2. 中石油北京天然气管道有限公司, 北京 100101
2. PetroChina Beijing Natural Gas Pipeline Co., Ltd., Beijing 100101
天然气管道运输属于长距离运输, 管道施工对途经地区的生态环境会造成一定影响, 尤其是对脆弱生态区的植被恢复影响明显.榆林地区天然气管道途经毛乌素沙区、晋陕黄土高原区等特殊地带区, 地质上属于典型的多层次过渡带, 生态环境脆弱.由于工程扰动严重破坏了地表植被、土壤结构、土壤质地、土壤养分、环境气候等因子及土壤微生物之间的生态平衡, 进而使得天然植被恢复较为缓慢.多年来, 随着天然气管道建设的快速发展, 在管道施工过程中尽管实施了精细的水土保持策略, 然而工程扰动地表植被恢复仍有待改善, 加之风蚀和水流侵蚀, 致使管道附近土壤退化严重.如何加强天然气管道周边生物多样性保护和生态环境建设, 已成为我国中西部地区生态环境建设的重大课题.
土壤微生物多样性代表着微生物群落的稳定性, 多样性的改变客观上反映了土壤生态机制和土壤胁迫作用对群落的影响(李香真等, 2016).研究表明, 原油管道建设会导致有机质、全氮、速效氮、速效磷含量降低, 进而直接影响植被生长、种类和数量(程金香等, 2003;许申来等, 2008;李彤等, 2017;刘秉儒等, 2013).Mekuria(2013)、杨满元等(2015)研究发现, 植物群落结构在不同的利用方式下会引起土壤理化性质发生改变, 并改变着土壤微生物的群落结构和多样性.吕浩荣等(2009)、莫江明等(2005)、张希彪等(2006)研究了对人为干扰(如农作活动、森林砍伐)对土壤理化性质、植被群落结构和微生物数量的影响, 表明人为干扰严重影响了土壤理化性质, 间接影响了植被群落结构及土壤微生物数量.因此, 土壤理化性质、植被群落及微生物数量间的生态平衡显得尤为重要.基于此, 本文对榆林北部管道施工扰动后植被恢复阶段的土壤理化性质与微生物多样性进行研究, 分析两者之间的相关性, 以期为脆弱生态环境植被恢复和生态系统重建提供参考依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 研究区概况研究区位于榆林北部黄土高原和毛乌素沙地交界处, 属于脆弱黄土坡地(海拔1161 m, 109°52′26.26″E, 38°18′16.86″N), 是黄土高原与内蒙古高原的过渡区, 天然气管道途径此地, 水土保持植被恢复已有3年之久.该地区气温低、干燥、多风, 年平均降水量为410 mm, 年平均蒸发量为2388.7 mm, 主要地貌为风沙草滩区, 以风沙土壤和黄土性土壤为主.主要植被类型为长茅草、胡枝子、猪毛蒿、阿尔泰紫菀、沙棘、苦麦菜等, 其中, 长茅草、胡枝子、猪毛蒿为优势种.
2.2 研究区植物盖度分析在扰动区和天然植被区中, 采用巢式取样法, 选取具有代表性的3个样地, 每个样地选取3个规格为1 m×1 m的样方, 采用格网数和目测相结合的方法, 分别测定和记录这两个研究区的植物盖度, 扰动区植被盖度平均为30%, 天然植被区平均为60%.
2.3 土壤样地调查及样品采集采用工程扰动区和天然植被区成对调查法, 各研究区布设3个样地, 每个样地选择3个典型地段, 按照随机和多点混合的原则采用GPS定位和“S”形取样法, 采集0~20 cm的表层土壤样品1.5 kg左右, 分别命名为YLRD(扰动区)和YLTR(天然植被区).将每份土壤样品均分为两部分, 一部分装入无菌袋子中, 冷藏, 用于土壤理化性质指标的测定;另一部分装入灭菌袋子中, 做好样本记录, 低温保存, 进行高通量测序分析.
2.4 土壤理化性质分析土壤含水率、有机质、全氮、总磷等土壤理化指标均按照《土壤农化分析》的方法进行测定(鲍士旦, 2005).采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性, 靛酚比色法测定脲酶活性, 3, 5-二硝基水杨酸比色法间接计算蔗糖酶活性(关松荫, 1983;Галстян et al., 1980).
