2019, Vol. 39
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石油、化工、制药等行业的发展产生了大量的含氮含酚废水, 如不处理直接排放将会对环境产生严重危害.含氮废水容易造成水体富营养化, 引起恶臭、pH异常等问题, 严重破坏水生生态系统(Yan et al., 2019)；而对甲酚、苯酚等酚类物质排放到水体后大量消耗溶解氧, 破坏水体氧平衡, 且由于其具有强毒性、易致癌、致突变等特性, 还会造成水生生物大量死亡(Balachandran et al., 2016).因此, 寻求此类废水的处理技术一直是国内外废水处理领域的研究热点.
现有含氮含酚废水的处理大都采用分别处理的技术.在众多的生物脱氮技术中, 厌氧氨氧化反应因具有处理效率高、能耗少、不需要有机碳源、无N2O二次污染物等特点, 被誉为目前最具有应用潜能的脱氮技术(Kartal et al., 2013).然而, 该技术在应用时需要以亚硝酸盐氮作为电子受体, 而目前实现NO2-累积的工艺大都存在运行不稳定的缺点, 使得厌氧氨氧化规模化应用存在障碍.
废水中酚类物质可分别在好氧和厌氧条件下被去除.好氧条件下, 微生物能够以O2为电子受体, 将酚类物质氧化为CO2(Chakraborty et al., 2010)；而在厌氧条件下, 通过产甲烷或共代谢将酚类物质转化(Wang et al., 2015).研究发现以对甲酚作为碳源进行反硝化时, NO2-可在体系内瞬时累积(Thomas et al., 2002).这为对甲酚、硝酸盐和氨氮的同步去除提供了可能.基于此, 本研究采用UASB反应器探索了不同进水浓度和HRT条件下, 对甲酚、氨氮和硝酸盐3种污染物同步去除的效果, 并结合高通量测序技术, 解析了3种污染物同步去除过程中的关键微生物, 研究结果有利于开发新型的含氮含酚废水工艺.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验装置本实验采用改进的UASB反应器(Liu et al., 2017), 反应区内径5 cm, 高80 cm, 有效容积1.57 L, 总容积2.3 L.反应器从底部进水, 出水经三相分离器固液分离后大部分回流至反应器底部, 少部分排放.反应器回流比为30:1.反应器外部设有水浴区, 保持温度恒定在(30±1) ℃.反应器顶部设有出气口, 出气经碱液吸收后排放.
2.2 接种污泥和实验用水反应器接种污泥为反硝化污泥和厌氧氧化污泥的混合污泥, 二者体积混合比为1:3；混合污泥SS和VSS分别为26.12 g·L-1和15.94 g·L-1.初始污泥接种量为600 mL.实验用水采用人工配水, NO3-由KNO3提供, NH4+-N由NH4Cl提供, 对甲酚提供有机碳源, 进水pH为7.5, 并投加1.25 mg·L-1微量元素(Liu et al., 2016), 用以微生物的生长.
2.3 理化指标分析方法NO3-和NO2-的测定采用离子色谱法(Lai et al., 2018); N2O的测定采用气相色谱法(Lai et al., 2018); NH4+-N的测定采用纳氏试剂比色法(詹晓燕等, 2010); 对甲酚的测定采用4-氨基安替比林分光光度法(APHA, 2005); pH测定采用分光光度计; SS、VSS等测定采用常规分析方法(APHA, 2005).
2.4 微生物分析方法反应器运行的不同阶段取泥, 保存于-80 ℃冰箱内用于16S rDNA高通量测序分析.污泥DNA提取采用土壤基因组DNA提取试剂盒(MoBio, Carlsbad, CA, USA).以纯化后的DNA为模板, 采用细菌16S rDNA V3~V4区PCR扩增引物为通用引物, 对基因进行扩增.正向引物为338F(5′-ACTCCT ACG GGA GGC AGC AG-3′), 反向引物为806R(5′-GGACTA CHV GGG TWT CTA AT-3).扩增条件为：95 ℃预变性2 min, 95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 30个循环, 最后72 ℃延伸5 min.随后在Illumina MiSeq(美吉, 上海)平台上测定扩增子.对测得所有序列进行OUT划分, 基于97%的相似性生成OUT表格, 并构建稀释曲线.应用Mothur软件计算多样性指数.使用tax_summary_a文件夹中的数据表, 在不同分类学水平上统计样品本的物种比例和分布.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 底物浓度的影响在水力停留时间为12 h, 硝酸盐、氨氮和对甲酚质量比为1:1.24:1.03条件下, 逐渐增加进水硝酸盐浓度由53 mg·L-1(阶段Ⅰ)到63 mg·L-1(阶段Ⅱ)和73 mg·L-1(阶段Ⅲ)过程中, 3种污染物的去除效果如图 1所示.
