2019, Vol. 39
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2. 江苏省水处理技术与材料协同创新中心, 苏州 215009
2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Technology and Material of Water Treatment, Suzhou 215009
厌氧消化(AD)是污泥处理中常用的稳定减容工艺, 具有能耗低、运行成本低、污泥稳定性好等特点.水解、酸化、乙酸化和甲烷化是污泥厌氧消化的4个阶段, 甲烷是最终产物.近年来, 有机物厌氧消化过程的中间产物挥发性脂肪酸(尤其是乙酸)受到越来越多的关注, 乙酸是许多微生物的良好碳源, 可作为发酵工业的生产原料来生产高附加值的发酵产品, 如生物塑料、生物能等.并且将污泥有机物转化成乙酸而非甲烷, 可减少温室气体排放(Lee et al., 2014).然而, 乙酸作为污泥厌氧消化的重要中间产物, 很容易被产甲烷菌利用而快速消耗.因此, 抑制产甲烷菌是促进乙酸积累的有效手段.抑制产甲烷菌的方法众多, 其中, 最常用和最有效的方法是添加化学抑制剂.氯仿(CHCl3)是一种广谱型抑制剂, 其在抑制产甲烷菌的同时可能对非产甲烷菌活性也有一定影响(Chidthaisong et al., 2000; Liu et al., 2011; Braga et al., 2016).
同型产乙酸菌是兼自养和异养代谢于一身的混合营养型细菌, 可通过厌氧乙酰辅酶A途径, 以CO2为末端电子受体, 并将其合成为代谢产物和细胞物质(Drake et al., 2008).据统计, 厌氧微生物平均每年能够合成1013 kg的乙酸, 其中, 通过同型产乙酸菌合成的乙酸量约占10%, 即1012 kg乙酸.由此可见, 同型产乙酸菌对厌氧微生物代谢产乙酸具有重要贡献(Wood et al., 1991).在污泥厌氧消化产甲烷抑制体系中, 同型产乙酸菌可消耗体系中的H2/CO2, 解除产氢产乙酸过程中的氢抑制, 产生更多的乙酸.利用同型产乙酸菌和产氢产乙酸菌的互营关系构建的产氢产酸/同型产乙酸耦合系统, 可将厌氧发酵产酸率提高29%~87%(Nie et al., 2007).同样, 添加同型产乙酸菌富集污泥可使有机废水发酵系统的乙酸产量显著提高(马琳, 2012).然而上述的污泥厌氧产酸体系均采用加热法直接灭活产甲烷菌, 且产甲烷抑制剂的存在对同型产乙酸作用的影响研究报道较少.本课题组在研究污泥厌氧消化中微生物群落对产甲烷抑制剂的响应时发现, 氯仿抑制条件下同型产乙酸菌的数量出现明显下降, 污泥产酸率和产氢产乙酸活性也有明显下降(Xu et al., 2010a).然而, 污泥厌氧消化体系中产甲烷抑制剂氯仿对同型产乙酸作用的影响仍不明确, 且不同消化温度时其影响也有待进一步研究.
值得注意的是, 污泥厌氧消化过程中同型产乙酸菌、水解发酵菌和产氢产乙酸菌均代谢产生乙酸, 因此, 从代谢产物上难以区分乙酸的生成来源, 这使得研究产甲烷抑制剂对同型产乙酸作用的影响成为一个难点.乙酸的稳定性碳同位素分馏效应可作为一种新手段来阐释乙酸生成和转化相关的代谢过程(Conrad et al., 2014; Freude et al., 2016).基于纯菌株的研究表明, 水解发酵产乙酸作用的稳定性碳同位素分馏效应几乎可以忽略(<5‰)(Blaser et al., 2016)；同型产乙酸菌则优先利用CO2中的轻碳12C, 导致乙酸的稳定碳同位素分馏效应明显(-38‰~68‰)(Blaser et al., 2013).湖泊底泥、酸性沼泽和土壤等样品的厌氧培养实验表明, 当乙酸主要来源于水解发酵作用时, 乙酸13C丰度接近基质总有机碳δ13C, 乙酸和有机碳之间同位素分馏效应较小；然而, 同型产乙酸菌产生的乙酸与总有机碳相比显示出显著的13C丰度稀释(δ13Cacetate < δ13CTOC), 此时乙酸和有机碳之间稳定碳同位素分馏效应明显(Hädrich et al., 2012; Conrad et al., 2014; Beulig et al., 2015; Mach et al., 2015).基于以上手段有研究发现, 同型产乙酸作用在低温(15 ℃)和高浓度H2/CO2条件下对稻田土壤有机质厌氧降解有着重要贡献(Fu et al., 2018).可见, 通过分析乙酸的碳同位素分馏效应, 一定程度上可实现产甲烷抑制条件下同型产乙酸作用的贡献评估.
