2019, Vol. 39
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2. 中国科学院遗传所农业资源研究中心, 石家庄 050021
2. Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, CAS, Shijiazhuang 050021
河流沉积物细菌群落是大部分河流生态系统中代谢活动的主要承担者(Gibbons et al., 2014), 在物质循环以及能量输送过程中发挥关键作用(Ibekwe et al., 2016), 同时体现了不同的生态功能, 是衡量水生态系统稳定性的重要指标之一(Rose et al., 2001).研究沉积物中细菌群落组成及结构有助于了解细菌对环境改变做出的贡献及应对干扰时的反馈作用(Quan et al., 2010).
近来的研究表明, 河流沉积物中的细菌群落组成与结构沿化学梯度而变化.鄱阳湖沉积物细菌群落的OTU数量与重金属元素, 如Cu、Pb等, 呈现不同程度上的相关性(江玉梅等, 2016).矿山排水导致河流沉积物中细菌群落组成明显变化, 群落的多样性与Cd、Mn、Zn和Ni的浓度相关(Bier et al., 2014).营养物质比例与河流沉积物细菌群落差异的相关性高于其他理化指标, 如水温、pH、溶解氧、总有机碳和叶绿素a等.再生水中的病原菌和抗生素在一定程度上改变了河道沉积物细菌群落的碳氮循环的转化方式(邸琰茗等, 2017).内分泌干扰物质(EDCs)对沉积物中的细菌种群数量影响不明显, 但显著地改变了群落的结构.多环芳烃和硝基苯与河流沉积物细菌群落的多样性负相关, 变形菌成为优势菌属.河流沉积物干物质中全氟烷基酸(PFAAs)含量高于100 ng·g-1时对沉积物细菌群落产生影响, 含量较高时明显降低细菌群落的多样性, 蛋白菌、硫杆菌等增多.
在四季分明的中纬度地区, 季节变化和调水行为使河流产生明显的物理、化学梯度.季节变化引起温度的明显变化导致水体氧化还原电位(ORP)及含氧量(DO)发生显著变化(高大文等, 2003a)；降水量的季节变化引起河流主要营养盐(氮和磷)明显变化(卓泉龙等, 2018)；跨流域调水可使受水区水环境整体退化(袁瑞强等, 2018).已有的研究表明, 水体沉积物细菌群落结构随着季节更替和空间距离变化, 存在时空异质性(高大文等, 2003b;张瑞丽, 2011a;王佳等, 2016a;朱婷婷, 田从魁, 2018a;朱婷婷等, 2018b).同时, 调水行为可明显影响受水河段沉积物细菌群落(张瑞丽, 2011b;袁瑞强等, 2018).然而, 同时处于季节变化和调水行为产生的物理、化学梯度下的水体沉积物细菌群落变化及其主导因素尚不明确.
多种方法被应用于细菌群落组成与结构的分析.如PCR-DGGE方法用于分析原油储层细菌群落(佘跃惠等, 2005)和松花江沉积物细菌群落(Wang et al., 2016)；高通量测序技术用于研究祁连山典型植被类型土壤细菌群落(朱平等, 2017)和地下水生态系统中的细菌等.新一代高通量测序技术可直接测序16S rRNA基因的PCR产物, 每次测序可获得数以百万甚至亿万条基因序列, 其通量高、反应灵敏、序列数多(夏围围, 贾仲君, 2014).相比传统的测序方法, 高通量测序技术能够更加准确全面地反映细菌群落结构特征(Liu et al., 2014).本研究基于高通量测序结果, 在不同分类水平上讨论引黄入晋工程汾河受水河段沉积物中的细菌群落在季节变化和调水行为共同作用下, 其组成、结构和多样性的变化, 阐明主要影响因素.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 研究区域汾河是山西第一大河流, 黄河第二大支流, 发源于忻州市宁武县东寨镇, 于运城市河津汇入黄河, 河流全长713 km.2003年11月开始, 引黄入晋工程向汾河上游输水3.2亿m3·a-1.研究区为汾河源头至汾河水库的汾河河流山谷区, 包括非受水河段和受水河段(头马营至汾河水库), 隶属于忻州市宁武县和静乐县, 位于38°15′~38°47′N, 111°51′~112°06′E.该区域气候四季分明, 属于温带季风性气候.年平均气温为7 ℃, 年降雨量380~500 mm, 约70%的降水集中在夏季6—9月.
