1 引言(Introduction)

厌氧发酵产沼气是畜禽养殖废水的主要处理技术.沼气发酵过程可去除原料中大量可溶性有机物, 但化学需氧量(COD)、氨氮(NH₃-N)等浓度依然较高, 抗生素等微量有机污染物也难以脱除, 直接排入水体会带来环境污染和生态威胁(孙建平等, 2009; Park et al., 2010; Chen et al., 2015).微藻生长速率快、环境适应性强, 生长过程中可吸收利用沼液中营养物质, 从而降低氮磷等主要污染指标而达到处理沼液的目的(王愿珠等, 2017).同时, 微藻生物质具有高附加值, 可用作生物柴油的原料(Levine et al., 2011; 程军等, 2016), 也可作为动物饲料(Cheng et al., 2015).培养成本较高制约了微藻生物质能源与资源化利用技术的应用, 而营养物质的成本占微藻总培养成本的10%~20%(Singh et al., 2011), 因此利用沼液培养微藻, 降低微藻培养营养成本与水耗, 将有助于降低微藻培养成本, 同时实现废弃物资源化再利用.

Singh等(2011)利用小球藻和栅藻净化家禽粪便沼液, 总氮(TN)和总磷(TP)去除率分别达到60%和80%.然而, 其没有考察沼液中COD的净化效果. Ji等(2015)将餐厨废水按照体积比例0.5%~10%与标准培养基混合后培养绿藻Scenedesmus obliquus, 对TN和TP的脱除效率分别为75%和12%.Wang等(2010)探究小球藻净化牛粪厌氧发酵沼液, COD、NH₃-N、TN和TP的去除率分别为27.4%~38.4%、100%、75.7%~82.5%和62.5%~74.7%.显然, 沼液中COD的净化率较低, 对TN和TP的脱除效率也不高.沼液灭菌、CO₂曝气是微藻净化沼液中两个关键环节, 而目前的研究中关于灭菌方式以及CO₂体积浓度对微藻净化沼液效率的影响几乎没有涉及.另外微藻对沼液中抗生素等微污染物的脱除效果也未见报道.

本文针对养猪场废水厌氧发酵沼液, 采用小球藻光合生长脱除其中污染物, 考察了臭氧氧化及高压蒸汽两种沼液灭菌方式及优化的CO₂体积浓度对沼液脱N, P和去除COD、抗生素替米考星等污染物的影响.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 养猪场废水来源及藻种

养猪场废水原液及其厌氧发酵沼液采集自嘉兴大运河生态牧业公司.对沼液样品离心除去悬浮颗粒物后, 取上清液灭菌和调节pH后接种小球藻进行生长净化实验.

实验所用藻种Chlorella PY-ZU1是由Chlorella Pyrenoidosa经过5.5万居里的⁶⁰Co -γ射线辐射诱变得到的(Cheng et al., 2013).细胞在SE标准培养基中保藏, 包含0.25 g NaNO₃、0.075 g K₂HPO₄ · 3H₂O、0.075 g MgSO₄ · 7H₂O、0.025 g CaCl₂ · 2H₂O、0.175 g KH₂PO₄、0.025 g NaCl、40 mL土壤浸出液, 0.005 g FeCl₃ · 6H₂O, 1 mL Fe-EDTA和1 mL A5微量元素溶液, 溶解在958 mL的去离子水中.

2.2 沼液预处理、灭菌以及微藻培养方式

沼液通过高速离心机8000 r · min^-1离心10 min, 上清液用1 mol · L^-1的氢氧化钠和1 mol · L^-1的盐酸调节pH到6~6.5, 作为不灭菌组的培养基.上清液在112 ℃进行高压蒸汽灭菌30 min, 再用1 mol · L^-1的氢氧化钠和1 mol · L^-1的盐酸调节pH到6~6.5, 作为高压蒸汽灭菌组的培养基.将臭氧发生器产生的浓度为50 mg · L^-1的臭氧气体连续通入1 L沼液中10 min, 再用1 mol · L^-1的氢氧化钠和1 mol · L^-1的盐酸调节pH到6~6.5, 作为臭氧氧化灭菌组的培养基.在1 L臭氧氧化灭菌后的沼液中添加43.9 mg KH₂PO₄(10 mg · L^-1 P元素)和4.8 mg FeCl₃ · 6H₂O(1 mg · L^-1 Fe元素)作为添加P元素和Fe元素实验组的培养基.