基于此, 本文通过添加产甲烷抑制剂氯仿进行废水污泥的厌氧消化实验, 测定乙酸、CH4、CO2及其稳定碳同位素丰度(δ13C), 定量同型产乙酸菌数量及相对丰度, 研究不同氯仿浓度对同型产乙酸作用的影响, 并基于乙酸的稳定性碳同位素分馏效应, 研究不同温度条件下氯仿对自养/异养同型产乙酸作用的影响.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 样品来源及培养基成分实验所用的废水污泥样品取自于无锡某污水处理厂二沉池的剩余污泥, 污泥含水率为85.65%.在氮气的保护下采集样品, 并储存于4 ℃的冰箱中.用于污泥厌氧发酵的培养基配方如下：葡萄糖14.40 g, 酵母粉3.20 g, CaCl2 0.72 g, KH2PO4·H2O 0.65 g, NaHCO3 0.96 g, MgSO4·7H2O 0.96 g, MnCl2 0.11 g, NH4Cl 2.40 g, FeSO4·7H2O 0.12 g, 添加蒸馏水至1000.00 mL, 调整pH至7.0.
培养基中加入微量元素：硝基三乙酸1.50 g, MgSO4·7 H2O 3.00 g, MnSO4·H2O 0.50 g, NaCl 1.00 g, FeSO4·7H2O 0.10 g, CoSO4·7H2O 0.18 g, CaCl2·2H2O 0.10 g, ZnSO4·7H2O 0.18 g, CuSO4·5H2O 0.01 g, KAl(SO4)2·12H2O 0.02 g, H3BO3 0.01 g, Na2MoO4·2H2O 0.01 g, NiCl2·6H2O 0.03 g, Na2SeO3·5H2O 0.30 mg, Na2WO4·2H2O 0.40 mg, 添加蒸馏水至1000.00 mL, 调整pH为7.0.
亚硒酸钨酸盐溶液：NaOH 0.50 g, Na2SeO3·5H2O 3.00 mg, Na2WO4·2H2O 4.00 mg, 添加蒸馏水至1000.00 mL, 调整pH至7.0.
维生素溶液：生物素2.00 mg, 叶酸2.00 mg, 维生素B6 10.00 mg, 维生素B1 5.00 mg, 维生素B2 5.00 mg, 烟酸5.00 mg, D泛酸钙5.00 mg, 维生素B12 0.10 mg, 对氨基苯甲酸5.00 mg, 硫辛酸5.00 mg, 添加蒸馏水至1000.00 mL.
2.2 不同浓度氯仿对污泥厌氧消化同型产乙酸作用影响在参考Chidthaisong等(2000)产甲烷水稻田土壤实验中0.1%(V/V)氯仿抑制甲烷浓度的基础上, 考虑到废水污泥中微生物量高于水稻田土壤, 本实验分别设定了0.1%和0.5%(V/V)两个氯仿浓度进行实验.准确称取150 g污泥(含水率86%)加入到250 mL灭菌的混菌培养基中, 添加0.1%和0.5%的氯仿抑制剂, 混匀后厌氧条件下分装到无菌厌氧管中, 形成H2/CO2气体顶空后添加抑制剂和维生素溶液.每个实验组均设置两个平行, 设置不添加抑制剂为空白对照组.每隔7 d收集污泥样品用于DNA的提取.
2.3 不同温度下氯仿对污泥厌氧消化同型产乙酸作用的影响在26 mL的厌氧管中将3.9 g含水率为85.65%的污泥与6.1 mL去离子水混合以制备污泥浆液, 加入体积比为0.5%的氯仿并用丁基橡胶塞密封, 高纯N2吹脱污泥浆液并加压至0.5 bar(1 bar = 1.013×105 Pa)过压.在25 ℃下预培养以耗尽硝酸盐、硫酸盐, 三价铁还原直至进入产甲烷阶段.预培养结束后, 设定H2/CO2(80/20, V/V)和N2/CO2(80/20, V/V)两个实验组分别促进化能自养型产乙酸途径和异养型产乙酸途径, 置于15、30、50 ℃下培养分别进行常温、中温和高温厌氧消化.顶空气压均为1.5 bar, 每组实验均设置多个平行.间隔一段时间收集污泥样品用于提取DNA.