2.2 样品采集与测定研究区内沿汾河布设了6个汾河干流采样点(图 1).FR01采样点距汾河源头1 km左右.FR02采样点位于引黄口上游100 m.FR03采样点位于引黄口下游4.5 km, 期间无支流汇入, 黄河水与汾河水充分混合均匀.FR04采样点位于FR03下游约50 km, 接受多条支流汇入.然而支流流量极小且多为季节性河流, 因此忽略其对干流的影响.FR05采样点位于静乐县城下游约500 m.FR06采样点位于FR05下游约15 km.
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| 图 1 研究区地图和采样点分布 Fig. 1 Map of Fen River up-reach area and sampling sites |
分别于2017年冬季(1月)和夏季(6月)在干流的6个采样点采集了水样和沉积物样品.水样用60 mL聚乙烯采样瓶采集, 在实验室储存于4 ℃冰箱内.沉积物样品在每个采样点选择3个不同位置分别采集, 深度为沉积物表层下1~2 cm.测序样品装入10 mL离心管并立刻用干冰冷冻, 在实验室用超冷冰箱保存直到测定.另用无菌自封袋采集约1 kg沉积物样品.
使用便携式水质测定仪(HORIBA U-51)现场测定河流支流和干流采样点处水温、电导率(EC)、ORP以及总溶解固体(TDS)等理化参数.在中国科学院地理科学与资源研究所利用激光粒度仪(Mastersizer 2000型)测定河流沉积物样品的粒度(PS).在中国科学院农业资源研究中心测定沉积物的主要化学指标(表 1).其中, 全氮(TN)用凯氏法测定, 碱解氮(AHN)用碱解扩散法, 全磷(TP)和全钾(TK)使用氢氧化钠熔融法, 速效磷(AP)使用碳酸氢钠浸提法(Olsen法), 速效钾(AK)使用醋酸铵浸提法, 有机质(O)使用H2SO4-K2Cr2O7外加热氧化法.使用的仪器包括原子吸收光谱仪(德国耶拿Zeenit 700P), 可见分光光度计和凯氏定氮仪等.
| 表 1 主要环境因子 Table 1 Major environmental factors |
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采用通用引物(338F/806R)对沉积物细菌16S rRNA基因的V3~V4区扩增(张军毅等, 2015).PCR扩增的反应条件为：①模板DNA的变性：95 ℃, 3 min；②模板DNA与引物的退火(复性)：27×(95 ℃, 30 s；55 ℃, 30 s；72 ℃, 45 s)；③引物的延伸：72 ℃, 10 min.每个样品3个重复, 将不同样品的PCR扩增产物均一化至10 nmol·L-1后等体积混合, 利用上海美吉生物医药科技有限公司的MiSeq PE300测序仪(Illumina)完成序列测定.高通量数据的生物信息学分析采用Qiime平台(默认置信度阈值为0.7).根据序列的相似度, 将序列归为多个OTU, 得到每个OTU的分类学信息(Caporaso et al., 2010).FR01~FR06采样点的测序结果顺序标记为：冬季W1~W6, 夏季S1~S6.
2.3 数据分析实验室测定水体与沉积物理化参数分别在普通河段(FR01、FR02)和引黄河段(FR03~FR06)计算平均数和标准差, 并用公式(引黄河段平均值-普通河段平均值)/普通河段平均值计算引黄引起的空间变异, 用公式(夏季平均值-冬季平均值)/冬季平均值计算季节变化差异.利用SPSS(IBM SPSS Statistics 20)对冬夏水体与沉积物理化参数进行T检验, 计算季节变化的显著性p值.
