1 引言(Introduction)

土壤重金属污染问题随着工农业的发展已经越来越严峻.重金属的毒性较强, 如镉(Cd)、锌(Zn)、铅(Pb)等, 它会使植物体内产生大量的活性氧(ROS)从而引起氧化胁迫, 影响植物的正常生长(张然然等, 2016；Cristaldi et al., 2017).东南景天(Sedum alfredii)是一种原生态Zn/Cd超积累植物, 它生长较快且易繁殖, 在较短的生长期内可形成良好的地面覆盖, 适用于Zn/Cd污染的修复, 在水体和土壤重金属修复上已得到广泛应用(Xiong et al., 2011；Wei et al., 2015).目前, 植物修复更多的是运用一些辅助措施以提高植物的生物量及对重金属吸收、转运和富集能力来提高植物的修复效率.施加有机物料(Yao et al., 2015；邵云等, 2017)和天然低分子有机酸, 如柠檬酸、草酸、酒石酸等(陈立等, 2018), 增氮增硫处理(Zhang et al., 2013), 以及采用合理的栽植模式等已展开其对重金属污染修复的一系列研究.另有外源激素及其类似物的添加, 如植物生长调节剂生长素(IAA)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)的施加以提高植物的修复能力等(何冰等, 2014).

通过外源ABA来提高植物的抗逆能力, 尤其是提高植物对重金属的富集能力方面, 是近年来土壤修复的研究热点(Han et al., 2016).但由于天然型ABA的生产成本高且稳定性差因而未像其他植物激素一样被广泛应用, 因此, 寻找ABA功能类似物具有巨大应用潜力和市场价值.相关研究者在寻找ABA替代物及其类似物方面进行了大量研究并合成了一系列的ABA功能类似物和衍生物, 如8′, 8′, 8′-三氟甲基ABA、2, 3-环丙化类似物(吴清来, 2004), AM1(ABA mimic 1)、在AM1基础上合成的含氟衍生物AMF4(Cao et al., 2013；Cao et al., 2018)、以及8′位上为炔基的8′-炔基脱落酸[8′-(C₂H)ABA]等, 其效果与天然ABA相似甚至比ABA的活性更高(Kim et al., 1995；Abrams et al., 1997), 使其在综合性能上比天然ABA有了较大的改善, 从而更接近于实际应用(McArtney et al., 2014).关于ABA在植物修复上的研究较多, 但有关8′-(C₂H)ABA强化植物修复重金属污染的研究未见报道.本实验室通过有机合成的方法合成了ABA类似物8′-(C₂H)ABA, ABA与8′-(C₂H)ABA的结构式如图 1所示, ABA类似物8′-(C₂H)ABA, 其结构式与ABA相似, 与ABA不同的是8′位上的甲基被乙炔基替代, 这样能够避免失活, 它具有比ABA较好的活性, 有着类似的作用效果.

本实验选用东南景天为植物材料, 通过水培的方法在重金属Zn、Cd单一胁迫的条件下：探究了外源8′-(C₂H)ABA处理对东南景天生长、各部位的Zn/Cd含量和Zn/Cd的积累量、转运系数以及各生理特性等方面的不同影响, 初步探讨了8′-(C₂H)ABA作用于东南景天耐Zn/Cd胁迫的效应, 对比分析了8′-(C₂H)ABA和ABA对东南景天生长, 生理特性以及Zn/Cd积累的差异性.研究表明, 8′-(C₂H)ABA在一定条件下通过提高东南景天抗氧化酶活性来增强对重金属的抗性, 从而促进东南景天的生长及其对Zn/Cd的积累, 并且与ABA的作用效果类似, 为8′-(C₂H)ABA在植物修复重金属污染的研究提供科学依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料

实验选用植物材料为东南景天, 种植于实验室温室内, 备实验用, 温室最高/最低温度为24/20 ℃, 光照时长为12 h·d^-1.所施加的脱落酸(ABA, 纯度为95%)购于上海源叶生物科技有限公司、ABA类似物8′-(C₂H)ABA由本实验合成, 所用浓度皆为20 mg·L^-1；施加方式皆为叶面喷洒, 形成水膜为限, 且在夜间进行.