2.4 挥发性脂肪酸、气体及稳定碳同位素的测定采用气相色谱GC-2010法进行顶空气体的测定, 具体测定方法见参考文献(田淼等, 2017).使用Finnigan气相色谱燃烧同位素比值质谱法分析CH4和CO2的同位素组成.通过高效液相色谱分析乙酸浓度, 采用Finnigan LC IsoLink测量乙酸同位素(δ13C), 具体测定方法见参考文献(Ji et al., 2018).
2.5 污泥DNA提取和荧光定量PCR技术使用PowerSoil® DNA Isolation试剂盒提取废水污泥样品DNA, 在DNA提取之前使用涡旋仪涡旋样品以保证均匀性.使用Nanodrop ND 2000测定DNA浓度和纯度.
甲酰四氢叶酸合成酶(FTFHS)是乙酰-CoA途径中的关键酶, fhs是同型产乙酸菌的一段保守基因序列, 被称为同型产乙酸菌的功能基因(Ryan et al., 2008).本实验通过RT-qPCR技术来探测样品中fhs基因拷贝数, 从而间接反映样品中同型产乙酸菌的数量.同时, 为了解同型产乙酸菌的相对丰度, 对16S rRNA基因进行定量, 16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列, 其存在于所有细菌的基因组中.具体实验方法同文献(Xu et al., 2015).
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 不同浓度氯仿对污泥厌氧消化同型产乙酸作用的影响如图 1a所示, 对照组中的H2被迅速消耗, 反应6 d后H2被完全利用.然而, 各实验组由于不同浓度氯仿的添加, 导致同型产乙酸菌受到不同程度的抑制.0.1%和0.5%氯仿实验组的H2消耗速率明显慢于对照组, 截止到反应第20 d, 仍剩余9.94和9.46 mmol·L-1的H2未被利用(图 1a).对照组的CO2浓度呈先上升后下降趋势, 反应第6 d达到36.8 mmol·L-1的最高值, 而后被迅速消耗.然而, 氯仿实验组的CO2都未被利用, CO2平均产生速率明显变慢, 反应结束时CO2浓度分别累积至20.24和19.5 mmol·L-1(图 1b).对照组的乙酸在反应第6 d达到52.6 mmol·L-1的最高值, 而后被迅速耗尽.然而, 氯仿实验组的乙酸浓度则远低于对照组, 最高乙酸产量仅分别为24.5和22.4 mmol·L-1, 且整个反应过程中0.5%氯仿实验组的乙酸浓度远低于0.1%氯仿实验组(图 1c).
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| 图 1 不同浓度氯仿条件下污泥厌氧消化过程中顶空H2(a)、CO2(b)和产物乙酸(c)的浓度变化(平均值±SD, n = 3) Fig. 1 Changes of H2(a), CO2(b) and acetate(c) concentration during anaerobic digestion of sewage sludge with different chloroform concentrations |
应用荧光定量PCR技术测定样品中fhs基因和16S rRNA基因拷贝数, 研究同型产乙酸菌数量和相对丰度变化.废水污泥样品初始fhs基因拷贝数的对数值(以10为底, 即lg, 单位copies·g-1, 以干重计, 下同)为7.13, 实验结束时0.1%和0.5%氯仿实验组的fhs基因拷贝数的对数值分别为7.56和7.52, 对照组为7.62 (表 1).尽管氯仿实验组的fhs基因拷贝数略低于对照组, 但仍处于同一个数量级水平.氯仿抑制组的同型产乙酸菌相对丰度低于对照组, 表明0.1%和0.5%的氯仿一定程度上都会抑制同型产乙酸菌生长(表 1).结合H2利用率和乙酸浓度及同型产乙酸菌的相对丰度可以看出, 0.5%浓度的氯仿对同型产乙酸作用的抑制效果强于0.1%浓度氯仿.
| 表 1 不同浓度氯仿条件下污泥厌氧消化过程中fhs基因拷贝数及其占16S rRNA比例 Table 1 Gene copy numbers of fhs and its proportion in 16S rRNA gene during anaerobic digestion of sewage sludge under different chloroform concentrations |
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不同浓度的氯仿抑制组中较低的乙酸浓度和高于对照组的H2浓度表明同型产乙酸菌受到一定抑制.这可能是因为乙酰辅酶A途径的一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A去羰基酶复合物(CODH/ACS)被氯仿抑制所导致的(Xu et al., 2010b).
