2019, Vol. 39
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微生物在水体氮元素循环中具有关键性的作用(董志颖等, 2018).微生物转化氮元素的过程包括分解代谢与合成代谢, 前者首先通过氨化作用将有机氮降解为氨氮和脂肪酸等, 其次利用亚硝化、硝化作用, 将氨氮依次转化为亚硝酸氮和硝酸氮, 再经过反硝化细菌进行脱氮作用将硝酸氮转化为气体氮等, 最终使氮元素从水体中除去, 而合成代谢则通过氨氮的同化作用合成微生物自身蛋白(乐毅全等, 2011; 雷衍之, 2015; 刘健康, 2005).作为氮转化的第一个环节, 有机氮氨化降解生成的氨氮为微生物合成蛋白、生长繁殖提供原料, 脂肪酸进入三羧酸循环为微生物的生长提供三磷酸腺苷(ATP), 因而是氮循环过程中最重要的一步, 对有机氮输入性水体中的氮循环具有重要意义(乐毅全等, 2011).
研究表明, 芽孢杆菌具有蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶活性等多种活性(高权新等, 2013), 能够有效促进水体有机氮的转化, 如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、腊样芽孢杆菌(B. cereus)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、坚强芽孢杆菌(B. firmus)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)等已广泛应用于水质调控(张庆华等, 2011; 闫法军等, 2013; Ferreira et al., 2015; Luo et al., 2016; 周国庆等, 2016; Rafael Martinez-Cordova et al., 2017; Ferreira et al., 2017).有些水体, 如养殖水体, 由于人工配合饲料的投入, 积累了较多的饲料(残饵)蛋白等有机氮(Fungesmith et al., 1998; 齐振雄等, 1998), 如果大量排放会对生态环境造成不利影响(冯敏毅等, 2006).但与微生物培养基相比, 养殖水体的营养水平较低, 属于低营养水体(邹万生等, 2011), 使用芽孢杆菌等进行处理时, 其效果可能受到影响, 主要是因为芽孢杆菌的生长和功能的发挥需要一定的营养, 如氮源、碳源等, 如果营养水平较低, 将停止生长, 并形成芽孢进入休眠状态.因此, 研究低营养水体中芽孢杆菌对有机氮的降解, 具有较高的实际指导意义.然而, 目前这方面受到的关注却比较少.
影响芽孢杆菌生长及功能发挥的因素较多, 除了氮源、碳源、碳氮比(C : N)等营养因素外, 也与菌种本身的特性, 如来源、接种量、增殖能力等有关(Arrigo, 2005; 康鹏亮等, 2018).本文通过模拟凡纳滨对虾中间培育过程配制低营养水体, 研究接种不同芽孢杆菌后水体总菌量的变化与有机氮降解情况, 以及水体总菌量、总菌增量和有机氮含量等对有机氮降解的影响, 并构建数学模型, 分析促进有机氮降解的方法, 以期为芽孢杆菌在低营养水体中的应用提供指导和借鉴.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 菌种菌株NT9(GenBank accession No. KX891556)从传统发酵食品腊八豆中分离获得, 为一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；菌株YB3(GenBank accession No. KX578018)为一株蜡样芽孢杆菌(B. cereus), 从养殖水体分离得到, 是EM菌制剂的有效菌种之一(黄海洪等, 2018)；两种菌株均为环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室保藏菌种.
2.2 培养基LB培养基参照文献(沈萍等, 2013)的方法配制, 并稍作修改.具体为：大豆蛋白胨(生化试剂)10.0 g, 酵母粉(生化试剂)5.0 g, 葡萄糖(分析纯)10.0 g, NaCl 5.0 g, 水1000 mL, pH=7.0, 固体培养基添加琼脂粉12.0 g.
2.3 低营养水体的配制 2.3.1 水体制备模拟凡纳滨对虾中间培育过程(麦贤杰等, 2009)配制低营养水体.用9个200 L塑料桶分别装入100 L自来水(pH=7.20), 用碳酸氢钠将pH调至8.00, 并用海盐将盐度调至18‰, 用10 mg · L-1二氧化氯消毒, 24 h后用维生素C(1 mg · L-1)中和、解除毒性(Lara et al., 2017; Prata Gaona et al., 2017), 备用.凡纳滨对虾配合饲料(粗蛋白40%、粗脂肪5.0%、粗纤维5.0%、粗灰分15%、水分12%, 大海水产饲料有限公司, 珠海)粉碎, 过100目筛, 投入上述水体, 试验前3 d的投喂量为2.0 g · d-1, 其他时间均为1.0 g · d-1, 第8 d和20 d未投喂, 试验周期为24 d, 总共投入饲料25.0 g.试验期间不换水, 使用气石不间断充气.
