2019, Vol. 39
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硝酸盐是水体中的主要污染物, 其向环境中的过量排放是造成水体富营养化、藻华爆发的主要原因(Vitousek et al., 1997；Holloway et al., 1998；陈水勇等, 1999；Conley et al., 2009).在污水处理中, 硝酸盐可以通过微生物的反硝化过程还原为气态氮或氮氧化物(Dong et al., 2009；Bettez et al., 2012).反硝化微生物通常含有硝酸根还原酶(NAR), 亚硝酸根还原酶(NIR), 一氧化氮还原酶(NOR)以及一氧化二氮还原酶(N2OR)(李平等, 2005；辛明秀等, 2007).这些细菌在缺少电子受体的条件下(缺氧或厌氧), 利用这些酶系统将代谢产生的电子直接传递给硝酸根生成氮气或氮氧化物为自身的生长提供其所需的能量(Zumft et al., 1997).随着我国污水排放标准的日益升高, 水中过量的含氮污染物去除存在电子供体不足的问题, 污水的深度处理通常靠添加甲醇、乙醇或者乙酸等途径实现电子供体补给.这种补给方式不仅造成了脱氮成本高、污泥量增加, 带来了二次环境污染问题.探索新的反硝化电子供给方式是提升反硝化效率、提升碳源有效利用率的关键.
有报道表明, 产电微生物无需借助任何媒介, 与其他微生物进行种间直接电子传递(Summers et al., 2010；Strycharz et al., 2011；Phuc et al., 2017), 是一种新的微生物电子供给方式.产电微生物(Excelectrogen), 是指具有向胞外传输电子能力的微生物, 其能够通过电子传递链将氧化磷酸化反应过程中产生的电子输出到胞外(Logan et al., 2011).硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)属于典型的产电微生物, 其具有出色的传输电子能力、高效的产电能力, 同时亦在生物地球化学循环中占有重要地位(Lovely et al., 2011).G. sulfurreducens可通过产生的细胞色素c作为电子中介体与电极进行短距离电子传递, 也可通过导电性极强的纳米导线进行长距离电子传递(Torres et al., 2009;Yates et al., 2012).G. sulfurreduences PCA因具有完整的全基因组序列和完备的基因操作手段而被广泛研究.研究表明G. sulfurreducens可利用乙酸盐、H2、甲醇、丙醇等作为其电子供体；同时以无定型铁、柠檬酸铁、焦磷酸铁、硫、O2等作为其电子受体(孙丹, 2013).G. sulfurreducens产生的电子可通过直接或间接种间电子传递过程传递给其他微生物, 实现微生物间的合作代谢过程(Stams et al., 2009；Summers et al., 2010；Shrestha et al., 2013；Rotaru et al., 2014；Smith et al., 2015).硝酸盐作为一种广泛存在于天然废水中的电子受体, 其具有较高的相对氧化还原电势(+0.433 V), 有望在电子受体受限的厌氧条件下, 被微生物群落直接还原, 实现产电微生物介导的高效反硝化电子传递过程, 从而达到脱除受硝酸盐污染水体中的氮元素的目的, 高效低耗地实现污染水体的净化, 改善水质, 控制天然水体亦或是养殖水体中可被藻类植物利用的氮源含量, 降低直至消除水体富营养化的风险.同时在市政及工农业污水处理过程中, 传统的反硝化工艺流程AAO在其污泥回流过程中, 因不同池体体系中含氧量及电子供体的改变, 常出现反硝化过程的迟滞期.通过探索新的有产电微生物介导的反硝化电子供给方式亦能够减少体系的水力停留时间并减小所需的反应器体积, 降低工艺的花费和能量投入.
然而G. sulfurreducens并不能够直接还原硝酸根生长.研究发现, 其可以与Wolinella succinogenes协同作用, 实现将电子从乙酸向硝酸根的转移, 实现异化硝酸还原为铵(DNRA)的过程(Kaden et al., 2002).此外在G. sulfurreducens和自养类型的Thiobacillus denitrificans之间也可发生协同作用, 这两种细菌只有在具有催化作用的纳米Fe3O4的介导下, 发生硝酸盐还原过程(Kato et al., 2012).将G. sulfurreducens同代谢甲醇的反硝化细菌进行共同培养, 可显著提升反硝化细菌的脱氮效率, 在体系中C/N值为6时, 其速率提升达到了51%, 共生体系中nirS基因得到了更加显著的表达, 有效促进了反硝化进程(Wan et al., 2018).G. sulfurreducens与反硝化细菌形成了红色团聚体, 初步验证了二者可互营共生, 实现种间电子转移.
