2019, Vol. 39
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2. 湖北科技学院基础医学研究中心, 咸宁 437100
2. Research Center of Basic Medical Sciences, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100
据报道，环境污染物可影响人类的神经行为，并诱导相关的神经疾病(Kobrosly et al., 2014).特别对婴幼儿这类人群而言，他们的大脑尚未完全发育成熟，因而对暴露物更加敏感，增加了罹患神经疾病的风险(Miodovnik, 2011).邻苯二甲酸酯(phthalates, PAEs)是一类典型的人工合成化学品，是重要的塑料添加剂，广泛应用于日常生活用品，包括食品包装和医疗应用材料(Sathyanarayana et al., 2008).然而，PAEs往往易从使用、加工过程中溢出到环境中(Xu et al., 2009)，婴幼儿通过日常饮食、吸入和皮肤接触PAEs可能导致一些健康问题，其中就包括神经毒性(Shea, 2003; Miodovnik et al., 2014).Cho等(2010)的研究表明，PAEs的暴露可以显著降低小学生的学习成绩和智商测量值.李桉琪等(2013)报道，淮河流域沙颍河段PAEs污染区儿童智力低于未污染区儿童的平均水平.
作为PAEs的一类主要物质，邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)在日常生活中也是普遍存在的环境污染物(Koch et al., 2003)，其潜在的脑神经毒性最近受到越来越多的关注.最新研究表明(Wojtowicz et al., 2017)，DBP可以通过胎盘和血脑屏障而作用于脑组织.此外，胶质瘤细胞在人类神经系统中特别容易受到外源性刺激，易致肿瘤或发育神经毒性(Huang et al., 1993; Li and Rossman, 2001)，然而有关DBP对胶质瘤细胞的作用研究还相对较少，DBP在神经系统中的作用机制尚不清楚.
大量研究表明(Li et al., 2013; Yan et al., 2016)，氧化应激在DBP诱导实验动物的神经毒性中发挥关键的作用.核因子κB(NF-κB)是一种氧化应激转录因子，具有广泛的生物学活性，参与细胞增殖和凋亡的多种生理和病理过程(Schieber and Chandel, 2014)，提示NF-κB途径很有可能参与DBP诱导的神经毒性.为此，本研究以人胶质瘤细胞U251为对象，检测DBP对U251细胞的毒性、氧化损伤水平及NF-κB通路相关蛋白，包括钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)、泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14, USP14)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)，以探究NF-κB途径及其分子事件相关蛋白参与DBP诱导神经毒性的作用机制.
2 材料和方法(Materials and methods) 2.1 主要仪器与试剂CO2培养箱(美国Thermo)，SWCJ2D超净工作台(苏州净化)，Eclipse TE2000-S倒置显微镜(日本尼康), ELX 800酶标仪(美国Bio-Teck)，Hide Chameleon V荧光酶标仪(芬兰Hidex).DBP(≥99%，CAS：84-74-2)、维生素E(Vitamin E, VE)、2′, 7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)购于美国Sigma公司，Tween-80 (CAS: 9005-65-6)购于美国Amresco公司，DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司，CaN和USP14人源性ELISA试剂盒购于上海Blue Gene公司，GDNF和NF-κB人源性ELISA试剂盒购于美国eBioscience公司.
2.2 细胞与细胞培养人胶质瘤细胞系U251，购于武汉大学中国典型培养物保藏中心.U251细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中分别培养12 h和24 h(培养条件为37 ℃、5%CO2).采用常规胰酶消化法制备U251细胞悬液，以1×104 cells·孔-1密度置于96孔板中，然后检测细胞活性和相关指标.
2.3 实验分组根据Zhang等(2016)的研究，选择DBP的暴露剂量为25、100 μmol·L-1.根据Johnson等(2017)的研究，选择VE的剂量为20 μmol·L-1.实验分组为：a: Control; b: Tween 80; c: 25 μmol·L-1 DBP; d: 100 μmol·L-1 DBP; e: 20 μmol·L-1 VE; f: 20 μmol·L-1 VE + 100 μmol·L-1 DBP.DBP溶解于Tween 80中，然后以1：1体积比用无血清培养基稀释至不同实验浓度(25 μmol·L-1、100 μmol·L-1)，Dimitrov等(2011)已证明Tween 80是惰性的.VE用无血清培养基稀释至20 μmol·L-1，作为抗氧化剂，在混合组中，经DBP暴露30 min后再加入VE处理细胞.