2.2 实验方法

将东南景天幼苗(约8 cm)移至含50 mL 1/2 Hoagland营养液的塑料容器中进行预培养, 一周后, 采取向1/2 Hoagland营养液中添加重金属的方式进行胁迫处理以及8′-(C₂H)ABA处理.以CdCl₂·2.5H₂O的形式加入使得Cd胁迫浓度为20 mg·L^-1, 以ZnSO₄·7H₂O的形式加入使得Zn胁迫浓度为160 mg·L^-1.在两个重金属胁迫下, 分别设置ABA、8′-(C₂H)ABA两个实验组(分别标记为T1、T2), 以施加H₂O为对照组(CK₂), 另外设置一个无重金属添加, 也无外源物质添加的空白组(CK₁), 每个处理1株植物, 设置4个重复, 7 d后取样并测定各生理指标, 期间补充消耗的水分.同时收获植株, 用自来水冲洗干净, 根部用20 mmol·L^-1 EDTA-Na₂(分析纯)浸泡15 min以去除根表面吸附的Cd²⁺, 再用去离子水冲洗干净并用吸水纸擦干, 按照根、茎、叶分开, 分别测其鲜重(Fresh Weight, FW/g), 随后置于烘箱105 ℃杀青10 min, 75 ℃烘干至恒重, 测其干重(Dry Weight, DW/g), 粉碎后贮存于封口袋中供重金属含量的测定.

2.3 分析方法

植株各部位重金属含量的分析：取烘干的植物样品0.2 g于消解罐中, 加入10 mL HNO₃-H₂O₂(4:1, V/V, 皆为分析纯)的混合液于微波消解装置中进行消解, 过滤, 定容至50 mL, 采用iCE 3500型火焰原子吸收分光光度计测定滤液中重金属的浓度.

植株各生理生化指标的测定参照植物生理学实验指导(李合生等, 2000)：在各实验组选取叶龄一致的叶片, 剪碎, 称取1 g样品待测.叶绿素的含量采用95%乙醇提取法；丙二醛(MDA)及可溶性糖(SS)含量采用硫代巴比妥酸法；可溶性蛋白(SP)含量用考马斯亮蓝法；脯氨酸(Pro)含量用磺基水杨酸法；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法(NBT)测定, 过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)活性采用试剂盒测定(南京建成生物工程研究所).

数据分析：数据采用Excel 2010计算整理, SPSS软件进行差异性分析, 利用Origin 9.1软件绘图.

3 结果(Results) 3.1 东南景天生物量及光合色素含量的变化

重金属胁迫下, 外源8′-(C₂H)ABA处理对东南景天生物量的影响见图 2, 外源8′-(C₂H)ABA处理使东南景天鲜重和干重都有一定程度的增加, 说明促进了东南景天的生长.重金属Cd胁迫下, 东南景天生长变缓, 导致生物量降低, 且8′-(C₂H)ABA处理后东南景天的鲜重较CK₂增加了16.7%, ABA处理后较CK₂增加了19.7%, 且ABA与8′-(C₂H)ABA处理之间无显著差异.在Zn胁迫下, 8′-(C₂H)ABA、ABA处理也能使东南景天的生物增加但没有Cd胁迫下的促进效果好.结果表明8′-(C₂H)ABA与ABA的作用效果在促进东南景天生长方面类似, 即8′-(C₂H)ABA的外源处理能够提高东南景天对重金属Cd/Zn的抗性, 对植物的生长有促进作用, 尤其是在Cd胁迫下, 使生物量明显提高.

重金属胁迫可导致叶绿素含量下降, 叶绿素a/b可作为植物叶片衰老的指标(聂坚等, 1974).由表 1可知, 在重金属胁迫下, 外源8′-(C₂H)ABA处理对东南景天各叶绿素有不同的影响.在重金属Cd胁迫下, 东南景天叶绿素a含量较CK₁降低15.7%, 经8′-(C₂H)ABA、ABA处理分别较CK₂增加12.7%、14.8%；而Zn胁迫使东南景天叶绿素a含量增加, 且8′-(C₂H)ABA与ABA作用效果一样均对东南景天叶绿素a含量没有明显的促进效果.在Cd胁迫下东南景天叶绿素b没有明显变化, 在Zn胁迫下的变化趋势与叶绿素a的一致.东南景天叶绿素a/b比值变化较复杂, 没有明显的变化趋势, 需进一步研究.东南景天叶绿素总含量(Chla+Chlb)的变化与叶绿素a变化一致, 即在Cd胁迫下较叶绿素总含量较CK₁降低11.0%, 经8′-(C₂H)ABA、ABA处理分别较CK₂增加10.6%、8.7%.以上结果说明, 外源8′-(C₂H)ABA与ABA作用效果类似, 并且在Cd胁迫下, 外源8′-(C₂H)ABA处理较ABA可以更好的促进植物光合色素的合成, 以增强其光合作用, 从而促进其生长以增加生物量.

