2019, Vol. 39
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苔藓是一类较佳的空气重金属沉降监测植物, 并在欧洲长期而广泛的应用(Harmens et al., 2015; Lazo et al., 2018).与化学分析法、生态学途径等其他监测方法相比, 苔藓监测法具有成本低、适合大范围监测等优点(方炎明等, 2000).在大空间尺度上, 利用多种苔藓作为指示植物已成为趋势.欧洲联合监测国家采用塔藓(Hylocomium splendens)、灰藓(Hypnum cupressiforme)、赤茎藓(Pleurozium schreberi)和疣柄藓(Scleropodium purum)4种藓类监测空气重金属污染(Harmens et al., 2015).为监测某区域的空气重金属沉降, 很多研究采用苔藓与其它植物类群联合的方式, 例如, 苔藓与地衣(Ite et al., 2014; Vingiani et al., 2015)、苔藓与种子植物(De Nicola et al., 2013)的联合监测效果都很好.利用多种苔藓联合监测空气重金属沉降的实践或方法, 本文将其称为“多藓种监测途径”.
多藓种监测途径既有利, 也有弊.它可以弥补单藓种监测途径的弊端, 克服因藓种分布区局限或不均匀带来的欠缺, 但也可能因不同藓种对重金属吸附能力的差异而引起误差.对此, 有学者提出并采用校准因子(Calibration Factors)来进行修正(Folkeson, 1979), 校准因子法也因此得到了诸多学者的认同和应用(Sloof et al., 1993; Wolterbeek et al., 1995; Galsomiès et al., 2003; Harmens et al., 2010; Balabanova et al., 2017).另一方面, 测定仪器的误差也是影响监测数据质量的一个重要因素.欧洲学者采用标准样品的方法来验证仪器的准确度和数据的可靠性, 并提供推荐测定值及其误差限, 从而解决了仪器误差问题.目前, 欧洲的标准藓样采自芬兰半郁闭松林, 样品主要来自3个地点：Puolanka(M1)、Enontekiö(M2)和Harjavalta(M3), 其中, M1和M2为无污染的背景生境, M3则为有污染物释放的生境(Steinnes et al., 1997).这些标准藓样不仅得到国际原子能机构(IAEA)的采用(Smodiš et al., 2007), 而且常用于藓类监测重金属污染实践, 包括整个欧洲联合监测(Harmens et al., 2010; Schröder et al., 2013)和欧洲自主监测的有关国家, 而欧洲自主监测的国家有阿尔巴尼亚(Qarri et al., 2014a; Allajbeu et al., 2017)、克罗地亚(Špirić et al., 2014)、拉脱维亚(Tabors et al., 2017)、马其顿(Balabanova et al., 2017)、葡萄牙(Piairo et al., 2014)、斯洛文尼亚(Berisha et al., 2017)、西班牙和意大利(Capozzi et al., 2017).
在中国, 利用苔藓监测空气重金属污染已经有多年的实践(方炎明, 2010).然而, 到目前为止, 中国的重金属污染监测一般采用单藓种监测途径, 而且尺度仅在城市或含区县的地级市, 如上海(安丽等, 2006b)、无锡(Yan et al., 2016; Hu et al., 2018)、徐州(Liu et al., 2016)、泰州(Zhou et al., 2017)、扬州(徐丹丹等, 2017)和武汉(Jiang et al., 2018)等.因单种苔藓分布区的局限性和不均衡性, 不利于地区、省区乃至全国范围的大尺度监测, 因此, 有必要研究多藓种监测途径.与此同时, 大尺度的联合监测需要多团队、多实验室的协同攻关, 实验仪器的校准也很有必要, 借此还可与欧洲的监测结果进行比较.因此, 引入欧洲的苔藓标样作为参考也是十分必要的.基于此, 本文以监测重金属污染实践中常用的细叶小羽藓为基础, 采用藓种间校准的方法, 探讨多藓种监测途径的可行性；同时, 引入欧洲的苔藓标样(M2和M3)作为参考, 探究多实验室联合监测的可行性；最后, 提供一个与欧洲类似监测实践具有可比性的研究案例进行探究.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 采样地点洪泽湖是中国第四大淡水湖, 位于北纬33°06′~33°40′、东经118°10′~118°52′之间, 为淮河中下游结合部.周边地区属北亚热带和暖温带过渡地带, 具有季风性和兼受洪泽湖水体调节的气候特点.受季风气候影响, 湖区周边地区四季分明, 雨热同季, 冬冷夏热, 年平均气温为14.1~14.8 ℃；雨量充沛, 年均降水906~1007 mm；地势平坦, 海拔为2~231 m.淮安市和宿迁市环绕其四周(图 1), 本研究区域位于淮安市盱眙县、洪泽区和淮阴区.