2.4 实验指标测定 2.4.1 细胞活性检测Cell Counting Kit-8简称CCK-8，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒，间接反映活细胞数量.将不同处理组的U251细胞分别置于96孔板中培养12 h和24 h，然后添加10 μL CCK-8试剂(10 μL CCK-8溶于90 μL PBS)在黑暗条件下孵育2 h，酶标仪测定波长450 nm时的吸光度.
2.4.2 细胞形态学检查将U251细胞与上述不同处理组共培养，细胞分别暴露12、24 h后，用PBS快速洗涤两次，去除悬浮物，室温下用4%多聚甲醛固定1 h，然后用结晶紫染色(Chiba et al., 1998)，最后用倒置显微镜观察细胞形态.
2.4.3 细胞氧化应激水平检测细胞内ROS水平通过与2′, 7′-二氯荧光素(DCF)反应的荧光强度来测定，将不同处理组的U251细胞分别置于96孔板中培养12 h和24 h，吸弃染毒液，用PBS重悬.将10 mmol·L-1的DCFH-DA荧光染料用PBS缓冲液稀释1000倍，加入100 μL待测细胞重悬液混匀，37 ℃避光孵育5 min，用荧光酶标仪检测485 nm激发光、528 nm发射光的荧光强度，以相对荧光单位(RFU)表示荧光强度.MDA可与2-硫代巴比妥酸(TBA)在高温(90~100 ℃)下形成稳定的显色产物而被测定，简言之，取0.5 mL细胞上清液于10 mL离心管中，加入0.6%TBA溶液沸水浴15 min，冷却后取1 mL，10000 g离心10 min，取上清液100 μL于酶标板中测其在450、532、600 nm的OD值(OD450、OD532、OD600).MDA含量(μmol·mg-1)=[6.45(OD532-OD600)-0.56OD600](μmol·L-1)×样本稀释倍数/待测匀浆蛋白浓度(mg·mL-1)，Folin-酚法测定蛋白质含量.上述检测方法参照Yan等(2016)的方法进行.
2.4.4 NF-κB通路相关蛋白的测定严格按照ELISA试剂盒说明，检测细胞上清中NF-κB浓度、CAN活性、USP14活性和GDNF浓度，其灵敏度分别为100~2000 ng·L-1、2.5~85 IU·L-1、10 ~400 IU·L-1、10 pg·mL-1.
2.5 统计学分析实验数据均为x±s，采用GraphPad Prism 5.02 (GraphPadSoftwareInc.，CA，USA)软件进行数据处理，采用单因素方差分析(ANOVA)和LSD-t检验分析两组间的差异，p＜0.05，表示差异有统计学意义.
3 结果(Results) 3.1 DBP降低U251细胞活性CCK-8测定结果显示不同处理组U251细胞活性的影响，如图 1所示.与对照组相比，12 h与24 h 100 μmol·L-1 DBP暴露组的细胞活性降低，差异均有统计学意义(p＜0.01), 表明此浓度下的DBP对U251细胞活性有抑制作用.加入VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组细胞活力明显增高，差异均有统计学意义(p＜0.01，p＜0.05)，表明抗氧化剂VE对DBP诱导的细胞毒性有保护作用.