2.3.2 菌株培养和接种菌株NT9和YB3分别接种于LB液体培养基, 在30 ℃、150 r · min-1下培养24 h, 制备种子液.种子液按1 : 100的比例转接到新鲜的LB液体培养基, 在30 ℃、150 r · min-1下培养24 h, 制备培养液.将200 mL培养液在12000 r · min-1、4 ℃下离心10 min, 沉淀用0.6%无菌生理盐水洗涤, 重悬, 添加到低营养水体中, 使水体起始总菌量为1.0×106 cfu · mL-1, 分别称为NT9水体和YB3水体, 每种菌接种3个水体, 以未接种的3个水体为对照水体.
2.4 水质测定水体氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮每周测定一次, 按照文献(国家环境保护总局, 2002)所述方法进行.总菌量每周测定一次, 每种水体的3个平行水样各采集5 mL, 混合, 作为该水体的代表水样, 用LB固体培养基进行平板计数(沈萍等, 2013).
2.5 有机氮降解测定 2.5.1 降解率本次试验有机氮的主要来源是饲料蛋白氮, 最终降解为氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮, 一部分氨氮又经合成代谢转化为微生物蛋白(乐毅全等, 2011), 因此, 有机氮降解率可按下式计算：
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(1) |
如果水体中亚硝化、硝化和反硝化作用及合成作用均很弱, 则：
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(2) |
式中, Rd为有机氮降解率, ΔρTAN-N、ΔρNO2-N、ΔρNO3-N和ΔρMPro-N分别为试验结束与开始时的氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮和微生物合成蛋白浓度的差值(mg · L-1), kTAN-N、kNO2-N、kNO3-N和kPro-N分别表示上述4种物质中氮元素的百分含量.氨氮是离子态氨(NH4+-N)和分子态氨(NH3-N)的总称, 氮百分含量分别为77.78%和82.35%, 两种物质的比例与水体pH有关, 在本试验pH(8.00)条件下, 其所占比例分别为94.62%和5.38%(Lekang, 2013; 雷衍之, 2015), 因此, 可计算得kTAN-N值为78.03%(下同).ρF-N表示饲料蛋白氮累积投入量(mg · L-1), 计算方法如下所示：
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(3) |
式中, F为饲料累积投喂量(g), kF-N和kP-N分别表示饲料蛋白质含量和蛋白质中氮的百分含量, 分别为40%(大海水产饲料有限公司, 珠海)和16%(麦康森, 2015), VW为水体体积(100 L), 由此可得：
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(4) |
将kTAN-N值及式(4)代入式(2), 可得：
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(5) |
有机氮降解速率计算公式如下：
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(6) |
式中, Sd为有机氮降解速率(mg · L-1 · d-1)；ΔρTAN-N为试验结束与开始时水体氨氮浓度变化(mg · L-1)；T为试验周期(24 d), 与kTAN-N一起代入式(6)可得：
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(7) |
为了比较不同水体的有机氮降解能力, 计算相对降解效率：
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(8) |
当i=j时, 则计算绝对降解效率：
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(9) |
式中, ΔρTAN-N和lgc分别指整个试验期间水体氨氮浓度变化值和总菌量(经对数(log10, lg)转换)平均值；wi和wj分别为相比较的2个水体；Er为相对降解效率；Ea为绝对降解效率, 表示单位菌量的有机氮降解量(mg · L-1).
2.6 有机氮降解模型的构建将24 d的试验周期分成6个阶段, 每个阶段为4 d, 以各阶段氨氮的产生量计算有机氮的降解量, 作为因变量：
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(10) |
式中, ρd-org-Ni表示某一试验阶段被降解的饲料蛋白氮(mg · L-1)；ΔρTAN-Ni为该阶段氨氮产生量(mg · L-1)；i为时间阶段, 用终止时间点表示, 如4、8、12、16、20和24 d分别表示0~4、4~8、8~12、12~16、16~20和20~24 d试验阶段(下同).