将每个样本按最小样本序列数抽平后, 利用Mothur软件计算不同随机抽样下的多样性指数, 从中选取相似度在97%条件下的OTU生成预期的稀释曲线, 并基于属水平计算覆盖度指数(Coverage)以及香农指数(Shannon), 进行Alpha多样性分析(Schloss et al., 2009).将所得序列信息与Silva(Release128 http://www.arb-silva.de)数据库进行比对, 得出科水平的细菌群落物种组成Bar图, 反映相对丰度大于1%的菌种组成.相对丰度小于1%的菌类归入其它(others).
根据Beta多样性距离矩阵进行层级聚类分析, 使用UPGMA算法构建树状结构, 并使用Bray-curtis距离算法确定样本距离及使用Average聚类方式进行聚类, 从而得到层级聚类图呈现不同环境样本中细菌群落演化的差异程度.采用CANOCO(V4.5)完成冗余分析(RDA), 反映种群或群落与环境因子的关系(Morgan et al., 2015).
3 结果(Results) 3.1 水体和沉积物理化特征汾河上游不接纳黄河水的普通河段与黄河水的受水河段在夏季和冬季水体和河流沉积物的主要理化指标如表 1所示.其中, 水温和ORP存在显著的(p < 0.001)季节变化.除此之外, AHN和PS的季节变化幅度也同样较大.
与普通河段相比, 引黄河段水体EC和TDS明显增加, 而ORP下降；沉积物中O、TP和AK含量有不同程度地增加, 而TK和PS下降.在冬季, 引黄河段沉积物中营养盐指标(除TK外)明显上升；在夏季, 引黄河段沉积物的营养指标(除TP和AK外)明显下降.
3.2 细菌稀释曲线稀释曲线用来得到样品的取样深度.稀释曲线随样品序列长度的增加逐渐趋于平缓, 测序结果可代表样品的整体情况(图 2).本文分析所采用的序列数为30000条, 此时6个样品的覆盖度指数均在97.9%之上, 表明该样品序列信息能充分代表样本总体.Shannon指数值越大, 表明物种多样性越高(Wang et al., 2008).研究河段样本在序列数大于10000条时走势平缓, 可合理地表征汾河沉积物细菌的多样性.
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| 图 2 覆盖度指数稀释曲线和香农指数稀释曲线图 Fig. 2 Coverage curves and Shannon curves |
河流沉积物的生物多样性是衡量细菌群落稳定性的重要指标.Shannon指数可反映细菌群落结构的复杂性, 其指数值越高, 群落结构越复杂, 其结构的完整性越高(Wang et al., 2008;高慧琴等, 2011).研究河段冬季Shannon指数介于4.11~5.10, 夏季介于4.58~5.35, 且在每个采样点夏季的指数值均大于冬季(图 3).这表明夏季河流沉积物细菌群落结构更为复杂和稳定(阮宇鹰, 2008).这与研究区夏季温度处于大多数细菌的动力区温度(施邑屏, 1982), 而冬季温度偏低有关.
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| 图 3 Shannon指数折线图 Fig. 3 Curve graph of the Shannon index |
夏、冬两季Shannon指数沿研究河段的变化趋势大致相同.即在FR01~FR03间增长, FR04小幅度下降, FR05上升, 而在FR06处达到Shannon指数的最小值.研究河段沉积物细菌群落多样性在夏、冬两季的表现变化为“低-高-低”.研究区自上游到下游从人口较少的农业区到人口密集的城镇再过渡为人口较少的农业区(屠腾等, 2012;王佳, 2015;王佳等, 2016b).
3.4 细菌群落物种组成在科水平上, 夏季沉积物样品细菌的种类大于冬季.除471个同样的科水平菌群, 夏季样品中有其独有的34个科水平菌群, 而冬季仅有28个(图 4).然而, 冬季时含量≥1%的科水平菌群在群落中占有更多份额.在夏季沉积物样品中共检测到33个含量≥1%的科水平菌群, 约6.5%；而在冬季为41个, 约8.2%.
