2018, Vol. 38
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胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, 简称EPS)是在一定条件下由微生物分泌于体外的一些高分子聚合物, 主要包括蛋白质、多糖和DNA(袁冬琴等, 2012).EPS源自于活性细菌分泌、细胞自溶和原水基质, 在微生物细胞之间起到架桥作用, 被用于细胞之间物质与能量的传递, 对活性污泥的絮凝、沉降和脱水性能产生直接影响(黄兴等, 2009), 其组成往往与污染物去除及污水处理方式密切相关(樊鹏超等, 2017; Carles et al., 2013; 龙向宇等, 2012).按EPS分布形式, 可以分为溶解性EPS(SMP)、松散型EPS(LB-EPS)、紧密型EPS(TB-EPS), 其中, SMP溶解于液体中, 与细胞衰减和基质代谢成比例；LB-EPS位于TB-EPS外, 黏合细胞群形成菌落或者絮体；TB-EPS附着于细胞壁表面, 起连接细胞群作用(Mahmoud et al., 2011).因此, 研究活性污泥中EPS的分布特性, 对于明确活性污泥的特性、污水的处理效率及污泥减量与资源化具有重要意义(Li et al., 2015; 龙向宇等, 2012).
针对EPS提取的方法很多, 主要的提取方法有离心法、超声波法、EDTA法、加热法、NaOH法、阳离子树脂交换法、甲醛+NaOH法、化学试剂外加电场法等(王淑莹等, 2016), 然而, 目前仍没有一种规范的提取EPS方法.周俊等(2013)、刘翔等(2011)、邬卓颖等(2012)发现, EPS提取方法按提取效率依次为：甲醛+NaOH＞2%EDTA＞加热＞甲醛+超声＞超声＞对照＞甲醛, 其中, 甲醛和NaOH的投加会对EPS后续分析产生影响, 超声提取EPS往往不完全, 这些研究均指出热提取法具有显著优势, 不仅对EPS的提取效率较高, 而且操作简单、方便.热提取法是一种利用加热使得细胞表面EPS与细胞间作用力降低, 在离心作用下使EPS与细胞剥离的提取方法.近年来, 已有许多学者针对热提取法的提取温度及提取时间做了一些研究, 王淑莹等(2016)、李继宏等(2013)研究发现, 提取温度为80 ℃, 提取时间为40 min时, EPS的提取量最高.在热提取法中, 为了给污泥提供较为合适的环境, 往往采用氯化钠作为缓冲液, 为EPS提供溶解的环境.Li等(2013)分析了活性污泥在各种盐度下形成的可溶性微生物产物, 发现盐度会影响SMP的形成, 随着氯化钠浓度的增加, 酪氨酸和色氨酸区域的标准化体积百分比增加, 而腐殖酸和富里酸区域的体积百分比显著降低.然而, 目前很少有人针对热提取法的缓冲液盐度开展研究.因此, 本研究从不同类型EPS的含量及荧光特性出发, 探究盐度对热提取EPS效果的影响, 以期为EPS各组分更高效的提取提供技术参考.
同时, 袁冬琴等(2012)研究发现, 氯化钠浓度不同是导致离子强度差异的原因, 进而会引起EPS表面Zeta电位和电导率的改变；王浩宇等(2012)研究了Zeta电位、胞外多聚物的变化及两者之间的关系, 发现蛋白质对降低污泥表面电位, 促进污泥聚集及好氧颗粒污泥的形成生长等可能起着重要作用.安莹等(2014)采用三维荧光光谱分析了不同盐度下MBR中EPS的变化规律, 并应用平行因子模型(PARAFAC)处理三维荧光数据, 研究发现, 所有样品中均含有蛋白质组分(C1)、类胡敏酸组分(C2、C3、C4).因此, 研究缓冲液的盐度对热提取污泥EPS的影响具有重要意义.本文以活性污泥为研究对象, 采用热提取法提取污泥中的EPS, 分析提取缓冲液盐度、提取时间、提取温度对EPS提取的影响, 并基于PARAFAC模型深入探究缓冲液盐度对热提取EPS三维荧光特性的影响, 以优化热提取法在污泥EPS提取方面的应用.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料选用西安市某污水厂污泥浓缩池的剩余污泥作为研究对象, 该污水厂采用氧化沟活性污泥法处理城市污水.采集的污泥样品均在2 h内运至实验室, 并保存于冰箱中备用, 所有试验均在采集样品后7 d内完成, 所有指标的测量均采用标准方法.分析结果显示, 活性污泥的污泥沉降比(SV)为98.00%, 污泥容积指数(SVI)为74.6 mL·g-1, 悬浮固体(MLSS)含量为13.22 g·L-1, 可挥发性固体(VSS)为5.25 g·L-1.为了保证污泥性状不发生改变, 从现场取样后立即送实验室提取EPS, 分析EPS组分的含量.
