2019, Vol. 39
[PDF全文]
2. 内蒙古大学生态与环境学院, 呼和浩特 010021;
3. 上海师范大学天华学院, 上海 201815
2. School of Ecology and Environment, Inner Mongolia University, Hohhot 010021;
3. Shanghai Normal University Tianhua College, Shanghai 201815
苯酚是一种常见的毒性有机物, 即使含量很低也会对动植物及人类产生急性毒害和致癌性(黄中子等, 2015a).煤化工、石化、炼焦、造纸等工业生产排放的废水中不仅含苯酚类污染物, 还含有大量的盐分(沈娥等, 2013).高盐含酚废水一旦排放到环境中将对土壤和水资源造成严重危害(黄中子等, 2015b).
目前高盐含酚废水的处理方法有很多, 主要有萃取、吸附、膜技术、生物法等.微生物法由于具备成本低、二次污染小等优点, 使其在应用中备受关注(Cintia et al., 2013).近年来, 国内外学者在苯酚废水生物处理方面做了大量的研究, 并筛选出多种苯酚降解菌, 主要有芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(刘鸿杰等, 2017; Ereqat et al., 2018)、苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)(陈晓华等, 2012)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)(Li et al., 2013)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(李鲜珠等, 2015)、红球菌属(Rhodococcus sp.)(张玉秀等, 2013)等.但这些菌大多耐盐能力弱, 对于高盐含酚废水的处理效果不佳, 如红球菌CM-HZX1可以耐受4%的盐度, 当盐度达到5%, 对500 mg · L-1的苯酚降解率小于30%(魏霞等, 2017)；Debaryomyces JS4在盐度13%的条件下, 对苯酚几乎没有降解, 当盐度增加到17%时, 该菌株无法生长(Jiang et al., 2016)；Candida aquae JS3在盐度为5%时, 能够将500 mg · L-1的苯酚全部降解, 但是当盐度为10%, 则对苯酚的降解率低于30%(Jiang et al., 2015).因此, 寻求能够高效降解苯酚, 同时可以适应高盐度环境的菌株十分重要.
本研究从巴丹吉林沙漠盐碱湖表层沉积物中, 通过筛选、分离、驯化得到嗜盐苯酚降解菌H17, 探讨了苯酚初始浓度、NaCl浓度、温度、pH、碳源和氮源对H17生长及苯酚降解的影响, 同时对其降解苯酚过程进行了动力学拟合, 研究将为高盐含酚废水的生物强化处理提供依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 样品来源样品取自内蒙古巴丹吉林沙漠盐湖巴丹西湖(Badain Lake)(纬度：39.33.16, 经度：102.21.73)的表层沉积物, 巴丹西湖的TDS高达156 g · L-1, 为典型的咸水湖, 湖水浑浊、有臭味, 湖里有大量红色卤虫和水藻.
2.2 培养基 2.2.1 ATCC 213培养基MgSO4 · 7H2O 10 g · L-1、CaCl2 · 2H2O 0.2 g · L-1、KCl 5 g · L-1、胰蛋白胨2.5 g · L-1、酵母提取物l0 g · L-1、NaCl 100 g · L-1、以蒸馏水配制, pH 7.0~7.2, 121 ℃高压蒸汽灭菌20 min, 固体培养基中琼脂20 g · L-1.
2.2.2 复筛培养基NaCl 100 g · L-1、Tris 2 g · L-1、KCl 2 g · L-1、KNO3 1 g · L-1、NH4Cl 5 g · L-1、MgSO4 · 7H2O 24 g · L-1、MnSO4 · H2O 0.688 g · L-1、CaCl2 0.12 g · L-1、FeSO4 0.0304 g · L-1、Na2HPO4 0.142 g · L-1、酵母提取物0.2 g · L-1、胰蛋白胨0.2 g · L-1、苯酚0.2 g · L-1(过滤灭菌), 以蒸馏水配制, pH 8.0, 121 ℃高压蒸汽灭菌20 min, 固体培养基中琼脂20 g · L-1.
2.3 菌株的分离与纯化取沉积物5 g到三角瓶中, 加入100 mL浓度为15%的盐溶液, 振荡30 min, 取上清液10 mL加入到90 mL ATCC 213液体培养基中, 置于30 ℃、165 r · min-1恒温摇床中培养60 h, 取1 mL菌液接于99 mL的ATCC 213液体培养基, 采用以上方法转接3次.
取上述富集的菌液1 mL, 配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释液.取0.1 mL稀释液均匀涂布于ATCC 213固体培养基, 每个稀释度3个重复, 置于30 ℃下恒温培养, 观察平板上菌落的生长情况, 直至长出清晰可见的单菌落, 挑取其中的单菌落涂布于ATCC 213固体培养基, 经过3~4次分离纯化, 可获得菌株的纯培养.