在更加广泛底物条件下, G. sulfurreducens是否可与反硝化细菌发生种间电子转移、提升反硝化速率尚未知晓.本实验以非甲醇的简单有机物即乙醇、丙酸和葡萄糖分别作为碳源驯化反硝化细菌, 分别与G. sulfurreducens PCA构建共培养体系, 通过测定其中硝酸盐、亚硝酸盐变化, 探讨共培养能否提升反硝化的速率及效率.并通过测定OD600的变化情况及定量共培养体系中反硝化细菌和PCA的相对丰度, 研究不同碳源条件下G. sulfurreducens对反硝化过程的影响机制.本研究针对厌氧微生物反硝化电子转移过程进行新的探索, 揭示不同碳源下电活性微生物在反硝化过程中的作用, 有望为污染水体中硝氮和亚硝氮的去除提供新的微生物强化方法.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 接种细菌培养及培养基成分实验中所用的反硝化细菌来源取自天津市南开大学污水处理厂的活性污泥.在取样后迅速储存于4 ℃的冰箱中.并分别以乙醇、丙酸及葡萄糖作为反硝化培养过程中的外加碳源.用于反硝化细菌培养的培养基配方如下：Na2HPO4 0.8 g、CaCl2 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.07 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、KNO3 0.505 g(5 mmol), 微量金属元素溶液1.25 mL及维生素溶液1 mL.碳源的投加量分别为乙醇11.7 mmol、丙酸钠10 mmol及葡萄糖5.8 mmol(保证化学需氧量在1.12 g·L-1), 分别添加蒸馏水至1 L, 调整pH至7.0.
微量金属溶液的配置如下：NTA 15 g、ZnCl2 1.3 g、MnCl2·4H2O 5.8 g、H3BO3 0.1 g、FeCl2·4H2O 0.72 g、KAl(SO4)2·12H2O 0.1 g、CoCl2·6H2O 1 g、Na2MoO4·2H2O 0.1 g、NiCl2·6H2O 0.24 g、Na2WO4·2H2O 0.25 g、CuCl2·2H2O 0.068 g, 并添加蒸馏水至1 L, 调整pH至7.0.维生素溶液的配置如下：生物素10 mg、烟酸25 mg、叶酸10 mg、泛酸25 mg、盐酸吡多辛50 mg、钴胺素0.5 mg、核黄素25 mg、对氨基苯甲酸25 mg、硫胺25 mg、硫辛酸25 mg, 并添加蒸馏水至1 L.
选择硫还原地杆菌中产电模式菌株Geobacter sulfurreducens PCA(ATCC 51573)进行培养, 其所使用的培养基配方如下所示：富马酸4.64 g、100*NB盐10 mL、金属溶液10 mL、维生素15 mL、CaCl2·2H2O 0.04 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaHCO3 1.8 g、Na2CO3·H2O 0.5 g、1 mmol Na2SO4 1 mL、NaAc 1.23 g.培养基分装至厌氧血清瓶中利用N2/CO2混合气进行曝气30 min, 再将丁基橡胶塞半塞入瓶口曝气10 min以充分除去培养基中的氧气.用丁基橡胶塞和铝盖密封并在121 ℃条件下进行高压蒸汽灭菌20 min.在培养基冷却后利用于无菌厌氧操作箱中接种10 mL G. sulfurreducens PCA菌液至厌氧瓶中.待细菌长至对数生长期时进行相关实验.