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| 图 1 采样点分布图 (1.铁佛镇; 2.明祖陵镇; 3.官滩镇; 4.观音寺镇; 5.鲍集镇; 6.老子山镇; 7.东双沟镇; 8.赵集镇) Fig. 1 Distribution map of sampling sites |
采样时间为2017年7月, 采用多点采样法采集8个样点的苔藓植物(梁鹏等, 2008).为减少生境变化对实验的影响, 采集的苔藓生境均为草地土生.分别在每个样点中设置5个1 m ×1 m的小样地, 在小样地内按5点取样法设置5个10 cm×10 cm的小样方, 采集小样方内的所有苔藓植物(付兰等, 2012), 共采集藓类样品200份.同时, 在每个小样地内采集细叶小羽藓Haplocladium microphyllum, 以便做校正使用.为避免天气因素对样品的影响, 采集周期尽可能短, 采样时段均为晴天.采样所用工具材料均为非金属材质, 以避免对样品造成金属污染.采集的样品带回实验室, 对藓样进行研究鉴定.
2.3 样品处理、化学分析与数据处理藓样(含细叶小羽藓)经人工去除表面的杂质后, 挑选绿色鲜活的苔藓放在自来水中冲洗干净, 再用超纯水清洗3次, 晾干, 置于40 ℃烘箱内烘干至恒重；然后加液氮研磨并烘干, 装入洁净自封袋中备用.
采用“湿法灰化法”对藓样进行处理(魏树和等, 2008).取藓样0.5 g, 置于50 mL锥形瓶中, 加入10 mL混合酸(HClO4:HNO3 = 1:4)浸泡48 h, 于通风橱中消煮至溶液澄清后加入2 mL稀硝酸(HNO3:H2O = 1:1), 消煮至白烟冒尽, 冷却后用蒸馏水定容至25 mL容量瓶中备用.每个样品均做平行双样处理, 每批样品消煮均设置空白对照, 以消除实验误差.分析所用试剂均为分析纯, 实验所用玻璃仪器均用2%的HNO3浸泡24 h以上、超纯水冲洗3次.利用美国Perkin Elmer公司Optima 8300型电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定Cr、Cu、Mn、Zn、Ni、V、Ba、Al、Fe 9种金属元素的含量, 利用Perkin Elmer公司NexION 300X型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定Cd、Co、Pb 3种金属元素的含量.12种金属中除Al、Fe和Ba为轻金属外, 其余9种均为重金属.
运用Excel 2016统计和分析金属元素含量和校准因子.根据18种藓类金属元素的含量, 运用SPSS 21.0 (IBM Corporation, Somers, NY, USA)软件中的最远邻元素方法进行聚类分析(CA).
2.4 标准样品分析与苔藓植物的种间校准因子为保证测定仪器的准确性, 进行了标准样品分析.苔藓标准样为欧洲标样M2、M3, 采用上述两台相同的仪器测定M2和M3中上述12种元素的含量.对比欧洲标准苔藓样品中金属元素含量的实测值与推荐值, 判断仪器检测的金属元素含量是否符合质量控制要求(Steinnes et al., 1997; Harmens et al., 2010).