以4个可能影响有机氮降解的因素作为自变量, 其中, 总菌量(c, cfu · mL-1)用各阶段起始总菌量的对数(lg)转换值表示, 表示参与有机氮降解的微生物的基数；总菌增量(Δc, cfu · mL-1)为各阶段总菌量的变化, 代表微生物的增殖量；时间(t, d)即试验阶段, 用终止时间点表示, 如4、8、12、16、20和24 d, 代表微生物的生长阶段, 与微生物活力即降解能力相关, 也在一定程度上反映了营养物质的消耗情况；有机氮含量(n, mg · L-1)为前期各阶段有机氮存量与本阶段投入量之和, 代表水体的氮源含量, 计算方法如下：
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(11) |
式中, n表示各试验阶段的有机氮含量, i为试验阶段, f为各试验阶段饲料有机氮累积投入量, r为各试验阶段有机氮的累积降解率.当i=4, YB3降解率为120.53%, 大于100%, 按100%计算, 此时fi-4和ri-4分别表示试验开始时的有机氮累积投入量和累积降解率, 均为0.
采用式(12)的数学模型对因变量和自变量进行多元回归分析：
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(12) |
式中, yd表示各试验阶段的有机氮降解量(mg · L-1)；x1为总菌量(cfu · mL-1)；x2为总菌增量(cfu · mL-1)；x3为有机氮含量(mg · L-1)；x4时间(d)；e表示误差项.
2.7 水体微生物增殖模型的构建以总菌增量(Δc)为因变量, 总菌量(c)、有机氮含量(n)和时间(t)为自变量, 按照式(13)构建低营养水体中微生物增殖的数学模型.
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(13) |
式中, yg表示总菌增量(cfu · mL-1)；x1为总菌量(cfu · mL-1)；x2为有机氮含量(mg · L-1)；x3为时间(d)；e表示误差项.
2.8 数据分析除了水体总菌量为样品混合后的单一数据外, 其它数据均为有重复的测定数据, 以平均值±标准差的形式表示.采用SPSS 16.0软件进行数据正态性和方差齐性检验, 之后进行单因素方差分析(One-Way ANOVA), 若差异显著(p < 0.05), 则进行Tukey多重比较.百分数形式的数据进行平方根反正弦转换, 总菌量进行对数(lg)转换.不服从方差齐性的数据采用Kruskal-Wallis Test进行非参数检验.Pearson相关分析、偏相关分析及多元回归分析调用Regression的Linear程序, 用stepwise方法进行.
3 结果(Results) 3.1 水体中微生物数量变化从菌落数量变化来看, NT9水体接种菌株后一直下降然后趋于稳定, 而YB3水体则具有较大幅度的增加, 随后才开始回落, 对照水体具有与YB3水体相似的变化趋势, 但最终趋于稳定并与NT9水体的数量相当, 均低于YB3水体(图 1a).从总菌量对数转换值(lgc)来看, NT9水体依然呈下降趋势, 但YB3水体的增长不明显, 基本保持稳定, 而对照水体的增加幅度则比较大, 最终也与NT9水体处于相同的数量级, 并低于YB3水体(图 1b).总菌量的变化在一定程度上反映了微生物蛋白的合成情况, 因此, NT9水体蛋白合成较少, YB3水体和对照水体试验前期(0~12 d)有一定的合成量, 但后期也较小(12~24 d).
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| 图 1 3种低营养水体总菌数量(a)及其对数值(b)变化 Fig. 1 Colony forming units (a) and its logarithm(b) in three different water bodies |
试验期间各水体有机氮累积投入量(以N计)随着饲料的投入不断升高, 最后达到16.00 mg · L-1(图 2a).与此同时, 对照水体、NT9水体和YB3水体氨氮浓度也均呈现上升趋势, 至24 d分别达到(7.11±0.06)、(11.54±0.38)和(15.57±0.37) mg · L-1(图 2b), 但亚硝酸氮和硝酸氮浓度差异不显著(p>0.05), 且总体保持稳定(图 2c和图 2d).回归分析显示, 水体氨氮浓度与总氮累积投入量具有极显著的线性关系(R2≥0.8779, p < 0.0001, 图 2e), 表明试验期间主要发生氨化作用, 硝化和亚硝化作用均不强烈, 投入水体的饲料氮降解后主要以氨氮的形式存在, 亚硝酸氮和硝酸氮可以忽略不计.
