基本性质如表 1所示.
| 表 1 玉米秸秆、牛粪及沼液的性质 Table 1 Characteristics of raw materials and inoculum |
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中心组合试验设计是一种数学分析方法, 因可用来分析变量之间的相互关系而被广泛应用(Varesio et al., 1997).中心组合试验设计可以将每个因素分为两个子集, 一个用于评估自变量和因变量之间简单的线性关系, 另一个用于分析因素间的交互作用.因此, 中心组合试验设计可以展现丰富的因素和误差信息(Varesio et al., 1997).本文利用中心组合试验设计, 设计两因素(牛粪及玉米秸秆超声波预处理时间)三水平实验, 预处理时间均为0~40 min.具体试验设计结果如表 2所示.
| 表 2 中心组合试验设计结果 Table 2 Coded values in the central composite design |
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超声波预处理频率和处理功率分别为40 kHz和0.20 kW, 时间设定按照中心组合实验设计的结果进行.具体做法为：准备3份牛粪, 每份1 kg, 将3份牛粪分别放入3个2 L的烧杯中, 之后将3个烧杯依次放入超声波槽中进行连续超声波预处理, 3个烧杯的预处理时间分别为0、20和40 min.在玉米秸秆中加入一定的纯净水, 使玉米秸秆的含水量与牛粪的含水量相同, 搅拌均匀备用, 之后称取1 kg混合均匀的玉米秸秆进行超声波预处理, 预处理方法与牛粪相同.
超声波预处理能量密度的计算公式为：
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(1) |
式中, P、t、m和TS0分别是预处理功率(kW)、预处理时间(min)、预处理质量(kg)和预处理物质的干物质含量, 本文取值分别为P=0.2 kW, t=0、20和40 min, m=1 kg, TS0=22%;Es为超声波能量输入密度(kJ·kg-1).各处理中牛粪或玉米秸秆的能量输入为：
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(2) |
式中, Et为总能量输入(kJ), TS为各处理中牛粪或玉米秸秆的干物质量, 取值为28 g.
超声波预处理能量输入密度及各处理总能量输入如表 3所示.利用IBM SPSS软件(Version 21, IBM Inc., 2012)对数据进行方差分析, Design Expert Software (Version 8.0, Stat-Ease Inc., US)软件对中心组合实验设计和相面优化利用进行设计和分析.
| 表 3 超声波预处理能量密度及能量输入值 Table 3 Power intensity and power density of ultrasonic pretreatment |
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将超声波预处理后的玉米秸秆与预处理后的牛粪按照干物质量1:1的比例进行混合, 并取适量混合物质, 使其干物质量为56 g, 放入1 L的三角瓶中, 然后加入200 g沼液, 再加入一定量的纯净水使三角瓶中物质的总质量为700 g, 保持发酵瓶中的干物质为8%, 最后将其放入温度为(35±2) ℃的水浴槽中厌氧发酵42 d.期间每6 d取样测定纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量及pH.取样前先测定甲烷含量和产气量, 之后将发酵罐轻轻摇匀.具体取样过程为：打开厌氧发酵罐的盖子, 迅速用抽拉式液体取样器取10 mL沼液放入离心管中, 立刻盖上离心管的盖子并放入冰箱待测, 以避免氧气进入发生反应.之后将氮气充入厌氧发酵罐, 赶走空气, 立刻盖上厌氧发酵罐.设置空白试验(700 g沼液厌氧发酵组), 每组试验设置3个平行试验.具体发酵装置如图 1所示.