3.2 东南景天重金属含量及转运系数的变化

东南景天各部位重金属含量大小表现为根>茎>叶, 外源8′-(C₂H)ABA、ABA处理对东南景天各部位重金属含量有着不同的影响.由表 2可知, 8′-(C₂H)ABA处理使东南景天根部Cd和Zn含量分别较CK₂增加了44.2%、8.5%, ABA处理分别增加了43.7%、12.4%, 且ABA、8′-(C₂H)ABA处理之间无显著性差异.8′-(C₂H)ABA处理使东南景天叶中Cd和Zn含量较CK₂增加了27.5%、74.9%；ABA处理使东南景天叶中Cd含量增加了10.9%, 对Zn含量没有明显影响.东南景天茎部Cd含量的变化与根、叶部的不同, 8′-(C₂H)ABA处理后并没有使东南景天茎部的Cd含量明显增加, 这可能与其根部吸收重金属的能力和转运系数有关.东南景天经外源8′-(C₂H)ABA处理, 其转运系数也明显增大, 即转运能力明显提高.8′-(C₂H)ABA处理使东南景天对Cd和Zn的转运系数分别较CK₂提高了35.3%、49.9%, 而ABA处理分别较CK₂提高了17.6%、25%, 且ABA、8′-(C₂H)ABA处理之间差异显著.重金属转运系数是植物地上部分重金属含量与根部重金属含量的比值, 能反映植株向上转运重金属的能力, 其值越大, 表示植物对重金属的转运能力越强(王卫红等, 2017).

外源8′-(C₂H)ABA处理使东南景天对重金属Cd和Zn的转运能力增强, 将Cd和Zn从其根部转运至叶中富集, 使茎部含量降低, 叶中的含量增加, 并将其富集.8′-(C₂H)ABA处理使东南景天富集Cd和Zn的量分别较CK₂增加了32.2%、12.4%, ABA处理分别较CK₂增加了16.5%、6.8%, 且在富集Cd方面8′-(C₂H)ABA表现良好的促进效果.以上结果说明, 8′-(C₂H)ABA处理能促进东南景天对Cd和Zn的富集, 且能达到与ABA一样的促进效果, 在强化植物修复重金属污染上具有较大的应用潜力.

3.3 东南景天丙二醛和渗透调节物质的变化

逆境胁迫会使植物细胞膜脂过氧化程度加深, 产生过量的丙二醛(MDA), MDA作为膜脂过氧化的最终产物, 其含量的变化反映细胞受伤害的程度.东南景天叶片中MDA含量的变化如图 3所示.由图 3可知, 在Cd胁迫下, 外源8′-(C₂H)ABA处理使东南景天叶中MDA含量显著降低, 较CK₂降低了40.1%, ABA处理较CK₂降低了45%, 而ABA和8′-(C₂H)ABA处理之间无显著性差异.在Zn胁迫条件下, 8′-(C₂H)ABA处理与ABA处理一样, 并没有使东南景天叶片中的MDA含量明显降低.以上结果说明, 外源8′-(C₂H)ABA处理与ABA处理一样能够缓解重金属对东南景天的伤害, 尤其是缓解Cd对东南景天的伤害, 可能是因为Zn对东南景天的毒害性低于Cd的, 使得8′-(C₂H)ABA和ABA处理对Zn胁迫下东南景天MDA含量的降低趋势不明显, 具体需进行进一步研究.