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| 图 2 3种低营养水体中有机氮投入及降解 Fig. 2 Organic nitrogen addition and degradation in three low nutrient water bodies |
鉴于水体亚硝酸氮和硝酸氮浓度变化比较小, 总菌增量也不大, 本次试验根据式(2)计算有机氮降解率, 并依据氨氮浓度的变化进行相关研究.对照水体、NT9水体和YB3水体有机氮的降解速率分别为0.23、0.38和0.51 mg · L-1 · d-1, 其中, NT9水体和YB3水体比对照水体分别加快65.22%和121.74%.图 2f显示, 试验期间NT9水体和YB3水体的有机氮降解率均在第4 d达到最高, 然后下降并趋于稳定, 其中, YB3水体的峰值为120.53%±1.79%, 之后下降到24 d的最低值75.29%±1.82%, NT9水体则从第4 d的77.28%±2.12%下降到第24 d的54.66%±1.82%.与此不同, 对照水体先由第4 d的34.44%±8.01%上升到最高值(第12 d的46.85%±5.20%), 再下降到第24 d的34.56%±0.29%.总体来看, 试验期间YB3水体降解率平均达86.80%±9.90%, NT9水体为59.45%±7.63%, 均显著高于对照水体的39.56%±5.93%(p < 0.05), 分别提高50.28%和119.41%, 表明芽孢杆菌能够促进低营养水体有机氮的降解.
3.2.3 有机氮降解效率本次试验通过绝对降解效率即有机氮降解量与水体总菌量的比值(式(8)和(9)), 对菌株的降解能力进行比较.由表 1可知, YB3水体的绝对降解效率最高, NT9水体次之, 对照水体最低.相对降解效率为2种水体的有机氮降解量差值与总菌量差值的比值, 如果大于1, 表明某一水体单位菌量降解有机氮的速度快于被比较的水体, 降解效率较高, 反之则降解效率低.表 1显示, NT9水体、YB3水体与对照水体比较的相对降解效率均大于1, 说明其降解效率高于对照水体, 也表明接种芽孢杆菌有利于低营养水体有机氮的降解.
| 表 1 水体有机氮的降解效率 Table 1 Degrading efficiencies of three water bodies |
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表 2结果显示, NT9水体有机氮降解量与总菌量(c)、总菌增量(Δc)、有机氮含量(n)和时间(t)等4个自变量的Pearson相关关系和偏相关关系均不显著(p>0.05), 对照水体和YB3水体具有显著的相关关系(p < 0.05或p < 0.01), 但大多数的偏相关关系均不显著(p>0.05).相关系数表示两个变量间总的相关关系, 偏相关系数是指除去其它因素影响后两个变量间的相关关系(明道绪, 2014).因此, 上述结果表明, 有机氮降解量与4种因素可能存在非线性的关系, 或因素之间存在交互作用(表 3).除此之外, 表 4也显示, 3种水体中4个因素之间均具有显著的相关关系(p < 0.05或p < 0.01), 说明自变量之间存在共线性的问题, 因此, 多元回归分析采用stepwise方法进行, 以减小共线性的影响(万崇华等, 2014).式(14)~(16)显示, 3种水体有机氮降解模型均达到显著水平(p < 0.05), 所有参数的系数均显著或极显著(表 5), 决定系数(R2)都在0.94以上, 能够有力解释因变量的变化.
| 表 2 有机氮降解与微生物生长相关因素的相关性分析 Table 2 Correlation analysis between degradation of organic nitrogen and growth-related factors of microbe |
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| 表 3 有机氮降解与微生物生长相关因素交互作用的相关性分析 Table 3 Correlation analysis between degradation of organic nitrogen and interactions of growth-related factors of microbe |
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| 表 4 自变量相关性分析 Table 4 Correlation analysis between degradation of variables |
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| 表 5 有机氮降解模型各系数的显著性 Table 5 Significances of parameters in organic nitrogen degradation models |
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式中, yd-c、yd-n和yd-y分别表示对照水体、NT9水体和YB3水体各试验阶段的有机氮降解量(mg · L-1)；x1为总菌量(cfu · mL-1)；x2为总菌增量(cfu · mL-1)；x3为有机氮含量(mg · L-1)；x4为时间(d).
