1 引言(Introduction)

近年来, 随着我国工业化步伐的快速前进, 化石燃料的燃烧、汽车尾气的排放和金属冶炼等带来了严重的大气污染, 大气污染形势日益严峻, 对人类健康造成的恶劣影响也日益突显, 大气污染已成为广泛关注的环境和社会问题.其中, 大气颗粒物是影响人类健康的主要污染物之一.PM_2.5是指环境空气中空气动力学当量直径≤2.5 μm的颗粒物, 也称为细颗粒物.

PM_2.5是目前影响我国空气质量状况的关键指标.最近一项全球性疾病负担评估排名将PM_2.5作为世界范围内死亡和致残的主要因素之一(Lim et al., 2012).除了对呼吸系统的影响外, PM_2.5对心血管系统的损害也日益受到关注, 国内外流行病学研究均发现, PM_2.5所造成的心血管疾病(CVD)与其所致肺部疾病的后果相等甚至更严重(Brook et al., 2010；Zhou et al., 2014).谢鹏等(2009)对我国人群大气颗粒物污染进行的meta分析发现, PM_2.5浓度每增加10 μg·m^-3, 人群心血管疾病的住院率增加2.81%, 死亡率增加0.53% (95%CI：1.45%~2.74%).

研究证实：PM_2.5对雄性自发性高血压大鼠的心脏有一定的急性毒作用, 可引起心脏重构, 心脏组织中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的mRNA表达明显升高(董晨等, 2006；Chin et al., 2015).最新研究报道, 长期暴露于浓缩大气颗粒物(concentrated ambient particulate matter, CAP)可引起自发性高血压大鼠可逆性心脏功能障碍和心肌肥大(Ying et al., 2009).

目前, 大量的临床试验已经证明, 长期暴露于PM_2.5与左心室肥厚(LVH)有关(Ying et al., 2015), 也有研究表明, 长期暴露于CAP引起了C57BL/6小鼠心肌肥大(Chin et al., 2015), 但对停止PM_2.5暴露后对心肌肥大/纤维化恢复状况的研究甚少.不同人群对PM_2.5的敏感性有所不同, 流行病学研究发现, 相较于正常人群, 老年人、妇女及冠心病和糖尿病患者在暴露于PM_2.5后心血管疾病的发病和病死风险程度更高(Lee et al., 2014; Brook et al., 2010).在前期研究的工作中, 我们分别对4周、4月及10月龄C57BL/6小鼠进行了PM_2.5染毒, 发现10月龄小鼠对PM_2.5最为敏感, 其心脏功能紊乱及心肌肥大/纤维化程度最为严重.因此, 在本研究中, 我们对10月龄C57BL/6小鼠进行为期4周的PM_2.5暴露后, 对停止暴露后分别恢复1 d、1周和2周3个时间点的心脏病理学切片进行了观察, 以心肌细胞β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain, β-MHC)和心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)作为心肌细胞肥大标志物来确定心肌肥大随恢复时间变化的状况, 并检测了TGF-β1和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)MMP2和MMP9的表达水平.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 PM_2.5采集及其悬浊液的制备

在2012—2013年, 采用石英滤膜和TH-150 C Ⅲ型智能中流量空气采样器采集了太原市大气中PM_2.5.采样流量为100 L·min^-1, 每天采样时间设置为22 h, 并在采样前后称量石英滤膜的重量, 将采集完成的滤膜密封在铝箔中, 4 ℃储藏.将滤膜剪碎、超声振荡、过滤后, 在真空中冷冻干燥.

2.2 实验动物处理

体重18~24 g的10月龄C57BL/6雌性小鼠54只, 购自南京君科生物工程有限公司, 随机分为2组, 每组27只, 分别为对照组和PM_2.5组.小鼠在不锈钢笼中, 12 h昼夜周期循环, 保证外界温度为(24±2) ℃, 湿度为50%±5%.两组小鼠均采用咽后壁滴注法, 将小鼠麻醉后置于倾斜平台上, 轻轻将舌头拉起, 将生理盐水或3 mg·kg^-1 PM_2.5悬浊液从舌根注入, 每2 d滴注1次, 共暴露4周.PM_2.5暴露剂量是根据小鼠的通气量(90 mL·min^-1)及中国环境空气质量标准(GB3095-2012)日平均PM_2.5二级浓度限值(75 μg·m^-3)的3倍来计算得到的, 在重污染情况下, 小鼠每天吸入的PM_2.5量：75 μg·m^-3 ×3×90 mL·min^-1×10^-6×60 min×24 h=0.02916 mg；以小鼠体重平均20 g来计算每日吸入的PM_2.5剂量：0.02916 mg÷0.02 kg=1.458 mg·kg^-1.因为每2 d进行一次染毒, 则每次染毒量应为1.458×2=2.916≈3 mg·kg^-1.每组小鼠分别于暴露后1 d、1周或2周被处死, 取出心脏组织, 每组取3只小鼠的左心室心尖部进行固定, 其余组织液氮速冻后转入-80 ℃冰箱中保存.