由于不同苔藓植物的金属富集能力不同, 所以在没有种间校准的情况下, 使用不同的苔藓植物进行环境监测评估可能得出不同的结果.因此, 需要对不同的苔藓进行校正, 通过计算出不同苔藓间的校准因子, 来估算出某样点内未出现的苔藓植物金属含量.本文利用实验测得的细叶小羽藓和18种替代苔藓的金属含量(平均值±95%置信限), 计算出替代苔藓的校准因子.校准因子计算方法(Folkeson, 1979)如下：细叶小羽藓中Al含量95%置信上限为8384.00 mg·kg-1, 下限为4110.67 mg·kg-1, 净口藓中Al含量95%置信上限为6481.31 mg·kg-1, 下限为6108.69 mg·kg-1, 其中, 6108.69/8384.00 = 0.73(最小值), 6481.31/4110.67 = 1.58 (最大值).最大值与最小值之和的平均值是1.15, 最大值与最小值之差的平均值是0.42.因此, 从净口藓Al含量估算细叶小羽藓中Al含量的校准因子为1.15±0.42.平均值±95%置信限由SPSS 21.0分析得出.
3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 标准藓样M2和M3的检测结果欧洲标准苔藓样品中金属元素含量的实测值与推荐值如表 1所示.对比M2和M3的检测结果, 实测值在推荐值的误差限之内, 表明检测仪器所测金属元素含量符合欧洲质量控制要求.
| 表 1 苔藓标样M2和M3中金属元素含量的推荐值和实测值 Table 1 Recommended and observed values for elemental concentrations in reference moss samples M2 and M3 |
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文献记载, 江苏省有藓类植物38科、131属、353种(张政等, 2006), 江苏北部地区有藓类植物30科、58属、153种(李莎等, 2012).从本次采集的藓类植物标本中, 共鉴定到藓类植物9科、14属、18种(表 2), 其中, 丛藓科4属、6种, 占总数的33.33%.无论从属还是种来排列, 丛藓科都是优势科, 说明丛藓科植物普遍存在于洪泽湖地区, 其它科均含有1~2种藓类植物.通过核对《中国苔藓志》(第1~8卷)、中科院植物所标本馆数据库(http://pe.Ibcas.ac.cn)、中国数字植物标本馆(http://www.cvh.org.cn)、中国自然标本馆(http://www.nature-museum.net/)、中国植物图像库(http://www.plantphoto.cn/)和全球生物多样性信息网络(https://www.gbif.org/), 本次采集发现江苏省新记录种5个, 它们分别是小扭口藓Barbula indica (Hooker) Sprengel、平叶毛口藓Trichostomum planifolium (Dixon) R.H. Zander、斜枝青藓Brachythecium campylothallum Müll. Hal.、变形小曲尾藓Dicranella varia (Hedw.) Schimp.和异枝绢藓Entodon divergens Broth., 其余13种藓类植物在江苏省地区的分布已有报道(中国科学院中国孢子植物志委员会, 1994; 沈蕾, 2011).
| 表 2 洪泽湖地区的藓类植物 Table 2 Mosses in Hongze Lake region |
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洪泽湖地区苔藓中不同金属元素含量差异十分明显(表 3).在所有藓样中, 12种金属元素含量平均值呈以下趋势：Fe>Al>Mn>Zn>Ba>V>Cu>Cr>Pb>Ni>Co>Cd, Fe和Al的含量范围明显高于其他金属元素, 高出Cu、Ni、Cr、V、Cd、Pb、Co 2~3个数量级.
| 表 3 18种藓体中的金属元素含量平均值 Table 3 Mean concentrations of metal elements in 18 species of mosses |
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在12种金属元素中, Al和Fe的含量范围分别为1897.5~10625 mg·kg-1和3530.17~12731.67 mg·kg-1.Al含量最高值见于毛口藓、真藓和中华细枝藓, 最低值出现在绢藓、卷叶湿地藓和皱叶毛口藓；Fe含量以毛口藓、中华缩叶藓和真藓最高, 以皱叶毛口藓、卷叶湿地藓和小扭口藓最低.因此, 毛口藓和真藓既富集Al, 又富集Fe；而卷叶湿地藓和皱叶毛口藓则对高含量的Al和Fe有一定的排斥能力.