2.2 试验方法活性污泥EPS组分采用热提取法提取, 具体提取过程如图 1所示.为了优化热提取法对EPS的提取, 参考李继宏等(2013)的研究成果, 提取方法的条件为：0.85%氯化钠缓冲液, 提取温度80 ℃, 提取时间40 min.为了进一步优化热提取法在EPS提取方面的应用, 探究不同氯化钠缓冲液盐度(0、0.05%、0.20%、0.35%、0.50%、0.65%、0.80%、1.00%)、提取温度(50、60、70、80、90、100 ℃)和提取时间(5、10、20、30、40、50、60 min)对热提取法提取EPS效果的影响.
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| 图 1 EPS提取方法 Fig. 1 Method of extraction |
EPS的提取效率通过蛋白质、多糖、DNA的含量表征.蛋白质采用修正Folin-Lowry法测定(标准物质为牛血清蛋白), 多糖采用蒽酮法测定(标准物质为葡萄糖), DNA采用二苯胺法测定(标准物质为小牛胸腺DNA), 各组分的含量以每克有机物中物质的含量表示, 单位为mg·g-1(以VSS计), 以3种物质的含量表征不同组分EPS的含量(刘翔等, 2011).
2.3.2 EEM分析采用FluoroMax-4荧光光谱仪测定EPS样品中的荧光物质, 如类蛋白、富里酸及腐殖酸等荧光物质(Sheng et al., 2013).激发波长(λEx)的扫描范围为240~450 nm, 发射波长(λEm)的扫描范围为290~550 nm, 步长均为2 nm, 狭缝宽度均为3 nm.
2.3.3 平行因子模型分析平行因子分析模型(PARAFAC模型)已在Stedmon和Bro(2008)的文章中被详细描述, 这里只做简单的介绍.PARAFAC是双线性主成分分析(PCA)到更高阶阵列的推广, 即将N路数组分解为N个加载矩阵.在EEM数据分析中, 平行因子模型方程如下(Yu et al., 2010; Elcoroaristizabal et al., 2015)：
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(1) |
式中, xijk表示在发射波长j和激发波长k下测量的样品i的荧光强度(在EEM分析中)；εijk表示不明原因的信号(包含噪声和其他非模型变化的残差)；aif被定义为分数, 与第i个样品中第f个荧光基团的浓度成比例；bjf和ckf分别表示第f个荧光基团发射光谱和激发光谱的估值.
参照Stedmon等(2008)的平行因子分析步骤, 利用Matlab R2014a(Mathworks, Natick, MA)的DOMFluor toolbox分析EEM的测定结果.对参数应用非负性约束以仅允许化学相关的结果；几个预处理步骤被用来降低最小化散射线和EEM的其他属性的影响；从每个样品EEM中减去对照Milli-Q水的EEM；其他瑞利与拉曼散射被扣除.通过上面的处理, 减少不同样品中不同EPS含量对组分矩阵的影响.计算了2~7个分量的PARAFAC模型的EEM, 基于残差分析、目视检查等确定组分的正确数量(Liu et al., 2017).
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 提取时间对EPS提取的影响图 2为在提取温度80 ℃, 氯化钠缓冲液盐度0.85%条件下, 不同提取时间对污泥EPS 3种组分含量(以每g的VSS的含量计)分布的影响.可以发现, 总EPS含量在热提取时间为50 min时最高, 且蛋白质的含量最高, 约占总EPS的75.3%左右.当热提取时间小于30 min时, 随着时间的增加, 蛋白质、多糖和DNA的提取量基本相同；当热提取时间从30 min增加到40 min时, 3种组分的含量显著增加；当热提取时间大于40 min时, EPS提取量增加逐渐缓慢；在提取50 min之后, EPS的含量保持稳定.由于提取时间较短时, 细胞表面的TB-EPS仍与细胞紧密结合, 随着时间的延长, 在适当温度下TB-EPS与细胞表面的粘性降低, 有利于EPS的提取.说明热提取时间只有在达到某一适当时间(大于40 min), 才可使EPS的提取量达到最优.该结果与李继宏等(2013)的研究结论相似.