2.2 反硝化细菌与Geobacter sulfurreducens PCA的共培养反硝化微生物群落和Geobacter sulfurreducens PCA细菌分别在驯化脱氮效率稳定后以及对数生长期分别测定其OD600值后分别将反硝化菌群落(50 mL, OD600=0.51)和G. sulfurreducens PCA细胞(50 mL, OD600=0.55)在4 ℃, 4000 r·min-1的条件下离心6 min.离心后的细菌使用磷酸盐缓冲溶液清洗2次, 缓冲溶液使用前用0.22 μm无菌滤膜过滤.混合培养时所有体系中的碳源均改为乙酸盐, 培养基所含成分为：KCl 0.1 g、NH4Cl 1.5 g、NaH2PO4 0.69 g、CaCl2 0.075 g、MgCl2·6H2O 0.1 g、维生素5 mL、微量元素12.5 mL、NaAc 13 mmol、KNO3 3.7 mmol(控制体系中C/N为6), 添加蒸馏水至1 L, 调整pH至7.0.消氧灭菌后, 将反硝化群落和G. sulfurreducens PCA利用乙酸盐共培养基重悬后, 控制所有菌液的OD600值相同(OD600=0.3).将反硝化与G. sulfurreducens PCA细菌共同培养的组别记为乙醇、丙酸以及葡萄糖实验组, 将只加入反硝化细菌或G. sulfurreducens PCA细菌的组别记为乙醇、丙酸、葡萄糖以及PCA对照组, 所有组别均重复3次.所有菌液置于30 ℃, 150 r·min-1的恒温摇床中进行培养, 按照相应时间间隔取样对培养基的OD600、NO3-、NO2-、NH4+指标进行测定.并在初始阶段, 体系中NO3-去除一半时以及体系中NO3-被基本去除时分别取样保存在-20 ℃环境中, 分别提取DNA进行生物相的测定.
2.3 微生物生物相群落结构分析方法通过选取接种的反硝化细菌以及不同组别中反硝化反应速率最快阶段以及反硝化反应结束阶段从悬浮菌液中提取DNA利用16S rDNA(16S ribosomal DNA)高通量测序技术进行生物相检测(梁晋刚等, 2018).使用土壤基因组DNA试剂盒(CW2091S, Com Win Biotech Co., Ltd., China), 按照说明指示提取DNA.将提取的DNA送往上海美吉生物医药科技有限公司进行PCR扩增.使用通用引物对16S rRNA的高变V3~V4区域进行测序, 包括正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)以及反向引物806R(5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′)(Yusoff et al., 2013), 随后在Illumina MiSeq平台上测定扩增子, 最后结果用R语言分析.
2.4 理化指标分析方法检测实验组及对照组体系中理化指标时3个平行样取平均值.NO3-的检测采用紫外分光光度法测定(DZ/T 0064.59-53), NO2-的检测采用Griess Reagent方法(Nithipatikom et al., 1996), NH4+的检测采用纳氏试剂比色法(詹晓燕等, 2010).细菌的生长状态通过菌体细胞密度进行估计, 通过紫外分光光度法测定OD600(王淡兮等, 2009).
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 不同共培养体系中NO3-、NO2-和NH4+值的变化如图 1所示, 在以乙醇、丙酸和葡萄糖作为外加碳源的实验组和对照组中硝酸根最终均得到有效去除, 其去除率均达到了94 %.在3种碳源的实验组以及对照组中, 均出现了一定程度的反硝化延迟现象, 表明在这一时间内随着培养基中碳源改变, 反硝化细菌需要一定的延迟时间来适应新的环境, 从而使细菌处于暂时的休眠状态, 或者造成了微生物群落的大规模演替.当以葡萄糖为外加碳源时, 在转移入共培养实验培养基时其反硝化阶段迟滞期(6~8 h)明显短于其他4组, 推测发生此现象可能的原因在于, 当使用葡萄糖作为外加碳源时, 可能在反硝化体系中出现中间产物乙酸, 从而使反硝化菌群中出现可以高效利用乙酸的反硝化细菌, 从而缩短了反硝化反应的迟滞期.此外, 在以乙醇为唯一外加碳源培养得到的反硝化细菌在同G. sulfurreducens PCA共同培养后, 其开始还原硝酸盐的时间相较乙醇对照组提前了3 h, 表明共生群落提升了反硝化群落适应环境中电子供体改变的能力.然而在以丙酸为碳源和以葡萄糖为碳源培养出的反硝化群落中, 并未出现此种对照组相较实验组滞后的现象.将丙酸为唯一碳源的反硝化群落和添加G. sulfurreducens PCA的反硝化共生群落相比时, 未出现反硝化提前和反硝化速率提升的现象.而在以葡萄糖为外加碳源的反硝化细菌和共生体系相比, 其发生反硝化的时间反而滞后了2 h.推测发生此现象可能的原因是, 在以丙酸和葡萄糖作为外加碳源培养的反硝化群落在驯化过程中, 可能会将乙酸作为一种中间产物, 群落中的部分细菌会利用乙酸进行反硝化反应.而在体系中加入G. sulfurreducens PCA后, G. sulfurreducens PCA会与这些以乙酸作为电子供体的细菌产生竞争关系, 抑制了这一部分细菌的活性, 从而抵消了一部分共生体系对反硝化的促进作用甚至延后了体系中反硝化进行的时间.