Mn含量变化范围为116.73~551.83 mg·kg-1, 含量最高的是中华缩叶藓, 其次为毛口藓, 两者相差152.75 mg·kg-1；含量最低的为小扭口藓, 其次是斜枝青藓；同为丛藓科, 毛口藓的Mn含量是小扭口藓的3.4倍, 富集能力显著不同；而青藓科的灰白青藓和斜枝青藓Mn含量相差不大.Zn在藓体内含量范围为74.93~278.01 mg·kg-1, 高峰值出现在异枝绢藓, 其次是净口藓；低峰值出现在葫芦藓(77.04 mg·kg-1)和真藓(74.93 mg·kg-1)；净口藓的Zn含量是小扭口藓的2.88倍.因此, 丛藓科既有富集Mn、Zn的种类(如毛口藓和净口藓), 也有排斥Mn、Zn的种类(如小扭口藓).
Cu含量(15.97~49.33 mg·kg-1)最高的是绢藓, 其次是变形小曲尾藓, 两者相差11.63 mg·kg-1；含量最低为斜枝青藓, 其次为卷叶湿地藓, 绢藓Cu含量是斜枝青藓的3.09倍.藓体中Pb含量范围为4.78~36.46 mg·kg-1, 含量最高的为异枝绢藓, 其次是净口藓, 两者相差11.88 mg·kg-1；含量最低是灰白青藓, 其次是小扭口藓, 异枝绢藓Pb含量是灰白青藓的7.63倍, 同是丛藓科的净口藓Pb含量是小扭口藓的3.1倍, 差异显著.
藓类中的Ni含量范围是5.81~34.21 mg·kg-1, 含量最高的两种藓为中华缩叶藓(34.21 mg·kg-1)和泛生丝瓜藓(22.73 mg·kg-1), 最低的两种藓是小扭口藓(5.81 mg·kg-1)和卷叶湿地藓(7.94 mg·kg-1)；毛口藓(16.54 mg·kg-1) Ni含量是小扭口藓的2.85倍, 差异显著, 而与同科的净口藓(14.16 mg·kg-1)相差不大.Cr含量范围为14.88~44.2 mg·kg-1, 含量最高为中华缩叶藓, 其次为毛口藓(35.47 mg·kg-1)和异枝绢藓(33.1 mg·kg-1)；含量最低的是为灰白青藓, 其次为卷叶湿地藓, 同科的牛角藓和柳叶藓Cr含量相近, 且富集Cr的能力较低.
V在藓体中的含量范围是23.1~76.18 mg·kg-1, 含量最高的两种藓是葫芦藓(76.18 mg·kg-1)和卷叶湿地藓(65.55 mg·kg-1), 绢藓科的异枝绢藓和绢藓V含量差异较小, 丛藓科的平叶毛口藓和毛口藓V含量相差1.90 mg·kg-1, 含量最低的是牛角藓.Ba含量范围是63.40~182.33 mg·kg-1, 含量最高的为毛口藓, 最低的为小扭口藓, 其次为皱叶毛口藓(74.43 mg·kg-1), 卷叶湿地藓、净口藓和平叶毛口藓含量分别为75.00、152.98、137.05 mg·kg-1, 同为丛藓科的6种藓类植物Ba含量差异显著, 说明同科苔藓对同一元素富集能力不同.
藓体中Co含量范围是3.48~15.57 mg·kg-1, 含量最高的为中华缩叶藓, 其次为泛生丝瓜藓；含量最低的两种藓属于青藓科的斜枝青藓和灰白青藓, 说明青藓科对Co的富集能力显著低于其他科.Cd含量范围为0.39~1.56 mg·kg-1, 含量最高的是灰白青藓, 含量最低的是同为青藓科的斜枝青藓, 灰白青藓Cd含量是斜枝青藓的4倍, 说明青藓科藓类对Cd富集能力差异显著.
根据表 3的数据, 可将上述18种藓类植物人为地分为4种类型：富集型、排斥型、富集/排斥型和一般型(表 4).富集型, 即具有元素富集特征的藓种；排斥型, 即具有元素排斥特征的藓种；富集/排斥型, 即兼具元素富集和元素排斥特征的藓种；一般型, 即不具明显富集/排斥特征的藓种.按照12种金属元素含量的聚类分析结果, 可将18种藓类植物分为3类(图 2).I类相当于表 4中的一般型(真藓和中华细枝藓)和富集/排斥型(毛口藓和中华缩叶藓).II类和III类分别对应表 4中的富集型和排斥型, 唯一的差别是斜枝青藓, 表 4将其归入卷叶湿地藓所在的组, 而聚类分析将其归入异枝绢藓所在的组.因此, 表 4的分组得到了聚类分析的佐证.