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| 图 1 不同处理组U251细胞活性的影响(n=6)(a.暴露12 h；b.暴露24 h) 注：100 μmol·L-1 DBP暴露组与对照组比较，** p＜0.01, ##p ＜0.01；与100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组比较，** p＜0.01, # p＜0.05，下同. Fig. 1 The viability of U251 cells in different treatment groups (n=6) (a. 12 h, b. 24 h) Note: 100 μmol·L-1 DBP exposure group compared with control group, ** p < 0.01, ##p < 0.01; compared with 100 μmol·L-1 DBP + 20 μmol·L-1 VE group, ** p < 0.01, # p < 0.05, the same below. |
U251细胞经不同处理组24 h暴露后的形态学观察结果如图 2所示.对照组U251细胞的形态结构基本正常，树突形态未发生变化(图 2a)；随着DBP暴露浓度的增加，U251细胞的树突形态发生显著变化(图 2b，2c)，100 μmol·L-1 DBP组部分U251细胞核固缩明显，且细胞数量减少(图 2c)；加入VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组U251细胞的形态基本正常，且细胞数量有所增加.以上结果表明，DBP暴露可致U251细胞的形态学改变和损伤，抗氧化剂VE对DBP介导的细胞损伤具有一定的保护作用.
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| 图 2 24 h后不同处理组U251细胞结晶紫染色结果(X 40)(黄色箭头表示U251细胞)(a. Control; b. Tween 80; c. 25 μmol·L-1 DBP; d.100 μmol·L-1 DBP; e. 20 μmol·L-1 VE; f. 20 μmol·L-1 VE + 100 μmol·L-1 DBP) Fig. 2 Crystal violet staining results of U251 cells in different treatment groups for 24 h (X 40), (a. Control; b. Tween 80; c. 25 μmol·L-1 DBP) (d.100 μmol·L-1 DBP; e. 20 μmol·L-1 VE; f. 20 μmol·L-1 VE + 100 μmol·L-1 DBP. Yellow arrows : U251 cells) |
ROS是氧化应激最重要的生物标志物，不同处理组U251细胞ROS生成的结果如图 3所示.12 h与24 h DBP组ROS水平随DBP暴露剂量的增加而升高，与对照组比较，100 μmol·L-1 DBP组ROS含量显著升高，差异有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)，表明较高剂量的DBP能造成U251细胞ROS含量的上升.经加入抗氧化剂VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组ROS相对荧光强度明显降低(p＜0.01，p＜0.01)，表明抗氧化剂VE能降低DBP诱导U251细胞过量产生ROS.过量的活性氧引起的另一个主要结果是脂质过氧化，MDA是过氧化的最终产物，MDA含量可以反映脂质过氧化反应损伤程度.由图 4可知，U251细胞中MDA水平与DBP暴露剂量呈正相关.12 h与24 h 100 μmol·L-1 DBP组，与对照组比较，MDA含量显著升高，差异均有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)；加入VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组MDA含量明显降低(p＜0.01，p＜0.05).以上结果表明，较高剂量的DBP可使U251细胞MDA含量明显上升，抗氧化剂VE能降低DBP诱导U251细胞过量产生MDA.
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| 图 3 不同处理组U251细胞ROS含量的变化(n=6)(a.暴露12 h；b.暴露24 h) Fig. 3 ROS content of U251 cells in different treatment groups (n=6) (a. 12 h, b. 24 h) |
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| 图 4 不同处理组U251细胞MDA含量的变化(n=6)(a.暴露12 h, b. 24 h) Fig. 4 MDA content of U251 cells in different treatment groups (n=6) (a. 12 h, b. 24 h) |
不同处理组U251细胞的NF-κB水平变化结果如图 5所示.12 h与24 h 100 μmol·L-1 DBP组，与对照组比较，NF-κB含量显著增加，差异均有统计学意义(p＜0.01，p＜0.01)；加入VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组NF-κB含量明显降低(p＜0.05，p＜0.05).以上结果表明，NF-κB的含量与不同浓度的DBP之间存在一定的剂量依赖关系，提示DBP可能诱导NF-κB的活化；抗氧化剂VE可以降低DBP介导的NF-κB活化.
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| 图 5 不同处理组U251细胞NF-κB水平的变化(n=6)(a.暴露12 h, b.暴露24 h) Fig. 5 NF-κB level of U251 cells in different treatment groups (n=6) (a. 12 h, b. 24 h) |
不同处理组U251细胞的CaN活性变化结果如图 6所示.12 h与24 h 100 μmol·L-1 DBP组，与对照组比较，CaN活性显著升高，差异均有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)；加入VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组CaN活性明显降低(p＜0.01，p＜0.05).以上结果表明，不同DBP浓度与CaN活性变化有一定的关系，抗氧化剂VE可以降低DBP介导的CaN活性.