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| 图 1 厌氧发酵装置 (1.温控箱; 2.控温传感器; 3.保温盖; 4.保温层; 5.加热丝; 6.发酵瓶; 7.取样口; 8.导气管; 9.取气口; 10.导水管; 11.导气管; 12.排气口; 13.储气瓶; 14.储水瓶; 恒温箱中3个三角瓶表示每个处理进行3次重复) Fig. 1 Anaerobic digestion device |
采用烘干法测定总固体(TS)、挥发性固体(VS)含量, 采用比色法测定挥发性脂肪酸(VFA)含量(Zou et al., 2016a), 采用排水集气法测定日产气量, 使用ZS-2型沼气气体成分分析仪测定甲烷成分, 采用智能pH计(pHs-3CT型)测定发酵环境中的pH值, 利用DNS比色法测定还原糖含量(陈毓荃, 2002).利用DNS法对纤维素酶活力进行测定, 具体方法为：将1 mL沼液加入到3 mL 0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中, 50 ℃水浴中水浴30 min, 到时间后沸水浴10 min, 最后测定其还原性糖含量.沼液每分钟从0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中释放1 μmoL还原糖所需要的酶量为一个活力单位(IU·mL-1)(Zou et al., 2016a).
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 超声波预处理对发酵初始环境的影响CK发酵初始环境中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值分别为3.92 IU·mL-1、11.20 mg·mL-1、414 mg·L-1和7.7.MS20DM40处理组发酵初始环境中纤维素酶活力最大, 为4.80 IU·mL-1, 高于CK; MS20DM20处理组纤维素酶活力最低, 为2.18 IU·mL-1, 低于CK(图 2a).超声波预处理使发酵初始环境中纤维素酶活力升高或者降低, 分析可能的原因为：超声波预处理使木质纤维素结构变得疏松, 使得酶能与底物更好地结合, 从而加快了降解效率(刘妙莲等, 2000).超声波预处理厌氧发酵底物时, 低频率声波(< 100 kHz)效果更好(Portenlänger et al., 1997), 这是因为超声波低频率的预处理是以机械振荡的方式破碎物质中的絮状沉淀、菌胶团甚至细胞结构, 从而释放物质中的有机物, 使其更容易被厌氧微生物利用(贾舒婷等, 2012).因此, 超声波预处理后, MS0DM20处理组还原性糖含量最高, 为28.12 mg·mL-1, MS40DM20处理组的VFA含量最高, 为552 mg·L-1, 均高于CK(图 1b、c); 但随着超声波能量输入的增加, 空化作用加剧会使还原性糖和VFA分子分解, 从而降低其还原性糖含量和VFA含量(图 2b、c).另外, 超声波预处理会降低发酵初始环境中的pH值, 可能的原因是超声波预处理使牛粪和玉米秸秆中的酸性物质溶出, 从而降低pH(图 2d).
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| 图 2 超声波预处理对发酵初始环境的影响 (a.纤维素酶活力, b.还原性糖含量, c.VFA含量, d.pH值; 小写字母均不同表示差异显著) Fig. 2 Effect of ultrasonic pretreatment on fermentation initial environment (a.cellulase activity, b.reducing sugar content, c.VFA content, d.pH) |
超声波预处理对厌氧发酵初期的纤维素酶活力和还原性糖含量影响较大, 这是因为超声波预处理使发酵初始环境中纤维素酶活力和还原性糖含量出现没有规律的变化(图 2), 进而导致其在厌氧发酵过程中的启动出现无规律的现象(图 3).另外, 发酵初期的纤维素酶活力和还原性糖含量相对较高, 这是因为发酵初期纤维素含量高, 需要大量的纤维素酶加速底物分解, 纤维素酶活力提高之后, 生成更多的还原性糖, 因此, 还原性糖含量升高.随着反应的进行, 产生的还原性糖因被分解为甲烷和二氧化碳而含量降低.之后厌氧发酵系统稳定, 纤维素酶分解纤维素产生的还原性糖含量与分解速度趋于同步使其含量保持稳定, 相应地, 纤维素酶活力也保持稳定.因此, 至发酵24 d后纤维素酶活力和还原性糖含量的变化趋势基本一致.