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| 图 4 汾河沉积物细菌物种组成 (相对丰度小于1%的菌类归入others.图例由下到上表示的细菌在样本中的相对丰度逐渐减小.FR01~FR06采样点的测序结果顺序标记为：W1~W6(冬季), S1~S6(夏季)). Fig. 4 Composition of bacterial species in the sediment of the Fen River (Bacteria with relative abundance less than 1% were classified as others.The sequence of sequencing results of FR01~FR06 sampling points were marked as: W1~W6(winter), S1~S6(summer)) |
细菌核心菌群组成和结构随季节变化.夏季汾河沉积物样品中, 丛毛单胞菌(Comamonadaceae)是最丰富的科, 占每个样本细菌总数的3.71%~14.40%, 其次为黄杆菌(Flavobacterium, 1.02%~12.89%)、红环菌(Rhodocyclaceae, 2.31%~7.03%)、黄单胞菌(Xanthomonadaceae, 2.02%~4.91%)、红细菌(Rhodobacteraceae, 1.01%~4.21%)和Desulfobulbaceae(1.12%~4.02%).以上细菌构成了夏季汾河沉积物细菌群落的核心菌群.冬季汾河沉积物样品中, 丛毛单胞菌是最丰富的科, 占每个样本细菌总数的8.31%~26.93%, 其次为黄杆菌(4.50%~21.33%)、蓝藻(Cyanobacteria, 1.44%~7.66%)、黄单胞菌(5.63%~6.55%)、疣微菌(Verrucomicrobiaceae, 2.14~5.23)、红环菌(1.58%~7.34%).以上细菌构成了冬季汾河沉积物细菌群落的核心菌群.与冬季相比, 夏季汾河沉积物中蓝藻和疣微菌的相对数量明显减少, 取而代之的是红细菌和Desulfobulbaceae.在冬季, 各样本核心菌群的相对丰度分别为：51.12%、42.50%、33.75%、34.46%、37.79%和57.91%；在夏季, 各样本核心菌群的相对丰度分别为：31.45%、38.36%、26.94%、9.13%、22.76%和39.67%.
4 讨论(Discussion) 4.1 引水行为和季节变化对细菌群落的影响构建样本层级聚类树, 假定所有核苷酸或氨基酸均有相同的变异速率, 则分支距离越近的两支样品中含有的细菌菌落相似性越强.冬季与夏季河流沉积物细菌群落聚类结果相同(图 5a和图 5b).位于引黄口上游的FR01和FR02采样点(非受水河道)样品聚为一簇, 代表了汾河原生水环境沉积物中细菌群落的组成和结构.引黄口下游的FR03~FR06采样点(受水河道)为一大簇, 代表受黄河水影响的细菌群落特征.随着黄河水的汇入, 受水河段(FR03~FR05)核心菌群的相对丰度相比非受水河段(FR01、FR02)明显下降, 因此形成具有明显空间分布模式的聚类结果, 表明引黄行为在不同季节均对汾河沉积物细菌群落产生主要的影响.
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| 图 5 汾河沉积物细菌层级聚类结果 (FR01~FR06采样点的测序结果顺序标记为：W1~W6(冬季), S1~S6(夏季)) Fig. 5 Results of microorganism stratification of the Fen River (Sequencing results of sampling points FR01~FR06 were sequentially labeled as W1~W6(winter) and S1~S6(summer)) |
引黄的影响存在明显的季节变化.聚类结果表明, 受引黄影响的河段与不受引黄影响的普通河段沉积物中细菌群落组成和结构的季节差异在夏季更加显著(可达0.3, 图 5a), 而在冬季减弱(仅0.25, 图 5b), 引黄对沉积物细菌群落组成和结构的影响在夏季较冬季高约20%.对比冬夏两季细菌群落结构与组成(图 4), 在夏季, 距离引黄汇入口较远(FR01、FR06)核心菌群的相对丰度基于引黄入汾口(FR03)核心菌群相对丰度的相对变化量小于50%, 而在冬季, 该数字大于70%.相关研究表明, 水温的季节变化(21.6~-0.2 ℃)对河流沉积物细菌群落组成及结构基本没有影响(赵昕燕等, 2017).因此可以推断这一变化由引黄状况的季节变化引起, 即夏季引黄或支流汇入的影响范围更大.