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| 图 2 提取时间对污泥EPS提取效果的影响 Fig. 2 Effect of time on the extracting efficiency of EPS |
温度在热提取法中起着至关重要的作用, 可使EPS与细胞之间的相互作用力降低, 有利EPS从细胞表面分离.图 3为在提取时间40 min, 氯化钠缓冲液盐度0.85%条件下, 不同提取温度对污泥EPS 3种组分含量(以每g的VSS的含量计)分布的影响.可以发现, 随着温度的增加, 蛋白质的含量逐渐增加, 而多糖与DNA的含量呈现先增加再降低, 最后又增加的趋势.当温度低于70 ℃时, 蛋白质、多糖和DNA增加的趋势较为显著, 在70 ℃时, 多糖和DNA含量达到最高值；当温度大于70 ℃小于90 ℃时, 多糖和DNA含量呈现降低趋势, 而蛋白质的含量仍逐渐增加；当温度大于90 ℃时, 3种组分含量呈增加趋势, 且蛋白质的含量显著增加.
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| 图 3 提取温度对污泥EPS提取效果的影响 Fig. 3 Effect of temperature on the extracting efficiency of EPS |
在热提取法中, 提取温度过高, 可能会使细胞结构被破坏；温度过低, 细胞表面的EPS又很难被分离.图 3中温度在60~80 ℃之间时, DNA的含量基本保持不变, 而当温度高于80 ℃时, DNA和蛋白质含量逐渐增加, 主要是由于细胞被破坏, 细胞内的蛋白质和DNA被释放引起的.因此, 可以发现在温度过高时, 细胞结构可能被破坏, 使得EPS的含量增加, 该条件不利于研究细胞表面EPS的真实含量及组分.以上结果说明, 温度为70 ℃时, 热提取法对EPS的提取较为有利.该研究结果与周俊等(2013)、李继宏等(2013)、王淑莹等(2016)研究的热提取法的结论基本一致.
3.3 缓冲液盐度对EPS提取的影响图 4为8种缓冲液盐度下, 热提取法对不同层EPS和总EPS的提取效果(以每g VSS的含量计).从图 4中可以看出, 不同缓冲液盐度对EPS各组分提取的影响不同, 污泥EPS提取存在一个最佳缓冲液盐度.在LB-EPS的提取中, 随着缓冲液盐度的增加, 蛋白质、多糖和DNA含量呈先增高后降低的趋势, 在0.50%氯化钠缓冲液时LB-EPS的提取量最高, 为(11.94±0.24) mg·g-1 (图 4a)；在TB-EPS提取中, 随着氯化钠缓冲液盐度的增加, TB-EPS提取量先增加后逐渐降低, 在0.05%氯化钠缓冲液盐度条件下, 热提取法对TB-EPS的提取量达到最高, 为(85.23±1.59) mg·g-1 (图 4b)；对于总EPS的提取, 从图 4c可以发现, 0.05%氯化钠浓度时EPS提取量最高, 为(93.26±2.07) mg·g-1.
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| 图 4 缓冲液盐度对污泥EPS提取效果的影响(a.LB-EPS, b.TB-EPS, c.总EPS) Fig. 4 Effect of buffer salinity on the extracting efficiency of EPS |
不同缓冲液盐度对各层EPS提取效果的影响不同, 主要是由于随氯化钠缓冲液浓度变化, 离子强度也随着变化, 导致EPS的原有Zeta电位、电导率机细胞渗透压发生改变(袁冬琴等, 2012; 安莹等, 2014), 因而各层EPS与细胞的相互作用受到影响, 使得不同氯化钠缓冲液盐度对热提取法的提取效率产生不同影响.因此, 在热提取法中, 存在一个最佳的缓冲液盐度, 可使EPS提取率达到最高.同时, 从图 4中还可以得出, 不同缓冲液提取的总EPS中, 蛋白质的含量最高, 约占总EPS的76.59%±2.69%, 而DNA含量大约仅占总EPS的5.00%；LB-EPS和TB-EPS中蛋白质、多糖和DNA所占的各层总EPS的比例基本一致.