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| 图 3 发酵过程环境中纤维素酶活力(a)、还原性糖含量(b)、VFA含量(c)和pH值(d)变化趋势 Fig. 3 The trend of cellulase activity(a), reducing sugar content(b), VFA content(c) and pH(d) in digestion process environment |
CK中pH最小值出现在厌氧发酵的第12 d, 为6.5, DM0MS20和DM20MS40处理组pH的最小值出现在厌氧发酵的第6 d, 比CK提前, 其他处理组pH值最小值出现的时间均与CK相同.适宜的超声波预处理使发酵初始环境中纤维素酶活力增加, 从而加速厌氧发酵的启动, 导致大分子物质提前分解成小分子酸性物质, 从而使pH提前降低(Apul et al., 2010), 提前进入产酸阶段.进入产酸阶段后, VFA含量升高, pH降低, 随着发酵的进行VFA被消耗而pH升高(楚莉莉等, 2011).超声波预处理使发酵过程中VFA含量和pH值变化趋势发生改变, CK中VFA含量在第6 d出现峰值后呈下降趋势, 无第2峰值出现, 而超声波预处理后的处理中均出现不同程度的波动上升趋势, 出现第2个峰值, 且CK中的pH在厌氧发酵的第30 d达到最大值, 且保持稳定, 其他处理组的pH值均在发酵结束时达到最大值.
3.3 发酵过程中环境因素的相互关系因子分析可以探究日产气量与发酵过程中环境因子之间的关系(Zou et al., 2016a).因子分析中总方差分析结果表明, 各处理均能用两个公因子(因子1和因子2)解释纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值80%以上的信息(总方差分析表略).因子载荷矩阵系数可用于表示因子对指标的依赖程度, 绝对值越大, 说明因子对指标的依赖程度越大, 同时也表示因子对指标的重要性.通俗的讲, 较大的因子载荷系数在哪个因子下, 那个因子就可以概括这个指标的信息(Muthén, 1978).由表 4可知, CK中因子1由VFA含量和pH值决定, 因子2由纤维素酶活力和还原性糖含量决定, 超声波预处理后各处理发酵过程中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值对产气量均有一定的决定作用.
| 表 4 因子载荷矩阵 Table 4 Factor Pattern matrix |
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因子得分越高, 因子的影响力越大(O′Rourke et al., 2013).表 5显示, 在CK中, 发酵初始环境、发酵第6、12、18、24和30 d的因子2得分较高, 结合表 4进行分析说明, 该发酵阶段中纤维素酶活力和还原性糖含量对日产气量的影响力较大, 而第36和42 d VFA含量和pH对日产气量的影响力较大.综合分析表明, 相同发酵阶段中, 不同超声波预处理条件下因子1和因子2的得分不同(表 5), 即超声波预处理对发酵过程中日产气量的主要影响因素产生影响, 如MS20DM20处理在发酵初始状态和发酵结束时受纤维素酶活力和pH值的影响较大, 其他阶段受还原性糖含量和VFA含量的影响较大, 这与CK和其他处理组不同.厌氧发酵系统是一个封闭的发酵系统, 系统中各个因素相互协调使发酵顺利进行(Sarker et al., 2014).超声波预处理后, 厌氧发酵各阶段的主要影响因素发生改变, 这种改变相互协调、相互促进, 使厌氧发酵系统更加稳定, 从而提高厌氧发酵产气量.
| 表 5 因子得分 Table 5 Scores of factors |
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牛粪与玉米秸秆混合厌氧发酵初始环境(纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH)与总沼气产量之间关系的通径分析结果表明, 发酵初始环境中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值与总产气量之间存在相互关系, 即总产气量受纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值的影响, 但影响均不显著(p > 0.05)(表 6).通径分析中, e为误差项, 表示处其他因素对总产气量的影响.e值为0.619, 说明除纤维素酶活力、还原性糖、VFA含量和pH外还存在其他因素对总产气量产生影响, 可能为纤维素含量、半纤维素含量、木质素含量(Steffen et al., 2016)、C/N比(Riya et al., 2016)、酸碱度(吕凡等, 2006), 且这些因素具有很强的决定能力, 说明发酵初始环境中影响总产气量的因素多样且复杂.