夏、冬两季的12个样本可聚为三大簇(图 5c), 大致遵循地域分区规律.W1、W2与S1、S2成为簇Ⅰ, W3~W6以及S3、S5、S6成为簇Ⅱ, S4单独为簇Ⅲ.在大簇之内, 各样本又根据季节不同而分成了更小的相似性族群.簇Ⅰ中, W1与W2为一小簇, S1与S2为一小簇；簇Ⅱ中, W3~W5成为一小簇, S3与S5成为一小簇.聚类结果表明, 引黄行为对汾河沉积物细菌群落的影响大于季节变化的影响.
不同季节河流沉积物细菌群落的聚类分析结果可揭示细菌群落明显的时空分布特征.样本的聚类结果常常先按照季节不同分为几大簇, 在大簇内空间距离较近的样本点往往聚为一类.如应用DGGE技术分析浑河和流清河湾扇贝养殖海区细菌群落结构季节变化的研究中, 各采样点首先根据河流不同水期聚为一类, 空间距离较近的采样点又聚成小簇, 表明在人为干扰较少的情况下, 季节变化是引起河流细菌群落变化的首要因素, 而人类活动和空间距离的影响次之(杨彩霞等, 2012;王佳等, 2016b).在本研究区的聚类结果中, 各个采样点沉积物中细菌群落首先按是否受调水行为影响分开, 其次按照空间距离分开, 后又按照季节不同分为小簇.这表明调水是影响河流沉积物细菌群落变化的首要因素, 其次为空间距离因素, 再次为季节变化因素, 展现出与前人研究不同的规律.我们的研究表明, 在四季分明的温带地区, 人类活动对细菌群落的影响可以超过自然界四季变化的影响.
4.2 主要影响因子汾河流域为典型的温带季风性气候, 冬夏两季气温和降水量变化较为明显.随温度升高ORP显著降低(徐华成等, 2007).因此, 水温及ORP在0.001水平上具有显著的季节变化(表 1).研究区EC、TDS、AHN、AP、TN和PS在不同季节受引黄调水的影响程度不同.黄河水的引入大大提高了汾河受水河段的EC, 在夏季这种变化更为显著.AHN、AP、AK、TN和O在冬季因黄河水的引入而大幅度增加.O、TP、PS、EC及ORP的方差较大, 表明存在较大的空间变异.TN、水温和TDS的方差较小, 表明较高的空间均一性.
水体环境因子(水温和ORP)的季节变化造成研究河段沉积物细菌群落产生明显的时间变化；沉积物环境因子(TK、AHN和TN)受调水影响而形成的空间变化造成研究区河段沉积物细菌群落产生明显的空间分异.RDA结果表明, 水温对细菌门分类种群变化的影响最大, 其次为河水的ORP, 沉积物的TK、AHN和TN(图 6).冬季样本位于原点(0, 0)右侧, 与主要因子ORP和TK呈正相关而与水温、AHN和TN呈负相关.相反地, 大部分夏季样本位于原点左侧, 与水温、AHN和TN呈正相关而与ORP和TK呈负相关.