2.4 苯酚降解菌的筛选驯化通过测定菌株的生物量及苯酚降解率, 筛选驯化出嗜盐苯酚降解菌.菌株筛选驯化分为两步, 首先吸取已纯化的单菌株富集培养液1 mL加入到99 mL含200 mg · L-1苯酚的复筛培养基中, 于30 ℃、165 r · min-1恒温摇床培养60 h, 此过程循环4次；其次在复筛培养基中另加葡萄糖, 于30 ℃、165 r · min-1恒温摇床驯化培养60 h, 此过程循环4次.
2.5 菌株的鉴定 2.5.1 形态特征及生理生化鉴定用扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)观察细胞形态特征.同时, 参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等, 2001)对筛选得到的菌株进行生理生化分析.
2.5.2 16S rDNA基因序列分子鉴定用细菌基因组DNA试剂盒(上海生工)提取菌株的基因组DNA.采用引物(27F：5′- AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACFGGCFTACFCT TFGTTFACGFACTFTF-3′)进行PCR扩增.扩增条件：94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸80 s, 28个循环后, 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存. PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测后送测(上海生工), 测序结果在Genbank中通过BLASTn序列进行同源性比较, 采用软件MEGA7中的邻位相接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树, 自展检验(bootstrap)1000次.
2.6 菌株生长及降解苯酚的特性 2.6.1 菌株生长及苯酚降解的条件在复筛培养基中, 分别于不同NaCl浓度(0、50、100、150、200 g · L-1)、不同苯酚初始浓度(0、100、200、400、600、800 mg · L-1)、不同培养温度(15、20、25、30、35 ℃)、不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、不同葡萄糖浓度(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g · L-1)、不同氮源(5 g · L-1 NH4Cl、5 g · L-1 NH4NO3、5 g · L-1尿素、0.2 g · L-1酵母提取物、0.2 g · L-1胰蛋白胨、复合氮源：KNO3 1 g · L-1、NH4Cl 5 g · L-1、酵母提取物0.2 g · L-1和胰蛋白胨0.2 g · L-1)条件下进行试验, 每个处理设置3个重复, 于30 ℃、165 r · min-1恒温摇床培养60 h, 测定其生物量和苯酚浓度.
2.6.2 菌株生长与苯酚降解随时间的变化特征将菌株接种于苯酚浓度200 mg · L-1, 盐浓度10%, pH 8.0, 葡萄糖浓度0.8 g · L-1的复筛培养基中, 30 ℃、165 r · min-1恒温振荡培养, 间隔6 h取样1次, 测定其生物量(OD600)和苯酚浓度.
2.7 苯酚降解菌的降酚动力学研究在H17的最佳培养条件下, 选取不同苯酚初始浓度0、100、200、400、600、800 mg · L-1, 于30 ℃、165 r · min-1恒温振荡培养, 每隔4 h取样进行菌株生物量及苯酚降解率的测定, 获得不同苯酚浓度所对应的细胞比生长速率(张海涛等, 2016).
2.8 分析方法 2.8.1 生物量的测定采用紫外分光光度法, 菌液在600 nm波长下的吸光度(OD600)来表示菌体生物量.
2.8.2 苯酚浓度的测定采用紫外分光光度法, 在270 nm波长下测定苯酚质量浓度.
2.8.3 菌体生长曲线的测定菌体质量浓度的计算：利用公式：DCW=314.5 × OD600, 将OD600值转化成干细胞的质量(于彩虹等, 2014).
2.8.4 数据分析采用origin 8.5对数据绘图和动力学参数拟合.运用SPSS 22.0统计软件对数据进行单因素方差分析, 在显著性P= 0.05水平进行Tukey′s-b法多重比较.
3 结果与分析(Results and discussion) 3.1 菌株的筛选与鉴定经过多次富集培养和筛选驯化, 共获得85株耐盐微生物, 从中选定一株能够高效降解苯酚的菌株, 命名为H17. H17菌落形态呈圆形、边缘整齐、菌落略隆起、表面湿润且光滑.在2%的盐度下, 扫描电镜结果显示(图 1), 菌体呈杆状, 不运动, 无鞭毛, 不产生芽孢. H17部分生理生化试验结果如表 1所示, H17革兰氏染色为阴性, 属于好氧型, 能够利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖等多种糖类物质, 不能利用明胶、酪蛋白类物质.