3.2 不同温度条件下氯仿对同型产乙酸作用的影响设定不同厌氧消化温度, 研究氯仿对自养/异养同型产乙酸作用的影响.15 ℃时, H2/CO2实验组的H2浓度上升至964 μmol·g-1(以干重计, 下同)后被迅速消耗, 30和50 ℃时H2在反应一开始就被消耗；反应至第8~12 d时, 所有温度条件下的H2几乎均不再消耗；至反应结束时, 15 ℃下仍有440 μmol·g-1的H2未被消耗, 30 ℃下剩余465 μmol·g-1的H2, 50 ℃下H2消耗至172 μmol·g-1(图 2a).H2/CO2和N2/CO2实验组的CO2浓度在15和30 ℃下呈现类似的变化趋势(图 2b和2c)：15 ℃时, CO2在反应一开始就被迅速耗尽, 耗尽后污泥厌氧发酵又产生了部分CO2, 反应结束时CO2浓度为56~62 μmol·g-1(以干重计, 下同)；30 ℃下CO2消耗速度明显慢于15 ℃下, 反应13 d后CO2浓度几乎没有大变化, 基本维持在102~105 μmol·g-1左右.50 ℃下CO2的变化趋势在两个氯仿实验组中存在明显差异(图 2b和2c)：N2/CO2实验组的CO2基本不被消耗；H2/CO2实验组的CO2浓度截止到反应第20 d, 从160 μmol·g-1消耗至81 μmol·g-1, 而后又产生部分CO2.
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| 图 2 不同温度下氯仿对顶空H2(a)和CO2(b、c)浓度的影响(平均值±SD, n = 3) Fig. 2 Changes of H2 (a), CO2(b, c) concentration with chloroform at different temperatures |
作为污泥厌氧发酵的两个重要产物, 甲烷和乙酸的生成情况值得关注.H2/CO2和N2/CO2实验组的CH4浓度差别不大, 基本维持在6~15 μmol·g-1(以干重计, 下同)左右, 极低的甲烷浓度表明氯仿抑制产甲烷效果显著(图 3a和3b).在氯仿抑制产甲烷的作用下, 两实验组甲烷的δ13C值(δ13CCH4)几乎没有波动, 其中, 50和30 ℃下的δ13CCH4值整体高于15 ℃下(图 3c和3d).
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| 图 3 不同温度下氯仿对顶空CH4浓度(a、b)及其δ13C值(c、d)的影响(平均值±SD, n = 3) Fig. 3 Changes of CH4 concentration (a, b) and δ13C values of CH4 (c, d) with chloroform at different temperatures |
15 ℃时, N2/CO2组乙酸浓度较低, 而H2/CO2组的乙酸浓度在反应初期呈缓慢上升趋势, 且在第17 d达到132 μmol·g-1(以干重计, 下同)的最高值(图 4a和4b).两个实验组乙酸的δ13C值(δ13Cacetate)都高于污泥有机质的δ13Cacetate值(-29.8‰), N2/CO2组的δ13Cacetate值在-23‰~-20‰的范围内波动, H2/CO2组的δ13Cacetate值呈缓慢下降的趋势, 最终降至-25.6‰(图 4c和4d).30 ℃时, H2/CO2和N2/CO2实验组在反应初期(第6 d)均有明显的乙酸积累, 最高乙酸浓度分别达到332和292 μmol·g-1, 而后乙酸被迅速消耗(图 4a和4b).H2/CO2组中, δ13Cacetate值呈持续下降趋势, 并在反应第36 d达到最低值(-26.9‰), 之后δ13Cacetate值有所上升, 最终为-21.9‰.N2/CO2组的δ13Cacetate值变化趋势与H2/CO2组一致, 其在反应第36 d达到了-28.5‰的低值(图 4c和4d).50 ℃时, 两个实验组在反应前期几乎没有乙酸积累, 至反应中后期才开始出现乙酸积累, 最高乙酸浓度分别达155和184 μmol·g-1(图 4a和4b).在H2/CO2组中, δ13Cacetate值呈持续上升的趋势(由-24.9‰上升至-18.4‰), N2/CO2组则无明显波动(图 4c和4d).