3.4 微生物增殖模型有机氮降解模型(式(14)~(16))表明, 水体微生物增殖(总菌增量)对有机氮降解具有较大的促进作用, 因此, 采用公式(13)对水体微生物增殖进行分析.结果表明(式(17)~(19)), 3种水体中微生物增殖模型也均达到显著水平(p < 0.05), 所有系数也都显著或极显著(表 6), 决定系数都在0.90以上, 能够有力解释菌株增殖情况.
| 表 6 微生物增殖模型各系数的显著性 Table 6 Significances of parameters in microbial proliferation models |
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式中, yg-c、yg-n和yg-y分别表示对照水体、NT9水体和YB3水体的总菌增量(cfu · mL-1)；x1为总菌量(cfu · mL-1)；x2有机氮含量(mg · L-1)；x3为时间(d).
4 讨论(Discussion) 4.1 试验期间发生的氮转化反应按照氮循环途径, 有机氮首先经氨化作用降解为氨氮, 再通过亚硝化、硝化作用依次转化为亚硝酸氮和硝酸氮, 然后经反硝化作用脱氮, 另外, 氨氮和硝酸氮还可以经过同化作用再次转化为有机氮(乐毅全等, 2011; 刘健康, 2005).试验期间各水体有机氮投入量(以N计)随着饲料的投入不断升高(图 2a), 与此同时, 氨氮浓度也均呈上升趋势(图 2b), 而亚硝酸氮和硝酸氮浓度差异不显著, 且总体保持稳定(p>0.05, 图 2c和图 2d), 表明水体发生了强烈的氨化作用, 而硝化、亚硝化、反硝化及硝酸氮的同化等作用不强烈甚至未发生.氨氮的同化作用主要用于微生物合成自身蛋白, 由于有机氮存在形式的多样性及其循环途径的复杂性(乐毅全等, 2011), 要单独测量出微生物合成的蛋白的数量比较困难, 但可以从微生物的生长情况进行推测.试验期间, NT9水体总菌量未增加, YB3水体和对照水体分别在12 d和8 d以后也均没有增加(图 1a), 表明这些时期微生物蛋白合成量很少, 其消耗的氨氮量也很少.相关分析结果显示, 水体氨氮浓度与总氮累积投入量具有显著的线性关系(R2≥0.8779, p < 0.0001, 图 2e), 说明从整个试验期间平均来看, 有机氮降解后的存在形式主要为氨氮.
在试验初期对照水体的总菌量有增加(图 1a), 表明有部分氨氮被同化, 如果按照公式(2)计算有机氮的降解率, 结果可能会被低估, 但实际上影响并不大, 因为对照水体总菌量增加较小, 说明被同化的氨氮数量有限.研究发现, 如果水体中微生物大量生长、繁殖, 将分泌大量蛋白, 使悬浮物的蛋白质含量大大提高, 有的甚至高达49.0%~50.0%(Emerenciano et al., 2011; Kuhn et al., 2009; Martínez-Córdova et al., 2015).在本试验初期, YB3水体总菌量有较大增长(图 1a), 表明微生物活动旺盛, 因而可能分泌了一定的蛋白, 重新降解为氨氮后使有机氮降解率高估, 达到120.53%(图 2f)；从另一方面看, 这反而减弱了氨氮同化对有机氮降解率计算的影响.这个过程表明氮循环非常复杂, 在今后的研究中还需要监测水体蛋白质的含量变化.