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| 图 1 H17电镜扫描图 Fig. 1 Scanning electron microscopy of H17 |
| 表 1 菌株H17生理生化特性 Table 1 Physio-biochemical characteristics of strain H17 |
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菌株H17的16S rDNA序列在Genbank核酸序列数据库中的注册号为KU934049.通过在Genbank中进行BLASTn序列比对, 挑选与菌株H17同源序列相似性最高的有代表性的菌株构建系统进化树. 图 2为菌株H17的系统进化发育树.通过该菌株的16S rRNA序列比对分析, 与其最相近的是泰安郡盐单胞菌(Halomonas taeanensis BH539), 相似性为99%.目前大家比较接受的是与已知微生物16S rDNA序列小于94%, 可以认为是一个新属, 95%—97%之间可认为是一个新种, 大于97%可认为是一个新菌株.因此H17是泰安郡盐单胞菌的一个新菌株, 建议分类名为Halomonas taeanensis H17.
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| 图 2 菌株H17与相近种16S rDNA序列进化树(其中Halomonas lutea(T) YIM 91125 (EF674852)中, Halomonas lutea细菌的属名和种名, YIM 91125菌株编号, T表示为模式种, EF674852为GenBank登录号) Fig. 2 Strain H17 and the similar species 16S rDNA sequence phylogenetic tree (Holomonas lutea (T) YIM 91125 (EF674852), the genus name and species name are Halomonas lutea, YIM 91125 is strain number, T is the model species, EF674852 is the GenBank accession number) |
图 3为不同盐浓度下H17的生长及苯酚降解情况.统计分析显示盐浓度对H17的生长及苯酚降解率均有显著性影响(p < 0.01).由图 3可知, H17在盐度0~20%时可以生长且高效降解苯酚.当盐度5%~10%时, H17的生物量和苯酚降解率可达到1.68和88.5%.随着盐度的增大, H17对苯酚的降解率呈现下降趋势.当盐度高达20%时, H17的生物量和苯酚降解率仍可以达到1.10和57.7%, 表明H17能够在高盐度条件下有效的降解苯酚.
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| 图 3 不同NaCl浓度对H17的生长及苯酚降解的影响 Fig. 3 Effects of different salinity on H17 growth and phenol degradation efficiency |
Lu等(2015)筛选获得的嗜盐菌能够在盐度3%~12%范围内降解苯酚. 王丽娟等(2017)发现芽孢杆菌CCZU-R6在盐度为11%可以降解苯酚, 当盐度为14%时, 不能降解苯酚.因此, H17与现有菌株相比, 对于高盐含酚废水的处理更具优势.
3.2.2 苯酚初始浓度对菌株生长及苯酚降解的影响图 4为苯酚不同初始浓度下H17的生长及苯酚降解情况.统计分析显示苯酚浓度对H17的生长及苯酚降解率均有显著性影响(p < 0.01).由图 4可知, H17在苯酚浓度200 mg · L-1时, 其生长量和苯酚降解率达到1.68和90.1%.当苯酚浓度为600 mg · L-1时, H17的生物量仍可以达到1.26, 表明H17在高盐条件下对苯酚有很强的耐受能力.
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| 图 4 不同苯酚浓度对H17的生长及苯酚降解的影响 Fig. 4 Effects of phenol concentration on H17 growth and phenol degradation efficiency |
进一步加大苯酚浓度, H17的生物量和苯酚降解率呈现下降趋势.这可能是由于高浓度苯酚毒性太大对H17的生长产生了危害(Hu et al., 2014). Ceylan等(2011)研究发现, 受试菌株最高能耐受的苯酚浓度为800 mg · L-1, 超过此浓度菌株生长及苯酚的降解将受到严重抑制.
3.2.3 温度和pH对菌株生长及苯酚降解过程的影响图 5和6为不同温度和pH下H17的生长及苯酚降解情况.统计分析显示温度和pH的变化对H17的生长和降解苯酚能力有显著性影响(p < 0.01).由图 5可知, 当培养温度为30 ℃时, 其生物量和苯酚降解率达到1.61和78.6%.当培养温度超过30 ℃, 随着温度的升高H17的生长量和苯酚降解率均降低.分析其原因主要是温度影响微生物体内酶的活性和酶促反应速率, 最终影响底物降解速率(王少峰等, 2013).
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| 图 5 不同温度对H17的生长及苯酚降解的影响 Fig. 5 Effects of different temperature on H17 growth and phenol degradation efficiency |
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| 图 6 不同pH对H17的生长及苯酚降解的影响 Fig. 6 Effects of pH on H17 growth and phenol degradation efficiency |
和其他细菌一样(刘国生等, 2017；Ranjitha et al., 2017), H17的生长需要适宜的温度使其各种酶发挥作用, 30 ℃为H17生长的适宜温度.此外, 培养基初始pH对微生物的酶也有类似影响.如图 6所示, 在pH 7~8时, H17均能良好的生长, 且可以高效降解苯酚, 而在强酸或强碱条件下, 该菌株的苯酚降解能力受到抑制.