2.3 HE染色组织学分析

将小鼠处死后, 立即取出心脏组织, 在4%的多聚甲醛中固定, 用常规梯度酒精和二甲苯脱水, 用石蜡包埋.组织切成5 μm厚的切片常规脱蜡烘干后, 苏木素染色, 蒸馏水洗涤, 氨水反蓝30 s, 蒸馏水洗涤.伊红染色3 min, 蒸馏水洗涤.脱水、晾干、封片、显微镜下观察并拍照.使用图像IPWIN32软件进行分析, 以细胞核面积与细胞质面积之比量化得到心肌细胞核质比.

2.4 总RNA的提取与荧光定量PCR

称取80~100 mg心脏组织, 用Trizol匀浆提取总RNA, 通过测定RNA在260 nm处的吸光度来定量.使用PrimeScript^TM反转录试剂盒(TaKaRa)将提取的RNA反转录成cDNA, 放置于-80 ℃备用.使用Analytikjena荧光定量PCR仪进行PCR反应, 所需引物均采用Primer Premier 5.0软件进行设计, 所用引物的序列见表 1.

PCR反应总体积为20 μL, 其中含有1 μL cDNA, 10 μL SYBR Premix Ex Taq, 上、下游引物各1 μL和7 μL dd H₂O.反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 扩增45个循环.所有PCR扩增片段的大小均经过溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳证实, 最终结果以目的基因与内参基因GAPDH表达的比值来表示.

2.5 总蛋白的提取与Western blot

取小鼠心脏组织50~80 mg, 加入1 mL蛋白裂解工作液进行匀浆, 裂解工作液成分为：1% Nonidet P40, 1 mmol·L^-1EDTA, 125 mmol·L^-1sodium fluoride, 0.5 mmol·L^-1sodium vanadate, 2.5 μg·mL^-1aprotinin, 5 μg·mL^-1pepstatin, 50 μg·mL^-1leupeptin, 25 μmol·L^-1PMSF, 25 μg·mL^-1trypsin inhibitor.匀浆至无组织块, 4 ℃下放置20 min, 13000 r·min^-1离心15 min, 取出上清液, 以BSA为标准蛋白, 使用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度, -80 ℃下储存备用.用Western Blot方法检测目的基因蛋白表达水平, 以50 μg蛋白上样量, 加入蛋白上样缓冲液, 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白, 将目的蛋白电转至硝酸纤维素膜(NC膜)上, 封闭, 加相应一抗与特定蛋白发生免疫反应, 4 ℃孵育过夜, 洗一抗, 加荧光二抗与一抗结合孵育, 洗二抗, 使用LI-COR Odyssey红外荧光系统扫描检测, 结果表示为目的蛋白与GAPDH蛋白的灰度比值.

2.6 数据统计学处理

用SPSS统计软件进行统计分析数据, 用origin软件作图, 结果以均值±标准误(mean ± SE)的形式来表示, 用One way ANOVA法检验处理组与对照组的显著性差异.当p＜0.05时被认为具有统计学显著性.

3 结果(Results) 3.1 PM_2.5暴露导致老年小鼠可逆性心肌细胞肥大

如图 1所示, HE染色结果显示, 老年C57BL/6雌性小鼠经3 mg·kg^-1 PM_2.5暴露4周后, 心肌纤维明显增粗并趋于紊乱, 心肌细胞胞浆染色变淡.根据核质比结果分析可知, 与对照组相比, 4周暴露后恢复1 d及恢复1周组的心肌细胞核质比显著降低, 提示PM_2.5暴露可导致心肌细胞肥大, 恢复2周组心肌细胞核质比与对照组相比无显著变化, 表明PM_2.5暴露所致心肌细胞肥大是可逆的, 在停止暴露2周后可有效恢复.