3.4 基于平行因子模型的EEM分析基于平行因子模型, 利用Matlab软件运行DOMFluor工具包对不同缓冲液盐度的EPS提取液的EEM数据进行处理.图 5为不同缓冲液盐度条件下SMP、LB-EPS和TB-EPS的PARAFAC模型分峰结果, 平行因子分析确定的4组分模型适用于分析污泥EPS的EEM结果, 4个荧光组分主要包括(λEx/λEm)：C1(290 nm, 302/350 nm)、C2(278 nm, 340 nm)、C3(310 nm, 410 nm)、C4(380/420 nm, 474/514 nm), 其基本特征见表 1, 其中, C1为类蛋白质, C2为类色氨酸(属于类蛋白), C3为类胡敏酸(属于类腐殖酸), C4为类腐殖酸.
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| 图 5 PARAFAC模型确定的荧光组分及其位置 Fig. 5 Determining the fluorescent component and peak position by using the PARAFAC model |
| 表 1 不同缓冲液盐度下EPS的EEMs中的荧光组分及其特征 Table 1 Fluorescence components and characteristic from the EEMs of EPS under different buffer salinity |
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图 6为不同缓冲液盐度下热提取污泥EPS各组分最大荧光强度的分布图.从图 6中可以看出, 热提取法中缓冲液盐度不同, 对EPS中荧光强度产生的影响较为显著, 且SMP、LB-EPS和TB-EPS的最大荧光峰不同, 分别为C2、C2、C1, 这主要与不同组分EPS的特性有关.对于热提取法提取污泥中LB-EPS, 随着氯化钠溶液盐度的增加, 离子强度逐渐增加, 最大荧光强度先增大后降低, 在0.50%氯化钠条件下, 热提取法的最大荧光强度最高, 这与3.3节的结果相一致, 主要是由于离子强度改变, 可能导致EPS表面的Zeta电位和离子强度发生改变, 使得EPS与细胞间的作用力发生改变, EPS提取存在一个最佳提取条件.对于热提取法提取污泥中TB-EPS, 随着氯化钠溶液盐度的增加, 最大荧光强度具有降低的趋势, 在0.0%氯化钠盐度下有最大荧光强度(C1), 但此条件下C2、C3、C4的荧光强度相对于0.20%氯化钠缓冲液的相应组分较低, 综合考虑各组分的荧光强度, 0.20%氯化钠较为适合热提取法中对TB-EPS的提取, 综合3.3节的结果, 可得出0.05%氯化钠较为适合热提法提取污泥中TB-EPS组分.从不同荧光组分可以发现, EPS的荧光物质主要为类蛋白质物质, 这与EPS的提取分析结果是一致的.
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| 图 6 不同缓冲液盐度的最大荧光强度分布 Fig. 6 Distribution of maximum fluorescence intensity under different buffer salinity |
1) 提取时间、提取温度和缓冲液盐度均影响热提取法对污泥EPS的提取效果, 其中, 不同缓冲液盐度对EPS的提取效果及荧光强度均产生影响, 且合适的氯化钠缓冲液盐度有利于热提取法对EPS的提取.
2) 缓冲液盐度对不同层EPS的影响是不同的, 随着盐度增加, LB-EPS的提取量及荧光强度均先增加后降低, 而TB-EPS的提取量及荧光强度呈现降低的趋势, 在0.05%氯化钠条件下达到最佳提取效果.
3) 活性污泥中不同组分的EPS中均存在类蛋白峰C1(290 nm, 302/350 nm)、类色氨酸峰C2(278 nm, 340 nm)、类胡敏酸峰C3(310 nm, 410 nm)和类腐殖酸峰C4(380/420 nm, 474/514 nm), 在0.50%氯化钠缓冲液中LB-EPS的荧光强度最高, 在0.20%氯化钠缓冲液中TB-EPS的荧光强度较高.
4) 热提取法最佳提取条件为：提取时间40 min, 提取温度70 ℃, LB-EPS的缓冲液为0.50%氯化钠, TB-EPS的缓冲液为0.05%氯化钠, 总EPS的提取量最高可达(93.26±2.07) mg·g-1.
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