Chlorella PY-ZU1在人工温室中培养, 温度为27 ℃, 光照强度为8000 Lux, 24 h连续光照.反应器为柱状生物反应器(160 mm × ϕ56 mm工作容积为300 mL), 富CO₂气体从一根长钢管(180 mm×ϕ3 mm)通入反应器底部.取新鲜的藻种接种到不同处理的沼液中, 接种密度为0.1 g · L^-1, 通入体积浓度为2%~30%的CO₂气体, 通气量由质量流量计控制为30 mL · min^-1.

2.3 分析测试方法

COD、NH₃-N、TN、TP等水质成分测试：取10 mL藻液在9000 r · min^-1转速下离心5 min, 取上清液由HACH DR890水质分析仪测量.沼液的阳离子由热电公司X series电感耦合等离子体质谱ICP-MS测量, 阴离子含量用瑞士Metrohm 883 Basic IC Plus离子色谱仪测量.粗纤维采用FOSS FT350(丹麦)纤维测定仪测量, 有机酸采用HP 6890/5973GC-MS联用仪测量.培养期间, 通过离心法测定小球藻的生物量, 取10 mL藻液在9000 r · min^-1转速下离心5 min, 去除上清液, 然后用去离子水清洗重复两次, 再在80 ℃下烘干24 h, 用电子天平称重, 以g · L^-1计算生物质干重.藻液pH检测：取2 mL藻液于试管中, 将便携式pH计(Mettler Toledo FG-2, 瑞士)探头浸没在藻液中, 稳定后读取pH值.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 养猪场废水原液及其厌氧发酵后沼液的成分分析

养猪场废水原液(以下称原液)在经厌氧发酵处理前COD为1580 mg · L^-1, TN为1095 mg · L^-1, 有机物主要成分是粗纤维和有机酸(表 1), 另外还含有微量抗生素替米考星.微量的抗生素存在于水体中也会对环境带来较大潜在威胁, 如毒害水生生物、诱导抗生素抗性基因和细菌.经过厌氧发酵, 沼液中COD降至794 mg · L^-1, 总氮降至854.7 mg · L^-1, 依然远远高于排放标准.氨氮含量升高, 原因是水解酸化和厌氧发酵过程中大分子有机物如蛋白质等降解释放出氨氮的速度快于细菌消耗氨氮的速度.沼液中主要的无机元素呈降低趋势(表 2).沼液中除了微量元素铁(0.29 mg · L^-1)、锰(0.20 mg · L^-1)、钼(0.0070 mg · L^-1), 其他元素均远高于小球藻标准培养基, 富含有机质、氮、磷等营养成分及氨基酸等生命活性物质, 因此沼液中含有足够的营养物质可以用来支持微藻生长.此外, 沼液中重金属含量极低, 除含有极少量砷以外, 其他均低于检测限, 因此重金属在微藻中的富集作用可以忽略.