3.2.4 葡萄糖浓度对菌株生长及苯酚降解的影响图 7为不同葡萄糖浓度下H17的生长及苯酚降解情况.统计分析显示葡萄糖浓度对H17的生长及苯酚降解率均有显著性影响(p < 0.01).由图 7可知, 随着葡萄糖浓度的增大, H17的生物量在不断升高.而苯酚降解率呈先升高后降低的趋势, 当葡萄糖浓度为0.8 g · L-1时, 苯酚降解率达到82.6%.
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| 图 7 葡萄糖浓度对H17的生长及苯酚降解的影响 Fig. 7 Effects of glucose concentration on H17 growth and phenol degradation efficiency |
这表明外加碳源促进了H17的生长使其能够更好地降解苯酚, 但是过量的碳源又会抑制苯酚的降解, 其原因可能是培养基中的葡萄糖达到一定浓度后, 菌株优先利用葡萄糖, 抑制了苯酚的降解(江红等, 2010). 张海涛等(2016)研究耐盐菌降解苯酚的条件时发现, 添加碳源对菌株降解苯酚效率的影响较大, 初始阶段菌株降解苯酚受到抑制, 在后期苯酚的降解率有明显上升趋势.
3.2.5 氮源对菌株生长及苯酚降解过程的影响图 8为不同氮源条件下H17的生长及苯酚降解情况.统计分析显示氮源种类对H17的生长及苯酚降解率均有显著性影响(p < 0.01).如图 8所示, 添加复合氮源比单一氮源对H17的生长以及苯酚降解率具有更明显的促进作用.单一氮源对于H17降解苯酚的促进作用顺序为尿素>胰蛋白胨>酵母提取物>氯化铵>硝酸铵.结果表明, 复合碳源对H17降解苯酚的影响较大, 其次是有机氮源, 最后是无机氮源, 这与王静等(2012)的研究结果一致.
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| 图 8 氮源对H17的生长及苯酚降解的影响 Fig. 8 Effects of nitrogen source on H17 growth and phenol degradation efficiency |
苯酚降解菌H17在最适生长降解条件下, 其生长量与苯酚降解率随时间的变化曲线如图 9所示. H17的生长延滞期大约为6 h, 6 h后迅速进入对数生长期, 在此期间, 生物量急剧上升, 苯酚降解率的增长最快, 表明H17对苯酚的降解主要发生在对数生长期. 30 h到稳定期, 此阶段生物量达到1.83.大约56 h进入衰退期, 由于培养基中没有新的碳源补充, 代谢产物不断积累, H17的生长受到抑制, 因此苯酚降解率虽然在增长, 但是增长幅度变小.
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| 图 9 H17生长量与苯酚降解率随时间的变化 Fig. 9 Growth and phenol degradation of H17 with time |
在高浓度苯酚条件下, H17的生长受到抑制.因此试验建立苯酚抑制生长动力学模型, 采用Haldane方程拟合不同苯酚浓度下细胞比生长速率与底物浓度之间的关系(葛启隆等, 2014).
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(1) |
式中, μx为微生物比生长速率；μmax为最大比生长速率；Cs为底物浓度；Ks为饱和常数；Ki为抑制常数.通过非线性最小二乘法对μx-Cs数据按照Haldane方程拟合(图 8), 可得到动力学参数的值, 如表 2所示.结果表明苯酚降解模型动力学方程曲线与实验值拟合良好. H17对苯酚的降解动力学方程为：
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(2) |
| 表 2 菌株生长动力学模型Haldane模型模拟参数 Table 2 Phenol degradation kinetics of Strain H17 |
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| 图 10 苯酚降解模型动力学方程拟合曲线 Fig. 10 Phenol degradation dynamics equation model |
1) 从巴丹吉林沙漠盐湖底泥中分离到1株能够在高盐环境下高效降解苯酚菌H17, 初步鉴定该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas sp.).
2) H17可以在0~20%的盐度下生长并有效降解苯酚, 外加适量的碳源和氮源能够促进其生长及降解苯酚的能力.
3) H17能适应广泛的环境条件, 可以在pH 6~8、温度25~30 ℃、盐度5%~20%的范围内生长良好, 且均能够保持对苯酚较高的降解能力.
4) H17对苯酚具有较强的耐受性, 其苯酚降解动力学符合Halane模型, 该模型拟合良好, 具有很好的有效性.
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