2.5 土壤微生物基因组DNA的提取及测序参照OMEGA公司E. Z. A. N. Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取土样总DNA.以细菌16S rDNA中V3~V4区341F和805R为PCR扩增引物, 扩增土壤细菌16S rDNA部分基因.其中, 341F引物接有Barcode标签, 341F(CCCTACACGACGCTCTTCCGA TCTG(Barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAACTA CHVGGGTATCTAATCC).PCR反应程序如下:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s, 45 ℃退火20 s, 65 ℃延伸30s, 5个循环;94 ℃变性20 s, 55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 20个循环;72 ℃延伸5 min.每个样品做3个重复, 将同一样品PCR产物混合后经1.0%琼脂糖电泳检测.质量合格的PCR产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析.
2.6 生物信息学分析利用Illumina MiSeq测序平台分别对不同研究区采集的土壤样品中细菌16S rDNA V3~V4区的扩增子进行测序.将测序所得数据分别进行过滤和质量控制, 获得优质序列, 并进行生物信息学分析.将一致性大于97%的优质序列划分成可操作分类单元(OTU, Operational Taxonomic Units), 同时, 基于OTU的结果分析Alpha多样性指数(Shannon指数、Simpson指数、ACE指数和Chao1指数).
2.7 数据分析土壤理化指标所有数据均以3次平行样品的平均值±标准偏差表示;采用SPSS 20.0软件对测定数据进行统计分析和相关性分析, 并利用Origin 8.6软件进行绘图.
3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 扰动区与天然植被区土壤理化因子的分析不同研究区0~20 cm处土壤养分N、P、K及土壤有机质等因子含量如表 1所示.从表中可以看出, 管道铺设后, 土壤含水率从8.01%降低到5.12%, 降低了27.39%.全氮含量显著降低, 由0.38 g·kg-1降低到0.15 g·kg-1, 降低了39.49%, 全钾和全磷含量分别从0.09 g·kg-1和25.88 g·kg-1增加到0.12 g·kg-1和30.60 g·kg-1, 分别增加了29.97%和18.24%, 速效磷含量降低最明显, 下降了90.00%, 速效钾含量减少了42.01%;速效氮含量下降了71.59%.土壤有机质含量减少了75.63%, 过氧化氢酶、脲酶的含量分别减少了18.58%、36.28%, 蔗糖酶含量极显著降低, 减少了97.82%, 土壤pH在扰动前后均在6.8~7.0之间, 没有明显差异.说明管道施工没有影响土壤pH, 但施工扰动影响了土壤养分与肥力.
通过对细菌16S rDNA V3~V4区序列进行测序, 共获得有效Reads分别为27931和24403, 按照序列相似度大于97%的原则将其聚类成物种分类单元OTU(Operational Taxonomic Units).扰动区域和天然植被区细菌的OTU数分别为2963和3138.由表 2中OTU数、Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数和ACE指数可以看出, 天然植被区土壤的细菌丰富度和多样性均大于扰动区, 天然植被区细菌的可培养数量为4.65×106 cfu·g-1, 而扰动区为1.25×106 cfu·g-1, 这说明天然植被区土壤中物种较为丰富, 细菌菌群较多, 天然气管道施工后引起土壤中细菌多样性降低, 群落结构趋于简单, 表明天然气管道施工对土壤细菌群落丰富度和多样性的影响较大.
基于OTU结果分类表明, 天然植被区细菌归属为25个门、47个纲、93个目、193个科、480个属;扰动区细菌归属为23个门、44个纲、90个目、192个科、436个属, 扰动区和天然植被区的优势细菌种群在门水平上相对丰度大于1%的丰度分布见图 1, 可知变形菌门(Proteobacteria)在2种生境分布中均是比例最大的优势细菌, 在扰动区和天然植被区土壤中丰度分别为49.26%和30.83%;其次是放线菌门(Actinobacteria), 分别占16.75%和28.85%;再次为酸杆菌门(Acidobacteria), 分别占8.5%和12.02%, 拟杆菌门(Bacteroidetes)为第四优势菌门, 分别占6.86%和6.07%.另外, 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)和未被分类的细菌(unclassified-bacteria)在这两种生境中的丰度值均高于1%, 其余各类菌所占比例较少, 归为Other.
对扰动区和天然植被区土壤细菌在门水平上丰度的显著性差异分析结果如图 2所示.图中左边为不同细菌门水平分类在两个样品中的丰度比例, 中间所示为95%置信度区间内物种分类丰度的差异比例, 最右边为p值, p < 0.05, 表示差异显著.土壤细菌在门水平上丰度大于5%的优势菌门中, 酸杆菌门和拟杆菌门差异不显著(p>0.05), 其他门水平上均差异显著, 其中, 变形菌门差异极显著(p < 0.01).