3.2 灭菌方法对微藻生长和污染物脱除的影响

沼液中含有细菌等各种微生物, 可能会与微藻争夺营养而抑制微藻生长.分别考察了对沼液不灭菌、高压蒸汽灭菌和臭氧氧化灭菌对微藻生长脱除沼液中污染物的影响.首先, 测试了在对藻液进行灭菌之后, 接种微藻之前, 沼液中污染物的含量.在高压蒸汽灭菌以后, 沼液中COD、NH₃-N、TN、TP和替米考星的浓度分别为：780.62、703.92、835.23、12.21和0.0064 mg · L^-1.高压蒸汽灭菌对污染物浓度影响较小, NH₃-N和TN浓度的下降是由于高温促进了NH₃的挥发.采用臭氧氧化灭菌之后, 沼液中COD、NH₃-N、TN、TP和替米考星的浓度分别为：725.87、691.36、820.39、12.22和0.0059 mg · L^-1.由于臭氧具有强氧化性, 能够攻击C═C键和苯环, 将较大分子的有机物降解成较小分子有机物, 因此COD下降了8.5%, 同时由于向沼液中曝入气体, 加快了NH₃的挥发, 因此NH₃-N和TN也有所下降, 但臭氧灭菌对各种污染物脱除比例较小.图 1a表明, 不灭菌条件下, 小球藻生长速度较慢, 经过11 d培养生物质产量为3.01 g · L^-1, 但未因细菌污染而死亡.COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别为41.6%、65.3%、67.1%和62.7%, 抗生素替米考星的脱除效率为65.9%(图 1b), 污染物脱除效率较低.而经过高压蒸汽灭菌后, 微藻生物质产量提高到3.89 g · L^-1, 提高了29%.121 ℃高压蒸汽使沼液中微生物细胞的蛋白质由于高温而凝固, 从而达到灭菌的效果.冷却后再接种小球藻培养时, 由于没有其它微生物争夺营养, 小球藻快速生长同化沼液中的C、N、P等营养元素, COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别提高到46.3%、72.2%、71.2%和98.0%, 抗生素替米考星的脱除效率提高到72.8%.显然, COD的脱除效率依然较低.这是因为沼液中的COD主要组成是纤维素、有机酸等难降解较大分子量的有机物, 微藻对此的同化降解能力较低、速度较慢.采用臭氧氧化灭菌条件下, 微藻生物质产量提高到4.50 g · L^-1, 比未灭菌条件下提高了49.5%.臭氧依靠其强氧化性, 损伤沼液中微生物的细胞膜成份, 导致其新陈代谢障碍, 并继续穿透膜破坏膜内脂蛋白和脂多糖, 改变细胞的通透性, 从而导致细胞溶解、死亡(胡桂英等, 2009).臭氧氧化灭菌后的沼液中小球藻快速生长, COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别提高到73.9%、85.1%、80.1%和98.4%, 抗生素替米考星的脱除效率提高到83.5%.相对未灭菌条件, COD的脱除效率显著提高了77.6%.这是因为臭氧对沼液的作用除了灭菌以外, 还会攻击沼液中大分子有机物的苯环及其他不饱和基团, 使纤维素、有机酸等降解为小分子有机物, 从而有利于微藻吸收利用(Vaiopoulou et al., 2015).此处臭氧的使用量较小, 仅能将大分子转化为小分子, 因此臭氧对COD的脱除率不高, 小球藻对小分子有机物的同化吸收是COD脱除的主要组成部分.因此, 结合本研究中沼液特点, 臭氧氧化灭菌是最优的灭菌方法.

3.3 CO₂浓度对微藻生长脱除污染物的影响

微藻光合自养需要CO₂, 考察了不同CO₂体积浓度对微藻生长和营养同化效率的影响.当CO₂浓度为2%时, 小球藻生物质产量为2.48 g · L^-1(图 2a).COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别为42.5%、65.9%、68.1%和71.9%, 抗生素替米考星脱除效率为70.7%(图 2b).随着CO₂浓度从2%增加到15%, 微藻生物质产量从2.48 g · L^-1增加到4.50 g · L^-1, 提高了81.5%.相应的COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别提高到73.9%、85.0%、80.1%和98.4%, 抗生素替米考星的脱除效率提高到83.5%.光合作用分为光反应和暗反应两个阶段.光反应吸收光能产生ATP和NADPH, 为暗反应提供能量和原料.暗反应又称碳固定反应, 利用光反应产生的ATP和NADPH, 将CO₂固定为细胞中的有机物.随着通入的CO₂浓度增大, 沼液中光合作用暗反应的原料增多, 有利于加快暗反应的进行, 促进CO₂固定为生物质, 从而导致微藻生长加快.除此之外, 藻液中连续通入CO₂会导致藻液中H⁺浓度升高, 而微藻光合作用会消耗H⁺, 导致H⁺浓度升高.在低CO₂浓度下, 藻细胞生长消耗H⁺速率比CO₂溶解生成H⁺速率快, 因此pH上升, 而小球藻最适pH在6.0~6.5, 较低的pH值不利于藻细胞光合生长.随着通入的CO₂浓度从2%增加到15%, CO₂溶解增多, H⁺生成速率接近消耗速率, 藻液的平均pH值从7.5下降到6.3(沼液初始pH范围为6~6.5).随着CO₂浓度从15%继续提高到30%, 微藻生物质产量从4.50 g · L^-1降低到2.46 g · L^-1.相应的COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别降低至41.9%、69.7%、53.5%和61.1%, 抗生素替米考星的脱除效率降至72.7%.文献表明, 过高浓度的CO₂对微藻生长具有明显抑制作用(杨熙等, 2017).随着CO₂浓度从15%提高到30%, 由于H⁺生成速率过快, 远大于消耗速率, 因此培养液pH从6.3下降到5.7, 培养液的酸化使得藻细胞生长速率降低.通入体积浓度30%的CO₂对微藻生长产生了较强抑制.实验结果表明, 微藻培养时通入体积浓度为15%的CO₂, 能够促进微藻生长速率, 显著提高沼液净化效率.