硝化(亚硝化)细菌属于自养细菌, 生长速度比较慢(Ebeling et al., 2006), 需要较长周期才能建立起稳定的菌群系统, 发挥硝化(亚硝化)作用.研究发现, 亚硝酸氮浓度在养殖水体中3周以上才开始缓慢上升(Avnimelech, 2015; Arantes et al., 2017; Ferreira et al., 2017), 有的甚至要到第9周(Danaher et al., 2011).本次试验周期比较短, 只有3周多(24 d), 因而稳定的硝化(亚硝化)菌群系统可能尚未完全建立, 硝化(亚硝化)作用较弱.研究发现, 某些芽孢杆菌也具有异养硝化(亚硝化)和反硝化功能(张庆华等, 2011), 会导致水体亚硝酸氮、硝酸氮含量发生变化.本次试验结果显示, 亚硝酸氮和硝酸氮含量变化均不明显, 表明菌株NT9和菌株YB3异养硝化(亚硝化)和反硝化的功能均很弱, 与前期研究结果一致(黄海洪等, 2018). 3种水体氨氮均大量累积, 平均高达5.20~11.69 mg · L-1(图 2b), 远远高于凡纳滨对虾2.44 mg · L-1的安全浓度(Lin et al., 2001), 对养殖生产非常不利.这可能是由于硝化(亚硝化)和同化作用的缺失造成的(Ebeling et al., 2006; 雷衍之, 2015; 黄海洪等, 2018).因此, 下一步需要对菌株NT9和YB3同步转化氨氮的问题进行研究.
4.2 微生物生长与有机氮的降解研究表明, 有机氮的降解与微生物分泌的酶具有一定的关系, 如周广静等(2017)用海洋着色菌(Marichromatium gracile)YL28处理污染水体时发现, 菌株的蛋白酶、转化酶、脲酶和脱氢酶活性均明显升高(p < 0.05), 且与水体COD的去除规律相吻合.芽孢杆菌具有分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种功能(高权新等, 2013), 可能也是其降解能力较高的原因之一.如李木明(2016)选育了一株枯草芽孢杆菌ZY2-6, 对水体有机质的降解率(48 h)可达55.74%, 闫法军等(2013)从刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘底泥中分离的蜡样芽孢杆菌Y22, 对饲料蛋白的降解率也达到了49.10%, 这2株菌都具有较强的蛋白酶和淀粉酶活性(李木明, 2016; 闫法军等, 2013).本次试验使用的菌株NT9(KX891556)和菌株YB3(KX578018), 分别为枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌(黄海洪等, 2018), 前期研究发现均具有蛋白酶和淀粉酶活性, 且菌株NT9的活性高于菌株YB3(数据暂未发表).
然而, NT9水体的有机氮降解率却比YB3水体低(图 2f), 闫法军等(2013)和李木明(2016)也有类似的发现.可能的原因是降解能力不仅仅取决于酶活的强弱, 还与水体中微生物的生长活动有关, 菌株长势越好, 降解能力越强(康鹏亮等, 2018), 如张庆华等(2011)和谢航等(2008)都发现饲料蛋白的降解与菌株的生长密切相关, 在对数生长期降解速度最快, 降解率最高, 而到了平台期, 培养基中的饲料蛋白几乎不被降解, 降解率下降并趋于稳定.原始生活环境对菌株的繁殖能力影响非常大, 不同的自然生态环境支持不同的优势菌种(Arrigo, 2005; 康鹏亮等, 2018).菌株NT9从传统发酵食品腊八豆中分离得到, 这种环境含有丰富的大豆蛋白、淀粉等酶类底物, 对营养需求较高, 而菌株YB3则分离自营养水平相对较低的养殖水体, 对低营养环境有较强的适应能力.本次试验所用的水体为模拟的养殖水体, 营养水平较低, 因而更有利于菌株YB3的生长增殖(图 1a), 残饵有机氮的降解率也更高(图 2f).因此, 菌株生长增殖能力对有机氮的降解影响非常大, 筛选菌种时, 除了要考虑菌株的酶类活性等, 还需要根据环境条件或者从实际应用特点出发, 才具有更大的应用价值.
从水体总菌数量变化来看, 对照水体大幅上升, 并最终与NT9水体处于相同的数量级, 而NT9水体呈下降趋势, YB3水体的总菌量也有增长(图 1a).与此相应, 对照水体降解率先上升后下降, NT9水体和YB3水体降解率较高, 但不断下降(图 2f).微生物生长除了氮源以外, 还需要碳源(Avnimelech, 2015), 例如, 微生物细胞的C : N约为5 : 1(Rittmann et al., 2002), 但环境中的C : N达到15 : 1以上, 才能够旺盛生长(Avnimelech, 1999; Asaduzzaman et al., 2008).本次试验养殖水体的碳源和氮源均主要来自于投入的饲料(粗蛋白40%、粗脂肪5.0%、粗纤维5.0%、粗灰分15%、水分12%), 根据饲料碳水化合物含量与其它成分含量之间的换算关系(Hari et al., 2004; Kumar et al., 2017), 其C : N约为6 : 1, 碳源稍显不足, 而且随着试验周期的延长, 有机氮由于不能完全降解(图 2f)而不断累积, 更加剧了碳源的缺乏.因此, 微生物生长活动受到抑制, 有机氮降解率也不断下降.对照水体由于未接种菌株, 初始总菌量较少, 水体营养能够维持微生物较长时间的生长活动, 因而12 d之前降解率都处于上升状态.