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| 图 1 不同共培养条件及对照组体系中NO3-(a)和NO2-(b)浓度变化 Fig. 1 Changes of nitrate(a) and nitrite(b)concentration in different co-culture conditions and control groups |
作为反硝化过程中的重要中间产物, 亚硝酸盐浓度的变化值得关注.亚硝酸盐的变化趋势与硝酸盐的去除趋势基本同步, 初始情况下, 在3组使用不同外加碳源进行驯化培养的实验组与对照组中检测出的亚硝酸盐含量分别为(0.39±0.024)、(0.76±0.029) μmol·L-1；(140±3.5)、(139±2.2) μmol·L-1；(192±0.4)、(184±0.87) μmol·L-1.在3种不同体系中NO3-未被反硝化转化的时间内, 没有检测到亚硝酸盐的含量增加.在反硝化反应进行过程中, 可以检测到共培养体系中亚硝酸盐开始积累, 当以乙醇为外加碳源时, 其实验组与对照组中在27 h亚硝酸盐分别达到最大值(224±19) μmol·L-1及(306±5.1) μmol·L-1；当利用丙酸作为外加碳源时, 实验组和对照组分别在18 h和15 h亚硝酸盐达到最大值(608±10) μmol·L-1和(672±11) μmol·L-1；当反硝化体系中以葡萄糖为外加碳源时, 其在9 h亚硝酸盐含量分别达到(654±36) μmol·L-1和(668±2.5) μmol·L-1, 而后逐渐被去除.乙醇实验组中产生的亚硝酸根含量仅为丙醇及葡萄糖实验组的48%.同时乙醇实验组及对照组中的亚硝酸根峰值含量相对其他组别较低, 这表明如果使用乙醇作为外加碳源, 其对环境及人体产生的危害相对最低.
本实验中对不同体系中的NH4+浓度进行监测, 如图 2所示.观察到其中NH4+浓度在实验进程中略有降低, 说明实验过程中共培养体系中主要进行的是反硝化过程, 而非DNRA过程.目前在已知的氮素循环途径中, 只有生物反硝化作用能够将体系中的硝酸盐完全将氮元素还原为气体从而脱离原体系, 对氮元素的处理更加有利.
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| 图 2 不同外加碳源共培养条件及对照组体系中NH4+浓度变化 (a.乙醇, b.丙酸, c.葡萄糖) Fig. 2 Changes of ammonia concentration using different external carbon sources in co-culture conditions and control groups (a. ethanol, b. propanoic acid, c. glucose) |
通过控制反硝化细菌和G. sulfurreducens PCA的接种比例以使不同组别的OD600初始值在0.3左右, 保持不同组别细菌初始生长状况相同.在只加入G.sulfurreducens PCA的培养基中, OD600值逐渐下降, 这表明其不能适应在该条件下生存, 这也印证了其无法代谢体系中的硝酸根的报道(Wan et al., 2018).而在其他共生体系以及只加入不同碳源培养的反硝化群落中, OD600的峰值往往出现在体系的反硝化过程中.同时在乙醇和丙酸实验组与对照组中也出现了3~6 h和8~9 h的迟滞时间, 这与上节中反硝化反应进程的迟滞期一致, 进一步说明反硝化微生物群落需要一定时间来适应培养基体系中碳源的变化.而在当以乙醇作为反硝化外加碳源时, 共生菌群的OD600值的增加速度比只加入反硝化细菌的对照组快, 其平均增长速率为对照组的1.24倍, 同样其峰值(0.51±0.014)也高于对照组(0.48±0.022), 表明在以乙醇作为外加碳源驯化反硝化细菌进行共培养能够促进反硝化过程相对快速启动.