3.2 PM_2.5暴露可致小鼠心肌肥大相关基因mRNA表达上升

如图 2所示, PM_2.5暴露后恢复1 d组中, ANP、β-MHC、MMP2和MMP9的mRNA表达水平均显著升高.表明PM_2.5暴露4周可以引起老年小鼠心肌肥大标志物ANP和β-MHC的mRNA表达升高, 同时, MMP2和MMP9表达也升高.恢复1周组和恢复2周组中, 上述基因的mRNA表达水平与对照组相比均无显著性差异.

3.3 PM_2.5暴露导致小鼠TGFβ1和MMP2蛋白表达上升

如图 3所示, 与对照组相比, PM_2.5暴露后恢复1 d组和恢复1周组小鼠心脏组织中TGFβ1和MMP2的蛋白表达显著升高, 而恢复2周组无显著性差异.心肌肥大/纤维化状况明显改善, 恢复两周后, 心肌细胞基本恢复正常.

4 讨论(Discussion)

左室心肌肥大是心血管事件中一个强有力的独立预测因子.流行病学研究已经证明长期暴露于PM_2.5与LVH有关(Ying et al., 2009), 研究表明, 抽烟可导致高血压模型大鼠心肌肥大的发生(Meurrens et al., 2007).短期CAP暴露引起了血管紧张素Ⅱ处理的小鼠左心室肥厚(Ying et al., 2009), 9个月CAP暴露可致小鼠心肌肥大(Wold et al., 2012).CAP暴露15周可诱导高血压大鼠心肌肥大的发生, 在停止暴露5周后恢复正常(Ying et al., 2009).我们的研究发现PM_2.5暴露4周可致老年小鼠心肌细胞核质比降低, 反映有心肌肥大的发生, 但停止暴露2周后心肌细胞可自我恢复至正常水平.

心肌肥大是指心肌细胞体积增大为特征的重塑过程, 早期可代偿性出现心室壁增厚与心肌收缩能力增强, 但在持久病理性应激情况下, 逐渐严重的心肌肥大伴随着间质纤维化、收缩功能失调以及基因表达、能量代谢和电生理特征异常, 最终可出现失代偿性心功能衰竭, 是多种心血管疾病的独立危险因素.ANP为胚胎期表达基因, 在正常心肌细胞中表达量很低, 在病理状态下, 心肌组织胚胎期基因重演, ANP mRNA表达量明显增加, 为病理性心肌肥大的可靠指标.β-MHC基因表达量在发育、衰老、压力超负荷、心肌肥厚、运动等生理病理条件下会发生改变(Zile et al., 2002).因此, 在本研究中将ANP与β-MHC这两种基因作为心肌肥大标志物, 来反映心肌肥大情况.在心肌肥大的过程中, 往往伴随着心肌纤维化的发生, 主要表现为间质中胶原的合成増加和分解减少.心肌组织中的MMPs主要由心肌成纤维细胞分泌, 介导心肌细胞外基质的降解.TGFβ1在心肌肥厚和纤维化发生过程中促进心肌细胞的生长、成纤维细胞的激活和细胞外基质的沉积(Schiller et al., 2004), 可通过多重途径促进心肌纤维化的发生与发展.CAP暴露引起血管紧张素Ⅱ处理的小鼠左心室肥厚的同时, 也发现ANP、MMP2和TGFβ表达上升(Ying et al., 2009).9个月CAP暴露致小鼠心肌肥大的同时, 也发现ANP、β-MHC和TGFβ表达上升(Wold et al., 2012).我们的研究结果表明, PM_2.5暴露4周可致小鼠心肌肥大相关基因ANP、β-MHC、MMP2和MMP9 mRNA表达上升, 但停止暴露1周后mRNA可经机体自我恢复至正常水平.而MMP2和TGFβ1的蛋白水平在PM_2.5暴露4周表达上升, 在停止暴露2周后蛋白表达可恢复至对照组水平.

本研究证实了PM_2.5暴露可以引起正常血压的老年小鼠可逆性心肌肥大.但实验也存在有一定的局限性, 对心肌肥大恢复的分子机制并未做深入研究, 在下一步工作中我们将对其分子机制进行深入研究.但本研究结果为大气污染诱发的心肌肥大的预防和治疗提供了理论基础.

5 结论(Conclusions)

1) 老年小鼠经PM_2.5暴露4周可导致心肌细胞核质比降低、心肌肥大标志物(ANP与β-MHC)及相关基因(MMP2、MMP9和TGFβ1)表达升高.

2) 停止PM_2.5暴露后恢复两周, 心肌细胞核质比、心肌肥大标志物及相关基因表达基本恢复正常.