3.4 沼液中添加P和Fe元素对微藻生长和污染物脱除的影响

由表 2可知, 沼液中磷元素(12.30 mg · L^-1)和铁元素(0.29 mg · L^-1)浓度远低于小球藻标准培养基.研究表明, 对淡水浮游植物, 当环境中的N : P摩尔比大于20 : 1时, 对植物造成磷限制(李夜光等, 2006).本实验中使用的养猪场废水厌氧发酵沼液N : P为69 : 1, 很显然会对小球藻形成磷限制.铁是藻类生长过程中电子传递、光合作用、呼吸作用等多个生物过程的必要元素, 是除N、P元素外藻类生长中最重要的元素, 缺铁可导致叶绿素含量降低, 从而抑制光合生长(于洪贤等, 2016).因此, 为进一步提高微藻生长速率和污染物脱除效率, 研究了在沼液中添加10 mg · L^-1 P元素和1 mg · L^-1 Fe元素对微藻生长的影响.在不添加任何元素的条件下, 小球藻最大生物质产量为4.50 g · L^-1(图 3a).COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别为73.9%、85.0%、80.1%和98.4%, 抗生素替米考星的脱除效率为83.5% (图 3b).在沼液中添加10 mg · L^-1 P元素后再接种培养小球藻, 此时小球藻最大生物质产量增加到5.36 g · L^-1, 提高了19.1%.显然, 添加P元素弥补了沼液中磷源不足的缺陷, 有利于促进微藻生长.相应的COD、NH₃-N和TN的脱除效率分别提高到79.1%、87.8%和85.6%, TP的脱除效率为98.3%, 几乎不变, 这是因为P元素相对缺乏, 在培养过程中几乎可以全部利用.抗生素替米考星的脱除效率也提高到88.0%.

在沼液中添加1 mg · L^-1 Fe元素后再接种培养小球藻, 相对于不添加任何元素的情况, 小球藻最大生物质产量增加到5.54 g · L^-1, 提高了23.1%.添加Fe元素有利于微藻光合色素的合成, 促进新陈代谢, 从而加快生长速率, 提高营养盐同化速率.相应的COD、NH₃-N和TN的脱除效率分别提高到81.8%、90.3%和88.4%, TP的脱除效率为98.4%几乎不变, 抗生素替米考星的脱除效率提高到90.7%.添加P元素和Fe元素均有利于提高微藻生物质产量和污染物脱除效率, 同时添加两种元素时, 促进效果更加明显.实验结果表明, 在沼液中同时添加10 mg · L^-1 P元素和1 mg · L^-1 Fe元素后再接种培养小球藻时, 小球藻最大生物质产量为5.81 g · L^-1, 相对未添加任何元素条件下提高了29.1%.两种主要元素的补充使得沼液中的营养成分得以满足微藻生长需要.相应的COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别提高到88.5%、93.6%、91.2%和98.9%, 抗生素替米考星的脱除效率提高到90.7%.各种污染物的脱除效率均达到较高水平, 污染物浓度也达到国标排放标准.

4 结论(Conclusions)

1) 本文通过选择灭菌方式、优化CO₂浓度和沼液无机成分大幅提高微藻生物质产量和沼液净化效率.对沼液臭氧氧化灭菌使生物质产量提高49.5%, 通入15% CO₂使生物质产量提高81.5%, 添加10 mg · L^-1 P元素和1 mg · L^-1 Fe元素使生物质产量进一步提高29.1%.

2) 在最佳条件下:对沼液臭氧氧化灭菌, 添加10 mg · L^-1 P元素和1 mg · L^-1 Fe元素, 培养过程中连续通入体积浓度为15%的CO₂, 小球藻生物质产量达5.81 g · L^-1, 相应的COD、NH₃-N、TN和TP的脱除效率分别为88.5%、93.6%、91.2%和98.9%, 抗生素替米考星的脱除效率提高到90.7%.

3) 微藻生物质富含油脂, 可提取并进一步加工成生物柴油.脱脂后的微藻生物质富含蛋白质、氨基酸等营养元素, 可用作畜禽养殖饲料.微藻净化沼液的方法和技术在净化沼液的同时, 利用太阳能将沼液中的污染物变废为宝, 实现了废弃物资源化利用.