| 表 4 18种藓类对金属元素的富集与排斥特征 Table 4 Enrichment and exclusion characteristics to metals in 18 species of mosses |
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| 图 2 基于金属元素含量的藓类树状图 Fig. 2 Dendrogram of mosses based onmetal element concentrations |
以细叶小羽藓为基准, 计算出洪泽湖地区18种藓类植物校准因子(表 5).有了校准因子数据, 就可以用扩大监测范围, 或弥补某些盲区.例如, 在用常见藓种细叶小羽藓监测某区域的重金属污染时, 某个样点缺少细叶小羽藓, 但有净口藓, 就可以校准因子来估算.细叶小羽藓Al含量 = 净口藓Al含量×校准因子 = 6295 mg·kg-1×1.15 = 7239.25 mg·kg-1.又如, 某样点缺少细叶小羽藓, 但有小扭口藓, 则细叶小羽藓Ba含量 = 扭口藓Ba含量×校准因子 = 63.4 mg·kg-1×0.72 = 45.65 mg·kg-1.已知18种藓类植物相对于细叶小羽藓的校准因子, 采到任意其中一种藓类, 由此可以估算某样点中细叶小羽藓的金属含量.
| 表 5 洪泽湖地区18种藓类植物校准因子 Table 5 Calibration factors for 18 species of mosses in the Hongze Lake region |
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比较苔藓标样M2和M3中金属元素含量的推荐值和实测值可知, M2的实测值是推荐值的94%(Cr)~106%(V), M3的实测值是推荐值的86%(Mn)~109%(Cr), M2和M3的实测值与推荐值的差异在15%以内.Harmens等(2010)在欧洲苔藓监测中报告了M2平均值/推荐值的变化范围是85%(As)~105%(Sb), M3平均值/推荐值的变化范围为92%(Cr)~113%(As).本研究实测值与推荐值高度吻合, 说明ICP-AES和ICP-MS设备精密度良好.国外学者于1995年在欧洲20个国家的实验室中测定了M2和M3中27种微量元素, 用于评估参与实验仪器的分析能力(Steinnes et al., 1997).此外, 一些实验室使用其他经过认证的参考材料进行质量保证(Schröder et al., 2009; Kluge, 2013; Meyer et al., 2015).为了保证参考材料中元素含量的准确性, 各实验室采用相同的分析方法进行测定, 对所获M2和M3的测定数据进行比较, 以保证各实验室之间分析仪器的准确性和一致性.当M2和M3的值出现异常时, 需使用校准因子来校准, 校准因子可以增强各国之间数据的相容性(Harmens et al., 2015).尽管采用校正因子增强了各国数据间的相容性, 但异常值几乎不会影响苔藓中元素含量的平均值和中值, 因此, 不会显著影响苔藓的富集特征.欧洲学者同样报道了质量控制结果(Qarri et al., 2014b; 2015; Schröder et al., 2016; Maxhuni et al., 2016), 说明以苔藓M2和M3作为参考标准样品, 多实验室进行跨地区联合监测是可行的.
苔藓样品中Fe和Al含量显著高于其他金属元素, 可能因为Fe和Al是典型的地壳土壤元素, 质量丰度较高(Clarke et al., 1924; 黎彤等, 1997).Cd含量均值最小, 可能因为Cd不是地壳元素, 主要受工业污染和人类活动的影响(Qarri et al., 2015).本研究结果表明, 在相同环境条件下, 同科苔藓对同一种金属元素富集能力差异显著, 如丛藓科的6种藓类对Ba的富集能力不同.不同苔藓对同一种元素的富集能力不同, 同一种苔藓对不同元素的富集能力不同, 这与安丽等(2006a)的研究结果一致.这是由于不同苔藓植物体的结构、生物特性及每种元素在苔藓植物体内的吸附、转化、代谢机制不同造成的(Brown, 1984; 吴鹏程, 1998).