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| 图 6 不同处理组U251细胞CaN活性的变化(n=6)(a.暴露12 h, b.暴露24 h) Fig. 6 CaN activity of U251 cells in different treatment groups (n=6) (a. 12 h, b. 24 h) |
不同处理组U251细胞的USP14活性变化结果如图 7所示.12 h与24 h 100 μmol·L-1 DBP组，与对照组比较，USP14活性显著升高，差异均有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)；加入VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组USP14活性明显降低(p＜0.05，p＜0.05).以上结果表明，不同DBP浓度与USP14活性变化有一定的关系，抗氧化剂VE可以降低DBP介导的USP14活性.
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| 图 7 不同处理组U251细胞USP14活性的变化结果(n=6)(a.暴露12 h, b.暴露24 h) Fig. 7 USP14 activity of U251 cells in different treatment groups (n=6) (a. 12 h, b. 24 h) |
不同处理组U251细胞的GDNF水平变化结果如图 8所示.12 h与24 h 100 μmol·L-1 DBP组，与对照组比较，GDNF含量显著降低，差异均有统计学意义(p＜0.01，p＜0.01)；加入VE处理后，与100 μmol·L-1 DBP组比较，100 μmol·L-1 DBP+20 μmol·L-1 VE组GDNF含量明显降低(p＜0.05，p＜0.05).以上结果表明，GDNF的含量与不同浓度的DBP之间存在一定的剂量依赖关系，提示DBP可介导GDNF的释放；抗氧化剂VE可以抑制DBP介导的GDNF释放.
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| 图 8 不同处理组U251细胞GDNF水平的变化(n=6)(a.暴露12 h, b.暴露24 h) Fig. 8 GDNF level of U251 cells in different treatment groups (n=6) (a. 12 h, b. 24 h) |
一些流行病学调查显示，人类暴露于DBP可导致潜在的神经疾病风险，如智力障碍、神经行为变化和神经内分泌紊乱等(Cho et al., 2010; Kobrosly et al., 2014; Miodovnik et al., 2014)，部分动物实验数据也支持上述观点，Li等(2013)的研究表明，围产期暴露DBP可通过诱导脑海马细胞凋亡、突触丢失和突触功能障碍而导致新生和未成熟仔鼠出现神经毒性，但当前DBP的神经毒性机制有待进一步阐明.基于前期的研究(Yan et al., 2016)，我们报道了较高剂量(25或125 mg·kg-1·d-1)的DBP可介导氧化应激对小鼠神经行为产生影响，而中枢神经系统的损伤是DBP暴露的终点效应之一.其他研究也报道(Wojtowicz et al., 2017)，氧化应激在DBP介导的神经毒性中起着至关重要的作用，而NF-kB作为一种重要的氧化应激反应转录因子，是否有可能参与其过程，目前尚未得到研究证实.故本实验首次探究不同剂量DBP暴露下对U251细胞的影响，为揭示NF-κB途径及其分子事件相关蛋白参与DBP诱导神经毒性的作用机制提供实验依据.
根据我们的实验结果，经DBP暴露后，U251细胞内ROS水平和MDA含量升高，且有一定剂量效应，提示DBP诱导U251细胞出现氧化应激反应.氧化应激过程是由DBP引起的一种上游毒性事件，伴有ROS的过量产生，对包括脂质、细胞膜、蛋白质和DNA在内的细胞结构造成损伤.ROS的积累加剧了氧化应激，最终可能导致病理变化并导致细胞功能障碍(Ma et al., 2014; Wu et al., 2017).