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| 图 3 不同共培养组及对照组OD600变化情况 Fig. 3 Changes of OD600 in different co-culture conditions and control groups |
抽平后的样品序列数、覆盖度、物种多样性Shannon指数、Simpson指数及物种总数估计指数Ace和Chao见表 1, 其中Eth-0、Pro-0、Glu-0分别代表以乙醇、丙酸、葡萄糖作为碳源驯化的反硝化群落；E-G-24、E-G-36、Eth-24、Eth-36分别代表G. sulfurreducens PCA与以乙醇驯化的反硝化细菌共培养以及反硝化细菌单独培养24 h和反硝化终止时的群落；P-G-12、P-G-24、Pro-12、Pro-24分别代表G. sulfurreducens PCA与以丙酸驯化的反硝化细菌共培养以及反硝化细菌单独培养12 h及24 h的群落；G-G-6、G-G-24、Glu-6、Glu-24分别代表G. sulfurreducens PCA与以葡萄糖驯化的反硝化细菌共培养以及反硝化细菌单独培养6 h及24 h的群落.所有样本的Coverage值均在0.998以上, 证明了本次样品测序的真实性.在以葡萄糖为外加碳源时, 共培养下物种总数(OTU)相对对照组较低, 体系中的物种多样性较低, 异于另外两种外加碳源, 表明在加入G. sulfurreducens PCA后, 原有反硝化菌群体系中的多样性受到抑制, 部分能够利用乙酸及更复杂中间产物作为反硝化碳源的微生物生长受到抑制.同时在以葡萄糖为外加碳源时, 共培养下样本的各物种(OTU)的相对丰度的差异性相较初始状态更小, 体系中的物种均一性相较初始状态更佳, 表明在该情况下加入G. sulfurreducens PCA后, 体系中原有的不同反硝化细菌及G. sulfurreducens PCA相对丰度差距更小, 异于另外两种外加碳源.
| 表 1 不同外加碳源下微生物群落样本Alpha多样性指数分析 Table 1 The Alpha diversity index analysis of the microbial communities with different external carbon sources |
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本实验中选定的主成分对样本的组成差异的贡献值为78%.当使用乙醇为反硝化碳源时, 是否添加G. sulfurreducens PCA对菌群结构影响相对较小.而当以丙酸作为外加碳源时, G. sulfurreducens PCA共培养的细菌菌群与未添加Geobacter的反硝化菌群相比, 其组成差异变化相对较大, 推测在体系中加入G. sulfurreducens PCA以及改变培养体系的碳源后, 抑制了其中原有的部分依靠丙酸作为碳源生长的微生物, 而使不同样本中微生物物种的相对丰度出现了较大变化.
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| 图 4 微生物群落样本主成分分析结果 Fig. 4 The sequence of the Principal Component Analysis of the microbial community samples |
对选取的15个不同样本进行了微生物群落结构属水平上的分析, 如图 5所示, 其中体系中能够进行反硝化作用的细菌使用斜线标识.在未加入PCA细菌的由乙醇驯化的反硝化细菌群落中, 系统中的优势菌有Acinetobacter(不动杆菌属), Dechloromonas(脱氯单胞菌属), Cloacibacterium(黄杆菌科).其中Acinetobacter中包含有nirS基因, 该菌具有反硝化并降低体系中所含Ca2+的能力(Jun et al., 2017), Dechloromonas属可以利用硝酸盐氮作为电子受体矿化有机物, 是一种典型的反硝化细菌, 常见于脱氮除磷系统中(Coates et al., 2001；Shu et al., 2015；Wang et al., 2016).将利用乙醇驯化得到的反硝化微生物群落转移到以乙酸盐为碳源的培养基内, 通过24 h的共培养发现在其中Acinetobacter的相对丰度出现了下降, 但其仍是群落中的优势菌种, 当与PCA进行共培养24 h时, Brachymonas(短单胞杆菌属)在体系中的相对丰度从原有的0.25%上升到25%, 但当体系中反硝化反应基本结束时, 其相对丰度比例又降低为1.3%, Brachymonas中包含有nirS基因, 具有反硝化脱氮的性能(李敬源等, 2012), 推测其原因为在反应进行到24 h时, 体系中的亚硝氮含量相对较高, 而Brachymonas具有nirS基因可以转化体系中的亚硝氮.经过比较发现在24 h时共培养组中的能够进行反硝化反应的细菌比例高于同时间段的单独培养组(相对丰度比例为74%和49%), 这与共培养组的反硝化反应进行时间快于单独培养组的实验结果相吻合.同时在培养体系中反硝化菌群在此培养体系中处于相对优势地位.表明在该培养体系中, G. sulfurreducens PCA的加入能够提升反硝化细菌的相对丰度.