从降解模型来看, 微生物生长对有机氮的降解也具有重要作用, 如对照水体的数学模型(式(14))显示, 总菌量(x1)及增量(x2)对有机氮降解具有显著的贡献(p < 0.05, 表 5).对照水体中, 有机氮含量和时间对有机氮降解具有显著或极显著的负作用(p < 0.05或p < 0.01, 表 3), 由于其偏相关系数均不显著(p>0.05, 表 2), 推测上述显著的相关关系可能与水体中微生物的生长有关, 因为时间(试验阶段t, x4)除了与微生物生长阶段相对应并与降解活力有关外, 也间接反映了水体营养的消耗, 与水体营养水平具有反比关系, 而有机氮含量(x3)更是代表了水体的营养水平, 有机氮含量越高, C : N相对越低, 碳源相对越缺乏, 加剧了微生物的营养竞争, 因此, 两者都影响微生物生长, 呈现负效应(表 2).然而, 数学模型并未将有机氮含量和时间纳入, 可能是因为在多元回归分析过程中两者的作用被与其相关的变量替代了(万崇华等, 2014), 如总菌量和总菌增量.NT9水体有机氮的降解与所有因素的相关关系均不显著(p>0.05, 表 2和表 3), 可能该水体的降解能力与另外的因素有关, 如菌株NT9的酶类活性等.在数学模型中(式(15)), 有机氮含量对降解具有非常大的正效应, 反映了营养水平对菌株NT9生长的重要性, 因为该菌来自营养较为丰富的环境, 低营养水平将抑制其生长.时间的负效应可能与C : N下降和碳源缺乏有关.总菌量与有机氮含量, 以及总菌增量与时间的负交互效应均体现了微生物的营养竞争关系.总菌量对模型的贡献不显著, 未纳入到模型中, 可能是因为整个试验过程总菌量的变化都不大, 总体处于相同的数量级(图 1 b).YB3水体的有机氮降解与4种因素均具有显著相关性(p < 0.05或p < 0.01, 表 3).其中, 总菌量和有机氮含量的主效应均为负(表 2), 表明YB3水体也存在一定的营养竞争.总菌量分别与总菌增量和时间具有负的交互效应(表 3), 说明微生物增加越多, 数量越大, 竞争也越大, 而时间则间接反映了营养水平的降低.但时间的主效应不为负(表 2), 表明营养水平降低的影响有限, 而这可能又与菌株YB3较强的低营养环境适应能力有关, 意味着在低营养水平条件下有机氮的降解中该菌具有更高的应用价值.总菌增量的主效应及其与有机氮含量的交互效应均为正(表 2和表 3), 表明微生物通过增殖活动对有机氮的降解具有促进作用.数学模型的结果也与此一致, 式(16)显示, YB3水体有机氮的降解主要随总菌增量的增加而增加.