从属水平来看, 扰动区和天然植被区优势细菌类群丰度(图 3)中, 未分类的菌属(unclassified-bacteria)在扰动区和天然植被区中所占比例很大, 分别占12.87%和19.43%, 说明两种生境中仍有许多未知细菌未被人们发现.扰动区中的第一优势菌为假单胞菌属, 占19.95%, 在天然植被区中虽然也是第一优势菌, 但只占6.31%, 差异显著.扰动区中的第二优势菌为鞘氨醇单胞菌属, 占9.69%, 其次为芽单胞菌属, 占4.87%.在天然植被区中, 除未被分类的菌属及第一优势菌假单胞菌属外, GP6占5.32%, 其次为鞘氨醇单胞菌属占5.28%, 假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属为2种生境中的共有优势菌.其他菌属相对含量较小, 丰度值在1%以上的还有诺卡氏菌属(Nocardioides)、嗜氢菌属(Hydrogenophaga)、Aciditerrimonas、Marmoricola、povalibacter、Gaiella、Gp16、Gp4、Streptomyces、Solirubrobacter、Thermoleophilum、WPS-1-genera-incertae-sedis、Aquihabitans等.
扰动区和天然植被区土壤细菌在属水平上丰度差异分析(图 4)表明, 扰动区和天然植被区土壤细菌菌属均表现差异极显著(p < 0.01), 尤其是未分类菌属丰度差异最为显著.在菌属含量大于5.0%的种属细菌中芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属和GP6差异极显著.
扰动区与天然植被区细菌优势属与土壤理化因子相关性分析结果如表 3所示.GP6与速效磷、速效氮呈显著负相关, 与速效磷呈显著负相关(p < 0.01), 与全磷呈显著正相关(p < 0.05).说明速效磷、速效氮、全磷对GP6占比影响较大, 全钾与芽单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属占比呈显著负相关(p < 0.05), 与其他两种菌相关性不显著.假单胞菌属分布与土壤理化因子相关性不显著, 说明土壤理化因子、酶活性对不同细菌的影响具有一定的差异性, 部分丰度低的细菌在维持生态系统平衡及植被恢复过程中起着很重要的作用.
本研究表明施工扰动后, 植被盖度减少至30%, 土壤含水率降低达27.39%, 可能管道施工过程中剔除植被、开挖地表、埋设管道及施工完成后大型机械的碾压等是造成植被盖度减少、含水率降低的主要原因.该结果与李友军等(2006)、薛立等(2005)、Olson等(2012)和穆从如等(1995)对原油管道建设对土壤含水和植物盖度的影响结果一致.
从全量养分来看, 扰动区较天然区土壤全氮含量减少最明显, 由0.38 g·kg-1降低到0.15 g·kg-1, 减少达39.49%, 土壤有机质含量减少达75.63%.王军等(2002)研究表明, 在施工过程中对土壤表底层土未进行分层堆放和回填, 从而导致表底土混合, 底层土有机质含量相对较低, 表层土有机质含量丰富, 同时施工的挖掘与回填会加速有机质分解, 造成土壤有机质含量降低, 进而导致土壤全氮含量降低.崔靖和蔡体久等(2013)对漠河-大庆输油管道沿线19个样段进行土样采集, 通过研究管道建设对土壤养分的影响及非作业带与作业带土壤养分的对比, 发现输油管道施工可显著影响土壤肥力, 土壤有机质、全氮含量显著降低.本研究中, 全钾含量增加最多, 増幅为29.97%, 全磷含量由25.88 g·kg-1升高到30.60 g·kg-1, 升高幅度达18.24%.而许中旗等(2008)认为人为干扰对土壤全钾含量的影响比较小, 是因为全钾的主要部分存在于土壤的大颗粒中, 而土壤的大颗粒受不同人为干扰影响较小.本研究认为是由于在施工过程中底层土的土层结构被严重破坏, 加之与表层土混合, 以及施工时人为遗留的废弃物等原因致使全钾含量升高.综合速效养分来看, 速效磷含量降低幅度最大, 下降了90.00%, 速效钾含量减少了42.01%;速效氮含量下降了71.59%.刘世全等(2004)研究发现, 全氮含量、速效氮含量与有机质含量呈显著正相关, 管道施工时有机质与全氮含量的降低, 会导致速效氮含量的降低.
4.2 扰动对土壤酶活性的影响土壤酶活性与土壤微生物数量可以作为衡量土壤肥力水平指标之一(王颖等, 2005).杜伟文等(2005)研究指出, 土壤酶作为土壤质量的指标、土壤酶活性与土壤微生物之间的关系是相互促进的缓慢过程及土壤酶活性对环境扰动的响应等已成为主要研究方向.本研究发现, 经过天然气管道施工扰动后土壤的过氧化氢酶、脲酶的活力分别减少了18.58%和36.28%, 土壤蔗糖酶活力极显著降低, 活力减少达97.82%.说明环境扰动影响了细菌、植物的群落结构和多样性(Soon et al., 2000).