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| 图 1 硝酸盐、对甲酚和氨氮的同步去除效果 Fig. 1 Simultaneous removal of nitrate, p-cresol and ammonium in a UASB reactor |
由图可知, 随着进水底物浓度逐渐的增加, 硝酸盐去除率由初始的87%(阶段Ⅰ), 逐渐增加到94%(阶段Ⅱ)和100%(阶段Ⅲ), 且出水无亚硝酸盐和N2O, 表明系统硝酸盐去除效果较好, 且几乎全部转化为N2.对甲酚去除率则在整个实验过程中变化不大, 基本稳定在95%左右.然而, 氨氮去除率在前两个阶段稳定在90%, 表明此时氨氮去除效果较好.当进水基质(阶段Ⅲ)进一步增加时, 氨氮去除率下降至73%.这可能是由于此时的对甲酚对厌氧氨氧化微生物具有毒害作用, 使得厌氧氨氧化微生物代谢活性下降, 进而影响系统氨氮去除率.整体上, 硝酸盐、氨氮和对甲酚3种污染物能够在一个反应器内同步去除, 且无N2O等二次污染物质.
由于实验过程中去除的NO3--N和NH4+-N几乎转化为N2, 若去除的对甲酚全部转化为CO2, 进行电子平衡分析, 结果见表 1.此时, 去除的氨氮和对甲酚所提供的电子数远远大于电子受体硝酸盐所能够接受的电子数, 可见, 在本实验中去除的对甲酚并未完全矿化.尽管Mahdavianpour等(2018)采用厌氧折流板反应器进行NO3--N作为电子受体的反硝化条件处理甲酚废水时, 发现对甲酚几乎可完全矿化, COD去除率高达95%.在本实验中对甲酚没有矿化可能是进水NO3--N与对甲酚的比例较低导致的.在以后的实验中有必要探讨下不同NO3--N与对甲酚比例条件下, 反应器硝酸盐、对甲酚和氨氮的同步去除效果.
| 表 1 对甲酚矿化情况下的电子转移分析 Table 1 Electron transfer when at p-cresol mineralization condition |
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在进水硝酸盐、氨氮和对甲酚浓度保持在63、78和65 mg·L-1的条件下将HRT由12 h(阶段Ⅰ), 逐渐降低到8 h(阶段Ⅱ)、6 h(阶段Ⅲ)和4 h(阶段Ⅳ), 考察HRT对UASB反应器硝酸盐、氨氮和对甲酚同步去除的影响(图 2).
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| 图 2 HRT对对甲酚、硝酸盐和氨氮去除效果的影响 Fig. 2 Effect of HRT on the removal of p-cresol, nitrate and ammonium |
从图 2可以看出, HRT的降低并未对NO3-的去除产生明显影响, 整个实验过程中其去除率一直稳定在94%左右.HRT为12 h和8 h时, 对甲酚的去除率稳定在95%左右.当HRT进一步降低到6 h和4 h, 其去除率略微下降至93%, 整体上受HRT影响不大.然而, HRT对系统氨氮的去除影响较大.随着HRT由12 h降低至8、6和4 h, 氨氮去除率也由90%左右降低到75%、62%和45%.这可能是由于HRT的缩短, 使得进水负荷增加, 进而影响厌氧氨氧化菌的代谢.整体上, 在硝酸盐、氨氮和对甲酚的负荷小于0.189、0.234和0.195 kg·m-3·d-1时, 系统3种污染物的去除稳定在92%, 75%和93%以上, 负荷进一步增加会对厌氧氨氧化菌生成抑制, 使得其去除率迅速下降.