其损伤机制与氧化应激反应转录因子有关.NF-κB在神经细胞的增殖过程中起着重要的作用，参与了神经细胞的多种病理状态(Morgan and Liu, 2011).一些研究表明(O′Neill et al., 1997)，NF-κB是ROS对胶质细胞功能的重要靶点，NF-κB的激活可由ROS和钙信号等多种因素引起(Schreck et al., 1991).本实验结果表明，DBP刺激U251细胞使ROS水平升高，导致细胞内NF-κB水平显著升高，但加入抗氧化剂VE后，胞内NF-κB水平显著下降，提示DBP可能通过ROS激活NF-κB通路.在非刺激细胞中，NF-κB与胞质中抑制剂I-κB紧密结合而不发挥活性.然而，当DBP作为外源性刺激使NF-κB从I-κB中分离出来，使NF-κB转移到细胞核，并通过不同的胞内级联反应调控基因表达，从而引起下游分子事件的改变；一旦NF-κB通路被激活，这种导致核转位和抗凋亡基因表达调控的神经退行性疾病就会发生(Mincheva-Tasheva and Soler, 2013).
钙调神经磷酸酶(CaN)是一种Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶，主要分布于神经组织，并在许多调节蛋白、信号通路中发挥作用(Jørgensen et al., 2003).有研究表明(Wang et al., 1999; Xin et al., 2017)，CaN参与了NF-κB的激活过程，高活性的CaN可诱导细胞凋亡.本实验结果表明，DBP可导致U251细胞内CaN活性显著增高，但加入抗氧化剂VE后，胞内CaN活性显著下降，提示CaN可能参与了神经胶质细胞NF-κB被DBP激活的过程.泛素特异性蛋白酶14(USP14)是一种参与维持正常神经功能和氧化应激反应的脱泛素酶，调节细胞增殖和凋亡以及NF-κB信号的激活，USP14通过脱泛素调节靶蛋白的降解，并通过NF-κB途径对肿瘤和神经系统疾病的发生和发展产生影响(Lee et al., 2009).本实验结果表明，DBP暴露组USP14的活性明显升高，这一趋势与氧化应激的增加以及NF-κB的激活相一致.Mialki等(2013)提出，USP14蛋白酶的过度表达降低了I-κB蛋白水平，增加了细胞因子在肺上皮细胞中的释放.这提示，USP14可能参与了DBP激活NF-κB的过程.其他研究也指出(Tanaka et al., 2008)，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)与原代大鼠胶质细胞NF-κB通路有关，提示NF-κB的激活伴有GDNF的释放.本实验结果表明，DBP可使U251细胞内NF-κB水平显著增高，导致细胞内GDNF含量的显著降低，但加入抗氧化剂VE后，胞内GDNF含量显著上升，提示DBP激活NF-κB通路促进GDNF的释放.越来越多的证据表明(Kordower et al., 2000; Cao et al., 2008)，GDNF的总体水平与神经保护作用的增强是相伴而生的；相反，它的衰减会损害对正常细胞结构的保护.Kordower等(2000)发现GDNF慢病毒载体在帕金森病灵长类动物模型中可以预防神经变性.CaO等(2008)还发现p65/p52 NF-κB参与了GDNF对PD早期大鼠多巴胺能神经元的影响，说明GDNF具有神经保护作用.
此外，细胞形态结果显示，DBP降低U251细胞活性，并介导产生细胞毒性.DBP + VE混合组与DBP单独暴露组比较发现，加入抗氧化剂VE处理后，U251细胞的细胞损伤得到一定程度的保护.文献报道证实(Lo et al., 2013)，VE可抑制NF-κB的激活，从而发挥神经保护作用.本实验结果表明，VE作为非酶抗氧化剂，能有效地阻断DBP引起的氧化应激，降低细胞内ROS和MDA的生成，抑制NF-κB的激活，减轻细胞或细胞结构的损伤.提示，VE可能在一定程度上减轻DBP介导的神经毒性.
5 结论(Conclusions)综上所述，细胞活力和氧化应激水平的检测显示了DBP诱导细胞毒性的潜在风险.NF-κB和NF-κB通路相关蛋白的水平或含量变化表明NF-κB参与DBP介导的细胞毒性作用.VE作为抗氧化剂可阻断ROS的生成从而抑制NF-κB的活化，提示VE在体外对DBP介导的神经毒性具有一定的保护作用.本研究的结果，可为更全面地了解DBP的神经毒性作用，以及DBP诱导的相关神经疾病的治疗靶点提供基本的实验依据.
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