4.3 扰动对土壤细菌多样性和菌群结构的影响按照细菌各类群所占比例, 将土壤细菌菌群分为优势菌群、常见菌群和稀有菌群.郝建锋等(2014)研究表明, 不同人为干扰强度对森林群落的影响可以通过群落结构和物种多样性的变化直接表现出来.本文通过丰富度、Shannon指数和均匀度等参数的结果表明, 天然植被区细菌群落结构和多样性较扰动区复杂和丰富.在门分类水平上, 扰动前后土壤细菌均以变形菌门、酸杆菌门和放线菌门为优势菌群, 其中变形菌门丰度最高, 这与李菁等(2015)、Roesch Luiz等(2007)、Zhang等(2012)、戴雅婷等(2016)的研究相一致.与对照组天然植被区比较, 干扰区群落土壤中变形菌门相对丰度较大, 同时伴随着其他微生物类群的相对丰度减少.滕嘉玲等(2017)研究表明, 沙埋后丰度增加的门类包括放线菌门、变形菌门、浮霉菌门、拟杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门.在属分类水平上, 假单胞菌属是研究区域的优势分类单元, 扰动区为19.95%, 对照土壤为6.31%, 有较大的变化.研究表明, 变形菌门细菌如假单胞菌代谢类型多、能力强、营养需求低, 在土壤、水、植物及动物活动环境中广泛存在, 且可适应不同的环境.说明扰动区破坏了土壤中细菌的生态系统, 使得抗逆性强的菌群丰度增加, 用以适应逆境环境的胁迫.
微生物不但可以为土壤有机质形成、养分转化和循环提供重要动力, 而且还对土壤养分有一定的影响和调控, 反之, 土壤养分也会对土壤微生物数量和种类产生影响, 二者之间相互关联.本实验中发现全钾与芽单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属占比呈显著负相关, 假单胞菌属分布与土壤理化因子相关性不显著;GP6与速效磷和速效氮占比呈显著负相关, 与全磷呈显著正相关.速效磷、速效氮含量降低, 全磷含量升高, 说明过量的速效磷、速效氮对GP6有一定抑制作用, 其内在机制需要进一步探讨.管道施工开挖和回填土层时, 由于上下层土壤混合, 造成土壤结构破坏, 改变土壤质地, 使土壤养分含量下降, 同时管道开挖时对土壤的翻动、挤压, 导致土壤物理性状如孔隙度、容重、含水率等明显变化, 改变土壤质地和层次, 影响土壤发育, 降低土壤耕作性能, 从而影响土壤微生物群落结构变化.
综合以上分析, 管道施工后土壤肥力降低, 土壤养分含量减少, 土壤酶活性降低, 而且管道施工明显改变了土壤的菌群结构, 细菌菌群变为较单一的结构, 多样性降低.相关性分析进一步表明, 管道施工会造成土壤肥力因子含量或活力的下降, 抗逆性细菌类群丰度增加, 菌群结构单一, 菌群结构改变进一步造成土壤酶活力下降, 土壤养分降低, 影响了植被恢复造效果.研究也发现, 土壤中部分低丰度细菌类群可能在维持生态系统平衡及植被恢复过程中发挥重要作用.本研究为探究脆弱生态环境下植被恢复和生态系统构建提供了参考依据.
5 结论(Conclusions)1) 管道施工扰动后土壤全氮含量减少39.49%, 全磷和全钾含量分别增加了18.24%和29.97%, 而土壤速效钾、速效磷、速效氮含量分别下降了42.01%, 90.00%, 71.59%, 有机质含量下降了75.63%, 过氧化氢酶、脲酶含量分别减少了18.58%、36.28%, 蔗糖酶含量减少了97.82%;但土壤pH在扰动前后变化不明显, 工程扰动降低了土壤养分.
2) 扰动区土壤细菌丰富度和多样性低于天然植被区, 扰动区和天然植被区土壤优势细菌类群为变形菌门、酸杆菌门和放线菌门, 其中, 变形菌门丰度在两种生境中所占比例分别为49.26%和30.83%.在属水平上, 假单胞菌属均为扰动区与天然植被区土壤中第一优势菌属, 所占比例分别为6.31%和19.95%, 表现为逆境适应性强的细菌仍为优势菌.
3) 土壤全钾是影响芽单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属丰度的主要因子, 速效氮、速效磷、全磷是影响GP6丰度的主要因子.
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