根据藓类的金属元素富集特征可以将藓类分为4类, 在应用苔藓监测空气重金属的过程中建议采用富集型和一般型藓类, 如真藓、中华细枝藓、异枝绢藓、葫芦藓、变形小曲尾藓、平叶毛口藓、灰白青藓、绢藓、柳叶藓、净口藓和泛生丝瓜藓.而卷叶湿地藓、皱叶毛口藓、小扭口藓、牛角藓4种苔藓对金属元素具有强烈的排斥作用, 因此, 不推荐用于监测大气重金属.毛口藓与中华缩叶藓同归为富集/排斥型是由于两者对金属元素具有相似的强烈富集或排斥作用, 对Al、Fe、Mn、Pb和Ba进行监测时可以应用毛口藓, 中华缩叶藓可以监测Fe、Mn、Ni、Pb、Co和Cr.聚类分析中与柳叶藓聚为一类的斜枝青藓归为排斥型藓类, 是由于其对Mn、Ni、Cd、Pb和Co具有强烈的排斥作用.Gorelova等(2016)研究发现, 与其他物种相比, Oxyrrhynchium hians、Eurhynchium angustirete和Orthotrichum speciosum具有较高的微量元素富集能力, 并推荐此三者为俄罗斯图拉大气微量元素的生物监测物种.在本研究中, 一般型和富集型藓类对金属元素具有较高的积累作用, 因此, 推荐一般型和富集型藓类用于江苏省大气沉积监测.
Folkeson(1979)采集了瑞典针叶林地区9种苔藓和地衣并计算出多种重金属的校准因子, 通过替代苔藓的重金属含量和校准因子来推算某采样点某种苔藓的重金属含量, 从而进行有效的环境监测与评估.在环境监测评估中, 考虑到苔藓分布范围的局限性, 可以计算多种替代苔藓的校准因子.Carballeira等(2008)通过线性回归对大绢藓和灰藓的重金属含量进行相互校准.但如果在同一监测调查中使用不同苔藓, 建议使用苔藓间校准因子进行种间校准, 借助校准因子可以减小种间差异对研究带来的影响, 同时, 欧洲学者的研究验证了这一观点(Galsomiès et al., 2003).基于所研究的苔藓物种可以选择几种富集作用较强的替代苔藓用于环境监测.对于与本研究区域大气沉积差别较大的地区, 可以根据当地苔藓物种建立单独的校准因子进行研究, 而本研究计算的校准因子适用于洪泽湖周边区域.
5 结论(Conclusions)1) 本研究中M2和M3中金属含量的实测值与推荐值的差异在15%以内, 说明ICP-AES和ICP-MS设备精密度良好.
2) 本次共采集藓类植物9科、14属、18种, 其中, 丛藓科4属、6种, 占总数的33.33%, 无论从属还是种来排列, 丛藓科都是优势科.同时, 本次研究发现江苏省新记录种5个, 分别是小扭口藓Barbula indica (Hooker) Sprengel、平叶毛口藓Trichostomum planifolium (Dixon) R.H. Zander、斜枝青藓Brachythecium campylothallum Müll. Hal.、变形小曲尾藓Dicranella varia (Hedw.) Schimp.和异枝绢藓Entodon divergens Broth..
3) 洪泽湖地区苔藓中不同金属元素含量水平差异十分明显.在所有藓样中, 12种金属元素含量平均值呈以下趋势：Fe>Al>Mn>Zn>Ba>V>Cu>Cr>Pb>Ni>Co>Cd, 在相同环境条件下, 同科苔藓对同一种金属元素富集能力差异显著, 不同苔藓对同一种元素富集能力不同, 同一种苔藓对不同元素富集能力不同.根据藓类的金属元素富集特征可以将藓类分为4类：一般型、富集型、富集/排斥型和排斥型, 本研究推荐将一般型和富集型藓类应用于江苏省大气重金属沉降监测.
4) 根据洪泽湖区细叶小羽藓的重金属含量建立了适宜本地重金属监测的种间校准因子, 可以进行有效的环境监测与评估.
致谢: 感谢南京林业大学生态学实验室、分析测试中心对本研究提供的技术支持, 感谢内蒙古大学生命科学学院冯超老师对苔藓鉴定工作提供的帮助.
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