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| 图 4 不同温度下氯仿对乙酸浓度(a、b)及其δ13C值(c、d)的影响(平均值±SD, n = 3；虚线表示有机质的δ13C值(-29.8‰)) Fig. 4 Changes of acetate concentration (a, b) and δ13C values of acetate (c, d) with chloroform at different temperatures |
考虑到同型产乙酸作用的强烈稳定碳同位素分馏作用, 来源于同型产乙酸作用的乙酸δ13C值低于有机质δ13C值(Blaser et al., 2013)；然而, 两实验组δ13Cacetate值均高于污泥有机质的δ13Cacetate值, 由此可见, 氯仿能够明显抑制同型产乙酸作用, 但不同温度条件下氯仿抑制同型产乙酸作用的程度有所差异.15 ℃时, H2/CO2实验组气体基质都被迅速消耗, 而甲烷产量几乎忽略不计, 因此, H2/CO2可能主要通过化能自养型产乙酸作用消耗；N2/CO2实验组则主要通过异养同型产乙酸作用迅速耗尽CO2.但需要注意的是, 高于污泥有机质的δ13Cacetate值表明水解发酵作用仍是乙酸的主要来源.30 ℃时, 尽管乙酸浓度明显上升, 然而与15 ℃相比, 变慢的CO2消耗速度表明化能自养和异养同型产乙酸作用均都不如15 ℃时剧烈, 大量积累的乙酸可能是因为温度上升促进了污泥水解发酵.50 ℃时H2/CO2实验组的CO2消耗速率明显降低, N2/CO2组则几乎不消耗CO2, 表明该温度下同型产乙酸作用微乎其微.15 ℃条件下的δ13Cacetate值始终低于30和50 ℃下, 尤其是H2/CO2组, 表明低温条件下同型产乙酸作用比30和50 ℃条件强烈.这可能是因为低温条件下同型产乙酸菌比产甲烷菌更具优势利用H2/CO2基质(Kotsyurbenko et al., 2001; Ye et al., 2014; Vavilin et al., 2018).50 ℃下的δ13Cacetate值几乎一直高于15和30 ℃下, 表明50 ℃下氯仿抑制同型产乙酸作用最明显.这是由于高温条件下甲烷主要通过氢营养产甲烷途径产生, 同型产乙酸菌在高温条件下生长缓慢, 很难与氢营养型产甲烷菌竞争基质(Conrad et al., 2008; Ho et al., 2014), 因此导致高温条件下同型产乙酸作用相比低温条件下贡献明显减小.
3.3 不同温度条件下氯仿对同型产乙酸菌数量的影响废水污泥样品的初始fhs基因拷贝数的对数值(以10为底, 即lg, 单位copies·g-1, 以干重计, 下同)为9.44, 添加氯仿后所有实验组的fhs基因拷贝数均下降了近2个数量级, 这表明氯仿能够显著抑制同型产乙酸菌.培养终点时, H2/CO2实验组在15、30、50 ℃条件下的fhs基因拷贝数分别为7.82、7.49和6.91, 同型产乙酸菌的相对丰度分别为0.059%、0.007%、0.006%(图 5a和5c).可见, 50 ℃下H2/CO2组的同型产乙酸菌数量最低, 同型产乙酸菌相对丰度比15 ℃下低10倍.N2/CO2实验组在15、30、50 ℃条件下的fhs基因拷贝数分别为7.70、7.38和6.82, 同型产乙酸菌的相对丰度分别为0.049%、0.008%、0.006%(图 5b和5d).可见, 50 ℃下N2/CO2组的同型产乙酸菌数量同样最低, 且同型产乙酸菌相对丰度比15 ℃下低8.2倍.从以上结果可以看出, 产甲烷抑制剂氯仿抑制了污泥中同型产乙酸菌的生长, 且50 ℃时同型产乙酸菌的数量及其丰度均最低.
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| 图 5 不同温度下氯仿对fhs基因拷贝数(a、b)及其占16S rRNA基因拷贝数比例(c、d)的影响(平均值±SD, n = 3) Fig. 5 Changes of gene copy numbers of fhs gene(a, b) and its proportion in 16S rRNA gene(c, d) with chloroform at different temperatures |
本文研究了不同浓度氯仿抑制产甲烷条件下乙酸积累和同型产乙酸菌数量变化, 并基于乙酸的稳定性碳同位素分馏效应分析了不同温度下氯仿对同型产乙酸作用的影响.结果表明, 产甲烷抑制剂氯仿对同型产乙酸作用有明显抑制, 0.5%浓度氯仿的抑制作用高于0.1%浓度, 其在50 ℃条件下的抑制作用强于15和30 ℃条件下.该研究明确了常用产甲烷抑制剂氯仿对污泥厌氧消化体系中同型产乙酸作用的影响, 为污泥厌氧发酵产酸工艺改进和提高产酸效率提供了科学参考, 有助于污泥资源化利用.
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