可溶性糖(SS)、可溶性蛋白质(SP)和脯氨酸(Pro)是植株主要的渗透调节物质, 在重金属胁迫下, 这3种渗透调节物质经外源8′-(C₂H)ABA、ABA处理后均有不同的影响.由图 4可知, 东南景天受到重金属胁迫后, 渗透调节物质增加.在Cd胁迫下, 外源8′-(C₂H)ABA处理会使东南景天叶片中SS和Pro含量降低, 分别较CK₂降低了13.1%、37.4%, ABA处理分别较CK₂降低了15.9%、30.4%, 而8′-(C₂H)ABA与ABA处理之间无显著性差异.在Zn胁迫下, 外源8′-(C₂H)ABA、ABA处理对东南景天SS、Pro含量的影响与在Cd胁迫条件下表现一样.且外源8′-(C₂H)ABA处理与ABA一样对重金属胁迫下东南景天叶片中SP含量没有明显的影响.以上结果说明, 外源8′-(C₂H)ABA处理降低了重金属对东南景天的毒性, 没有使植株因为响应重金属胁迫而使体内SS、SP、Pro含量增加, 且作用效果与ABA类似.

3.4 东南景天抗氧化酶活性的变化

在重金属胁迫下, 8′-(C₂H)ABA对东南景天叶片中抗氧化酶活性的影响如图 5所示.由图 5可知, 在Cd胁迫下, 8′-(C₂H)ABA处理使东南景天叶片中SOD、POD、CAT活性分别较CK₂提高了53.0%、24.7%、28.0%, 而ABA处理分别较CK₂提高了22.5%、28.2%、55.7%.在Zn胁迫下, 外源8′-(C₂H)ABA、ABA处理对3种酶活性的影响与Cd胁迫下的不同, 外源8′-(C₂H)ABA处理仅提高了东南景天SOD、CAT活性, 降低了POD活性；ABA处理提高了SOD、CAT的活性, 而对POD的活性没有明显的影响.以上结果说明, 在重金属胁迫下, 东南景天经外源8′-(C₂H)ABA处理后其3种抗氧化酶活性得到了不同程度的提高, 且8′-(C₂H)ABA与ABA作用效果相似, 通过增强东南景天抗氧化酶活性以此来提高东南景天的抗逆性, 使其更好的适应重金属胁迫环境, 达到对重金属的吸收和富集效果.

4 讨论(Discussion)

植物受到重金属胁迫时, 通过降低植物叶绿素含量而抑制其光合作用, 从而降低植物生长, 可以用植物的生物量来反映植物对逆境胁迫的抗性.研究表明, 外源ABA能够缓解Pb诱导的光合作用和根系生物量的减少, 降低Pb诱导的根系或叶片中活性氧(ROS)的过量产生(Shi et al., 2018).在本研究中, 外源8′-(C₂H)ABA处理与ABA一样, 能使重金属胁迫下东南景天叶绿素含量显著增加, 增强其光合作用, 从而促进生长, 使得生物量均明显增加, 这可能与8′-(C₂H)ABA提高东南景天对毒性金属Cd的耐受性, 增加了对营养元素吸收有关.此外, 可能是由于Cd与Zn毒性的差异性, 使得外源8′-(C₂H)ABA处理对Zn胁迫下东南景天的生长没有明显的促进作用.结果表明, 外源8′-(C₂H)ABA处理使东南景天对重金属的耐受性增强, 且能达到与ABA类似的作用效果.其他相关研究表明, ABA处理能够增加Cd胁迫下小麦叶片叶绿素含量以及降低Cd对植物的毒害性(Han et al., 2016).通过施加外源激素SA与ABA, 发现25 mg·L^-1的SA与2.5 mg·L^-1的ABA处理能够提高玉米幼苗叶绿素含量, 提高净光合速率, 增加了光合产物积累量, 提升自身抵御盐胁迫的能力(高山等, 2017).

东南景天对重金属的吸收和富集量表征了该植物在特定条件下吸收、富集重金属的能力, ABA通过促进植株根部对重金属的吸收、以及向地上部的转运能力从而提高其富集量, 有利于植物修复重金属污染的水体或土壤(Xiong et al., 2011).在本研究中, 外源8′-(C₂H)ABA处理明显促进了东南景天对重金属的吸收和转运能力, 且能达到与ABA一样的促进效果, 使得植株中的Cd和Zn的积累量也随之增加.相关研究也表明, 适量的ABA能够促进东南景天等植物对Cd的吸收和转运能力(何冰等, 2014；Wang et al., 2016；Liu et al., 2017).说明8′-(C₂H)ABA在植物修复重金属和提高植物抗逆能力方面有望替代ABA, 具有实际应用潜力.