4.3 不同水体的有机氮降解能力将微生物的生长与有机氮降解结合起来看, 对照水体未接种菌株, 起始菌量为0, 虽然菌量增加较快, 并最终与NT9水体处于同一数量级(图 1b), 但有机氮降解率整体上仍低于接种菌株的NT9水体(图 2f), 表明接种菌株对有机氮的降解具有一定的作用, 称之为基数效应.另外, NT9水体和YB3水体起始总菌量相当, 但前者数量不断减少, 而后者略有增加(图 1b), 相应地, YB3水体的有机氮降解率也高于NT9水体(图 2f), 表明在降解过程中, 微生物的增殖(总菌增量)对有机氮的降解也具有促进作用, 可称之为增量效应.因此, 可以将微生物的降解效应剖分为基数效应和增量效应.张庆华等(2011)发现, 地衣芽孢杆菌X3914的接种量为1%时, 培养基中的饲料蛋白质降解率约为28.0%, 将接种量提高到5%后, 降解率相应地升至35.2%, 可能也是在基数效应基础上由于接种菌量增多带来的增量效应.对照水体降解模型(式(14))常数项为负值, 这是因为未接种菌株, 没有基数效应, 这种情况下, 假设总菌量增加到与NT9水体和YB3水体接种量相当的水平, 可计算得到有机氮降解量为2.30 mg · L-1(表 7), 即为对照水体的增量效应.假设对照水体起始菌量与NT9水体和YB3水体相同, 可由式(14)计算得出此时的有机氮降解量为1.94 mg · L-1, 即对照水体的基数效应低于增量效应, 表明在对照水体中增量效应对有机氮降解的贡献大于基数效应.NT9水体和YB3水体的数学模型中(式(15)和式(16))均未纳入总菌量, 可能是因为2种水体总菌量的总体变化均不大, 始终处于同一数量级(图 1b), 因此, 式中的常数项可视为水体的基数效应, 分别为2.11 mg · L-1和1.73 mg · L-1(表 7).NT9水体的基数效应较高, 这可能与该菌较强的水解酶活性(数据未发表)有关.NT9水体数学模型未体现出增量效应(式(15)), 主要是因为总菌量没有增加.YB3水体具有较高的增量效应, 水体菌量对数值增加1个单位, 有机氮降解量达到7.84 mg · L-1, 远高于同等条件下的对照水体(3.39 mg · L-1)(表 7), 可能是因为菌株YB3对低营养水平环境的适应能力比较强, 因而能够更有效地利用有机氮, 也再次表明了菌株增殖能力在有机氮降解中的重要性.因此, 在水体中接种菌株时, 增量效应对有机氮降解的贡献要大于基数效应, 而增量效应与菌株的增殖能力有关, 在实际应用中应筛选对环境条件适应能力强的的菌株, 获得更大的增量效应, 提高有机氮降解效果.
| 表 7 微生物增殖模型各系数的显著性 Table 7 Significances of parameters in microbial proliferation models |
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鉴于微生物生长对水体有机氮降解的重要作用, 构建了水体微生物的增殖模型(式(17)~(19)).3种水体总菌量(x1)对微生物的增殖均具有负效应, 可能与营养竞争有关.对照水体微生物的增殖还受时间(x4)的负的影响, 可能与C : N下降和碳源减少有关, 但有机氮含量(x3)具有一定的促进效果, 可能与对照水体未接种菌株, 起始菌量较少, 营养竞争较小有关.总菌量和时间的交互作用对NT9水体微生物增殖的负效应, 以及有机氮含量对YB3水体微生物增殖的负效应, 可能均与营养竞争有关, 如C : N的下降和碳源的减少等.因此, 从促进微生物增殖的角度看, 一是接种量要与营养水平相适应, 减小营养竞争, 二是要适当提高水体的C : N, 如添加外源碳源等, 促进增殖.
5 结论(Conclusions)1) 本试验条件下, 3种水体的有机氮降解均以氨化作用为主, 接种芽孢杆菌NT9水体和YB3水体的降解效果强, 但导致氨氮大量积累, 需要对同步转化氨氮的问题进行研究.
2) 在低营养水体中接种芽孢杆菌NT9和YB3能够促进有机氮的降解, 降解率分别比对照提高50.28%和119.41%, 降解速率分别提高65.22%和121.74%.
3) 在低营养水平条件下, NT9水体平均总菌量下降至(3.46 ±2.39)×105 cfu · mL-1, 而YB3水体则上升到(25.43 ±8.84)×105 cfu · mL-1.
4) 对照水体、NT9水体和YB3水体有机氮降解的数学模型分别为y=-6.40+1.39x1+1.45x2、y=2.11+8.21x3-0.64x4-1.26x1x3-0.32x2x4和y=1.73+6.11x2(x1为总菌量, x2总菌增量, x3为有机氮含量, x4为时间), 微生物增殖(总菌增量)模型分别为y=5.67-0.87x1-0.15x3+0.02x22、y=9.50-1.63x1-0.01x1x3和y=7.59-1.13x1-0.08x3(x1为总菌量, x2为有机氮含量, x3为时间).
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