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| 图 6 RDA分析结果 (箭头长短代表相应环境因子在主轴中的贡献大小.原点到样本点的连线与环境因子向量的夹角为锐角, 说明该样本点与环境因子成正相关；否则反之. FR01~FR06采样点的测序结果顺序标记为：W1~W6(W, 冬季), S1~S6(S, 夏季)) Fig. 6 RDA ordering of sampling points and environmental factors (The line from the origin to the sample point is at an acute Angle with the environmental factor vector, indicating that the sample point is positively correlated with the environmental factors, Otherwise, indicating negative correlation.The sequencing results of FR01~FR06 sampling points were sequentially labeled as W1~W6(W, winter) and S1~S6(S, summer)) |
丛毛单胞菌、黄杆菌、红环菌和黄单胞菌是汾河沉积物核心菌群中稳定的菌类(图 4).丛毛单胞菌科中的细菌类群主要来源于土壤、废水、活性污泥以及海水沉积物等(Heylen et al., 2008; Yu et al., 2011; Zhang et al., 2012).其中的许多类群通过不同的代谢途径来进行反硝化(Ginige et al., 2004; Sadaie et al., 2007)、硝化(Purkhold et al., 2000; Juretschko et al., 2002)和脱磷(Blackall et al., 2002; Lee et al., 2003)等活动.黄杆菌、黄单胞菌和红环菌在去除污水中难降解有机物中发挥重要作用(肖慧慧等, 2013).相关研究表明, 在一定环境压力下, 某些具有多重能力的细菌表现出较大的生理耐受性和较强的物质利用能力而大量繁殖, 从而降低细菌群落的多样性(Mills et al., 1987; Atlas et al., 1991; Sjostedt et al., 2012).上述稳定菌群对营养盐较好的利用能力和较强的环境适应性使其在研究河段沉积物中的优势地位不受季节变化而改变, 同时也使汾河沉积物细菌群落整体对产生TK、AHN和TN较强的相关性.
众多研究表明, 环境因素对细菌结构有重要的影响, 处于动态平衡过程中(唐婧等, 2015).其中水温对细菌群落的分布具有重要意义(薛俊增等, 2016;沈烽等, 2017).在中等温度条件下, 营养盐对细菌物种多样性和结构的影响最强.河流湿地香蒲根际和渤海三湾细菌群落与温度和TN具有密切关系(黄兴如等, 2016;李建洋等, 2017;王彩霞等, 2018)；深圳近海浮游细菌丰度时间差异主要受温度影响, 空间差异主要受营养盐影响(李建洋等, 2017)；营养物质(O、TN)是影响细菌群落结构的主要因子(金笑等, 2017).这些对不同水体环境下细菌群落与环境因子之间的相关性研究结果与本文相同, 说明这一规律对大部分水体微生物适用.但这类论文常常只探讨随季节与空间变化细菌与相关环境因子的规律, 而较少考虑到人为因素与自然因素同时作用下细菌群落的主要环境因子.本文的研究结果证明, 在调水因素的干预下, 影响沉积物细菌群落的主要环境因子与自然条件下影响水体细菌群落的主要环境因子相同.
5 结论(Conclusions)引黄入晋汾河上游受水区属于温带季风区, 气候存在明显的季节变化.在气候季节变化和调水行为的共同影响下, 受水河段沉积物中细菌群落展示出显著的变化.
1) 在科水平上, 夏季汾河沉积物样品细菌的种类大于冬季.然而, 冬季时含量≥1%的科水平菌群在群落中占有更多份额.夏季温度处于大多数细菌的动力区温度, 而冬季温度偏低, 造成夏季河流沉积物细菌群落多样性更高, 结构更为复杂和稳定.同时, 水质较差的引黄水汇入河流导致沉积物细菌群落多样性显著上升, 结构复杂.
2) 细菌核心菌群组成和结构随季节变化.夏季汾河沉积物中蓝藻和疣微菌的相对数量明显减少, 取而代之的是红细菌和Desulfobulbaceae.丛毛单胞菌、黄杆菌、黄单胞菌和红环菌等对营养盐有较好的利用能力和较强的环境适应性, 在研究河段沉积物中的优势地位不受季节变化影响而改变.
3) 河水水温和ORP的季节变化使汾河沉积物细菌群落产生明显的季节变化.同时, 河流沉积物TK、AHN和TN的变化造成沉积物细菌群落产生明显的空间分异.
4) 引黄调水在不同季节均对汾河沉积物细菌群落的组成和结构产生重要影响, 而且在夏季的影响较冬季高20%左右.引黄调水对汾河沉积物细菌群落的影响大于季节变化的影响.
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