植物遭受逆境环境时, 其细胞会发生膜脂过氧化, MDA作为膜脂过氧化的最终分解产物, 是植物细胞膜质过氧化程度的体现, 其含量高说明植物细胞膜脂过氧化程度高, 细胞膜受到的伤害严重(聂坚等, 2016).重金属胁迫会使植物体内活性氧和H₂O₂等活性氧含量上升, 导致并加剧了细胞膜脂过氧化的程度.在本研究中, 外源8′-(C₂H)ABA处理能在一定程度上降低重金属尤其是Cd胁迫下东南景天叶片中MDA含量, 即缓解了由活性氧引起的细胞膜脂过氧化, 降低了细胞膜受损伤程度, 从而减轻了重金属胁迫对植物生长的抑制作用, 且能达到与ABA一样的缓解效果.

植物提高自身抗逆性的途径还有渗透调节, 脯氨酸是植物体内一种重要的渗透物调节物质, 植物在逆境条件下, 可迅速积累, 其含量的增加是植物对逆境胁迫的一种适应性反应.在本研究中, 外源8′-(C₂H)ABA、ABA处理均使重金属胁迫下东南景天叶片中游离脯氨酸和可溶性糖含量降低, 可能是8′-(C₂H)ABA处理降低了重金属对东南景天的毒害性而使东南景天没有响应重金属胁迫而提高体内的渗透调节物质, 其具体机制需进一步研究.

植物在正常生理代谢过程中会产生活性氧, 活性氧会对植物造成毒害, 其体内含有多种抗氧化酶如SOD、POD、CAT等, 它们对清除植物体内自由基和维持植物体内氧化平衡极为重要(聂坚等, 2016).当植物遭受逆境时, 植物细胞就会产生并积累大量的活性氧(ROS), 使细胞毒性增强, ROS的大量积累会造成植物细胞代谢失调, 从而影响植物正常生长(张然然等, 2016).相关研究表明, 外源ABA能够提高胡杨细胞的抗氧化酶活性, 有效缓解SO₂对胡杨细胞的毒性(韩彦莎等, 2018).ABA预处理能提高水稻幼苗的SOD、CAT、POD和APX抗氧化酶活性, 降低碱度和百草枯诱导的ROS积累以及幼苗损伤和死亡(Liu et al., 2019).外源ABA通过提高SOD、POD、CAT活性以及Pro含量来缓解Cd胁迫对小麦幼苗生长的抑制作用, 从而提高其对Cd胁迫的耐受性(Han et al., 2012).在本研究中, 外源8′-(C₂H)ABA处理提高了重金属胁迫下东南景天抗氧化酶活性, 且与ABA的作用效果类似, 在Zn胁迫条件下又有差异性, 可能是8′-(C₂H)ABA处理对Cd、Zn胁迫条件下东南景天抗氧化酶系统缓解和防御氧化胁迫的作用不同, 故还需进一步研究探讨.

ABA容易失活稳定性差, 主要是8′位上的甲基容易发生羧基化反应生成8′-羟基-ABA(8′-OH-ABA), 进一步使ABA失活, 半衰期短.8′-(C₂H)ABA的作用效果不仅与ABA类似, 半衰期长稳定性好, 而且合成所需原材料及合成工艺路线简单、可规模化生产等, 具有非常好的应用前景.

5 结论(Conclusions)

1)8′-(C₂H)ABA的作用效果与ABA类似,在一定浓度下可以有效地促进重金属尤其是Cd胁迫下东南景天光合色素的合成,让其更好的生长使得生物量明显增加,因此,8′-(C₂H)ABA在强化植物修复重金属污染方面具有应用前景.

2)8′-(C₂H)ABA通过提高东南景天抗氧化酶活性来缓解体内发生的氧化胁迫,以提高其耐性,从而增强东南景天对重金属的吸收和富集,使东南景天地上部和根部的重金属含量增加,具有较好的应用前景,可以作为ABA的替代物进行深入研究.

3)一定浓度的8′-(C₂H)ABA在植物生长和吸收、富集重金属及响应重金属方面均能达到与ABA相同的作用效果.因此,8′-(C₂H)ABA作为ABA类似物,同样具有强化植物修复重金属污染的潜力,为今后8′-(C₂H)ABA应用于更多植物修复的可行性研究上提供思路.