3.3 关键微生物类群采用高通量测序技术对反应器不同进水浓度条件下污泥样品进行测序解析.抽平后的样品序列数、覆盖度、Shannon指数、Simpson指数、Ace指数和Chao指数见表 1.
| 表 2 物种多样性指数分析结果 Table 2 The Alpha diversity index analysis of the microbial communities in this study |
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所有样本的覆盖率均在99.99%以上, 证明了本次样品测序的真实性.硝酸盐、氨氮和对甲酚浓度为53、66、55 mg·L-1 (阶段Ⅰ)和63、78、65 mg·L-1 (阶段Ⅱ)反应器污泥内的物种总数(OTU)相接近, 而3种污染物浓度为73、91、75 mg·L-1 (阶段Ⅲ)的物种数相对下降.同时多样性指数结果表明, 此阶段的物种多样性也略低于阶段Ⅰ和阶段Ⅱ.
对3个样品进行了微生物群落结构在门水平和属水平的分析(图 3).从图 3a可知, 污泥样品共测得9个门的微生物, 分别为Chloroflexi、Planctomycetes、Acidobacteria、Proteobacteria、Chlorobi、Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia, 其中Chloroflexi、Planctomycetes、Acidobacteria、Proteobacteria在反应运行的3个阶段均为优势门类, 所占比重分别为41.38%、8.05%、11.93%、16.09%(阶段Ⅰ), 47.99%、7.50%、10.63%、15.14%(阶段Ⅱ)和47.90%、16.44%、7.89%、13.33%.
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| 图 3 不同微生物群落样本门水平(a)和属水平(b)群落相对丰度 Fig. 3 Distribution of different microbial community samples at phylum level (a) and genus level (b) |
从微生物群落结构在属水平上的分布图(图 3b)可知, 主要的微生物为noranc-c-SBR2076、Bacillus、Candidatus Kuenenia、Anaerolineaceae、norank_f_SJA-28、Simplicispir、norank_o_JG30-KF-CM45、Caldilineaceae、Termeomonas、Chryseobacterium、Ardenticatenia、Phycisphaeraceae、Comamonas和Candidatus Brocadia.其中, 主要的Bacillus为异养反硝化微生物, 能够以对甲酚为电子供体还原硝酸盐为氮气(Verbaendert et al., 2011).在本实验中期主要作用是以对甲酚为电子供体, 将NO3-还原为NO2-.Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia为典型的厌氧氨氧化微生物(Ma et al., 2013; Miao et al., 2016), 其在系统中的作用为以进水中的氨氮为电子供体, 以生成的亚硝酸盐为电子受体将氨氮氧化为N2.在实验运行的3个阶段, Bacillus的丰度分别为7.25%、6.62%和15.96%；而Candidatus Kuenenia的丰度则是12.12%、12.15%和9.62%；Candidatus Brocadia的丰度分别为1.3%、0.91%和0.48%；可见, 随着进水浓度增加, Bacillus的丰度逐渐增加, 而厌氧氨氧化菌Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia逐渐下降, 进一步说明进水对甲酚浓度对厌氧氨氧化菌的抑制作用.
4 结论(Conclusions)1) 采用UASB反应器, 以反硝化和厌氧氨氧化耦合污泥为接种污泥, 温度为30 ℃, HRT为12 h, 进水对甲酚、硝酸盐和氨氮浓度分别为73、91和75 mg·L-1的条件下, 能够同步去除3种污染物, 且去除率分别在95%、100%、73%以上, 去除的硝酸盐和氨氮大部分转化为N2, 但去除的对甲酚并未完全矿化.
2) HRT由12 h逐渐降低到4 h的过程中, 硝酸盐和对甲酚去除率变化不大, 仍保持在95%和93%以上, 但氨氮去除率却由95%降低到45%, 说明过高的进水负荷对厌氧氨氧化菌有抑制作用.
3) 在对甲酚、硝酸盐和氨氮同步去除过程中, 主要的反硝化微生物为Bacillus, 主要的厌氧氨氧化微生物为Candidatus Kuenenia, 二者的协同作用为3种污染物的同步去除提供了有力保障.
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