| 表 6 通径分析表 Table 6 Path coefficient analysis |
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方差分析结果表明, p值小于0.05, 说明响应面优化模型可以用来优化超声波预处理条件(方差分析略).预处理条件与总产气量之间的响应关系为：
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(3) |
式中, A表示牛粪预处理时间(min), B表示玉米秸秆预处理时间(min).公式的R2为94.36%, 说明该公式可以用来计算最大甲烷产量和预测最佳预处理工艺.优化结果(图 4)显示, 当牛粪预处理17.68 min而玉米秸秆预处理19.94 min时, 甲烷产量最高, 为177.20 L·kg-1(以TS计).之后利用相同的试验方法, 将牛粪、玉米秸秆分别预处理18、20 min后混合发酵, 产气量为175.36 L·kg-1(以TS计), 与优化结果差异不显著(p > 0.05), 进一步证明此模型可以用来对预处理条件进行优化.
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| 图 4 甲烷产量响应面优化图 Fig. 4 Response surface of total methane production |
甲烷产量与单位体积甲烷释放热量的乘积为释放的总能量, 常用的单位体积甲烷释放的热量为39820 kJ·m-3(Eze, 2012); 释放的总能量与投入的总能量(表 3)的差值为净能量产出; 以CK的净能量产出为标准(CK的能量效益为零), 处理组净能量产出与CK净能量产出的差值为能量效益.超声波预处理组的能量输出、净能量产出和能量效益如表 7所示.分析结果表明, CK的总能量输出为4203.04 kJ·kg-1(以TS计), 但因为超声波预处理存在能量输入, 虽然DM40MS40、DM20MS40和DM40MS0处理组的净能量产出分别为1809.71、3709.66和3835.07 kJ·kg-1(以TS计), 均大于零, 但其能量效益分别为-2393.33、-493.38和-367.97 kJ·kg-1(以TS计), 均小于零, 不适宜应用到实际生产中.超声波预处理虽然能提高处理组的能量输出, 但因为存在能量输入, 尽管总能量产出高, 但净能量产出不一定高.另外, 净能量产出大于零的预处理条件不一定均为适宜的超声波预处理条件, 如果该处理组的能量效益小于零也不适宜应用到实际生产中.
| 表 7 超声波预处理能量平衡分析 Table 7 Energy balance of energy input and output |
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1) 在超声波40 kHz和0.20 kW的条件下, 适宜的超声波预处理能够显著(p < 0.01)提高厌氧发酵甲烷产量; 响应面优化结果显示, 牛粪预处理17.68 min与玉米秸秆预处理19.94 min混合厌氧发酵的总甲烷产量最高, 为177.20 L·kg-1(以TS计), 显著高于CK(p < 0.05), 其能量效益也最高, 为1835.14 kJ·kg-1(以TS计).
2) 发酵初始环境中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值受超声波预处理的影响, 超声波预处理对初期发酵过程中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值的影响较大, 后期影响较小.相同发酵阶段, 不同预处理条件下产气量的主要影响因素不同.发酵初始环境中的纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH值对总产气量有直接影响, 且通过彼此对产气量产生间接影响.
3) 厌氧发酵内部系统复杂, 各因素之间相互影响而维持发酵系统的稳定.表面上超声波预处理是通过改变发酵初始环境和发酵过程环境中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量和pH来提高厌氧发酵总产气量, 统计分析后发现, 超声波预处理通过改变发酵初始环境因子之间的相互关系和发酵过程环境的主要影响因素来使发酵系统更加稳定从而提高产气量.
4) 超声波预处理需要能量输入, 高能量产出不一定同样具有高能量效益.因此, 在优化超声波预处理条件时必须对其能量效益进行分析.
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