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| 图 5 不同微生物群落样本属水平群落相对丰度 Fig. 5 Distribution statistics of different microbial community samples at genus level |
在利用丙酸驯化得到的反硝化菌转移至新培养基中时, 可以发现其中的共培养组中的G. sulfurreducens PCA含量达到51%, 这与初始加入的PCA比例近乎相同, 证明在该培养条件下G. sulfurreducens PCA能够通过竞争从而处于体系中的优势种.共培养组中的反硝化细菌相对丰度值在所测时间段分别为13%和10%, 相较单独培养对照组的18%和26%相比相对丰度较小, 这可能与初始接种时的相对比例(反硝化菌：G. sulfurreducens PCA =1:1)较低有关, 在这一共培养体系中, 起主要反硝化作用的亦是Acinetobacter和Dechloromonas.相较对照组而言, 共培养组中反硝化菌群的相对丰度虽然较低, 但是其反硝化反应进行的时间并没有出现相对滞后现象, 推测可能是在该体系中与G. sulfurreducens PCA的共同培养相对提升了体系中反硝化菌群消耗体系中氮素的速度, 从而避免了滞后现象的发生.
当使用葡萄糖作为外加碳源驯化反硝化细菌时, 体系中的优势菌属为Klebsiella(克雷伯氏菌属)、Enterococcus(肠球菌属)、Acinetobacter(不动杆菌属)和Tolumonas(甲苯单胞菌属).Li等在制革废水中纯化得到Klebsiella, 经研究发现其包含有硝酸盐还原酶以及亚硝酸盐还原酶, 表明其具有将体系中的硝态氮转化为N2脱离体系的能力(Li et al., 2019).Heylen等的研究表明Enterococcus中含有nirK和norB基因, 能够参与反硝化过程(Heylen et al., 2007).但当与G. sulfurreducens PCA在更换碳源的条件下进行共同培养后, 初始状态中占据相对优势的Klebsiella和Enterococcus的相对丰度分别下降到5%及未检出.同时发现在对照组与共同培养实验组中, Rhodocyclaceae(红环菌科)与Acinetobacter是体系中的优势反硝化菌株(Saito et al., 2008；Tian et al., 2015), 体系中的反硝化菌群的相对比例虽并未发生明显改变, 由于接种比例的不同, G. sulfurreducens PCA亦能提升体系中反硝化细菌的相对丰度, 促进反硝化细菌的生长.但在实验过程中共同培养实验组的反硝化反应迟滞时间相对较长, 推测可能是与G. sulfurreducens PCA同反硝化群落竞争体系中的乙酸盐碳源有关.
4 结论(Conclusions)1) 以乙醇为外加碳源培养的反硝化微生物群落与G. sulfurreducens的共培养可加速硝态氮的去除并减小亚硝氮的积累, 以葡萄糖为外加碳源驯化得到的反硝化微生物群落能够更快的适应碳源的改变, 减少体系中反硝化反应的滞后时间.
2) 观察微生物群落结构变化发现, 与G. sulfurreducens PCA的共培养相对提高了反硝化细菌的相对丰度, 使其能够适应因碳源改变而产生的对反硝化细菌的生长抑制现象.
3) 在使用一些复杂有机物例如葡萄糖进行培养时, 可能会因反应中间产物较为复杂而产生底物竞争现象导致反应出现迟滞现象.
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