2020, Vol. 40
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2. 大连理工大学工业生态与环境工程教育部重点实验室, 盘锦 124221;
3. 大连理工大学盘锦产业技术研究院, 盘锦 124221;
4. 启迪桑德环境资源股份有限公司环境研究院, 北京 100084;
5. 大连理工大学生命科学与药学学院, 盘锦 124221
2. Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering, Ministry of Education, Dalian University of Technology, Panjin 124221;
3. Panjin Industrial Technology Research Institute, Dalian University of Technology, Panjin 124221;
4. Environmental Research Institute of Sang De Environmental Resources Co., Ltd., Beijing 100084;
5. College of Life Science and Pharmacy, Dalian University of Technology, Panjin 124221
黑水虻(Hermetia illucens L.)又名亮斑扁角水虻, 原产于热带和亚热带地区, 是一种营腐生性水虻科昆虫(Newton et al., 1977; Sheppard, 1983; Tomberlin et al., 2009), 能够以畜禽粪便、餐厨垃圾等有机物为食(Nguyen et al., 2015; Wang et al., 2017a), 将有机废弃物转化为稳定的生物质和植物肥料(Lalander et al., 2015).收获的黑水虻幼虫, 体内不仅含有大量的粗蛋白和脂肪, 还含有丰富的必需氨基酸与微量元素, 可以作为动物饲料或饲料添加剂使用(Newton et al., 1977; Bondari et al., 1981; Wang et al., 2017b; 宋宇琨等, 2019).黑水虻成虫后不摄取食物, 仅取食少量水, 也不喜欢侵入人类居住环境, 所以成虫不传播病菌.此外, 黑水虻会与家蝇竞争生长环境, 幼虫可以抑制家蝇产卵(Bradley et al., 1984; Sheppard et al., 2002; Erickson et al., 2004), 使得黑水虻作为一种新型的资源型昆虫, 受到动物学、环境科学与工程领域的广泛关注(Newton et al., 1977; Tomberlin et al., 2002; Tomberlin et al., 2015).
厨余垃圾占我国城市有机固体废弃物的比例高达56.7%(Yang et al., 2012), 2014年以来我国厨余垃圾的年产量超过6000万吨, 并以每年10%的比例增长(毕少杰等, 2016).目前, 餐厨垃圾主要使用与活性污泥混合厌氧发酵的方式降解和处理(段妮娜等, 2013; 袁宏林等, 2019), 但由于厌氧发酵工厂数量有限, 使得厨余垃圾处理比率和能力不足, 资源化率低, 加重了卫生和环境负担.同时, 由于厨余垃圾成分复杂, 含水率高, 淀粉、油脂等有机物含量高, 导致厨余垃圾在储存、转运和处理的过程中极易腐败变质, 滋生病害菌(王攀等, 2013; 牛颖等, 2016).这就需要一种快速、高效、低设备成本、且有效抑制病害菌的厨余垃圾处理方法, 来填补厌氧发酵处理能力的不足.黑水虻在处理厨余垃圾方面潜力巨大, 其低成本、高效快速的特点, 有可能可以满足以上厨余垃圾处理的资源化和卫生安全要求.
然而, 病原菌在黑水虻处理厨余垃圾过程中的灭活规律却鲜有报道.已有的病原菌灭活规律的研究, 均是在以畜禽粪便为基质的环境中展开.比如, Erickson等(2004)报道了在黑水虻处理鸡粪、猪粪和牛粪的过程中, 大肠杆菌O157:H7经3 d被部分或全部灭活, 鼠伤寒沙门氏菌被抑制和减少, 但不能被彻底灭活, 且黑水虻体内有沙门氏菌感染.Lalander等(2015)报道了黑水虻在处理猪粪和人粪的过程中, 沙门氏菌在7 d内全部灭活, 但热耐受大肠杆菌、肠球菌和噬菌体ØX174不受抑制的现象.Liu等(2008)也报道了黑水虻在处理牛粪过程中, 大肠杆菌等在3 d内被快速减少和抑制的研究.以上报道, 一方面存在数据的差异和矛盾, 受到实验条件的影响, 另一方面, 以上研究均是在以畜禽粪便为基质的条件下展开, 而在厨余基质中, 病原菌的灭活规律, 却未有报道.厨余垃圾基质与粪便基质存在显著差异, 比如厨余垃圾的有机质含量高, 营养成分丰富, 处理过程中的环境pH值和菌群结构与畜禽粪便都可能存在差异, 不能通过畜禽粪便中的病原菌灭活效果简单推理厨余垃圾中的病原菌灭活趋势.另一方面, 病原菌的灭活机制, 可能受到黑水虻免疫应答能力、黑水虻肠道菌群、环境菌群结构、环境酸碱性条件等多方面的影响, 而已有的研究中, 基本忽略了病原菌灭活机理的探讨, 仅就存活数量和处理条件进行考量, 在病原菌的灭活机制方面的探索显著不足.
在我国食品安全检测中, 大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌是食品检测检疫的常规重点病原菌.其中大肠杆菌O157：H7, 具有耐酸性, 在pH 4.0的环境下仍然能够存活, 能引起人的感染性腹泻(Hermos et al., 2011).沙门氏菌, 对酸敏感, 最适生长pH为6.8~7.8(Kotova et al., 1988), 能引起人和动物的败血症、肠胃炎、流产等(Andino et al., 2015).金黄色葡萄球菌, 最适生长pH为7.4, 有较强的抗逆性, 在环境中广泛分布, 是食源性感染中仅次于大肠杆菌的第二位致病菌(Argudín et al., 2010), 同时部分菌株还具有抗生素抗性, 能引起严重的皮肤感染和肺炎(Purrello et al., 2016).目前, 大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌, 在黑水虻处理厨余过程中灭活规律和机理未有报道, 而金葡菌在黑水虻处理各种有机废弃物的研究中均未见报道.
综上, 鉴于黑水虻处理厨余垃圾过程中的病原菌灭活规律不明, 灭活机理研究匮乏的现状, 本研究建立了黑水虻处理的厨余垃圾的实验平台, 分2次向厨余垃圾中分别接种大肠杆菌O157：H7(EC)、鼠伤寒沙门氏菌(ST)和金黄色葡萄球菌(SA), 研究EC、ST、SA的灭活效率、环境pH值的变化规律、黑水虻体内的抑菌因素、以及EC、ST、SA对黑水虻生长增重和厨余垃圾转化效率的影响, 说明黑水虻转化厨余垃圾的卫生安全性及可行性, 为黑水虻处理厨余垃圾的生产实践提供理论参考和实验依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料 2.1.1 实验仪器与试剂药品实验仪器包括：超净工作台, JD-CJ-2S, 北京东联哈尔仪器; 高压蒸汽灭菌锅, Yamato-IC612C, 武汉雅马拓仪器; 多功能碎菜机, 型号280, 永康市铂欧五金制品; 高通量组织研磨仪, SCIENTZ-48, 宁波新芝; pH计, FE38型, 上海梅特勒-托利多; 涡旋震荡混匀器, 型号MX-F, SCILOGEX公司; 数显游标卡尺, CR2032, 永康市飞尔工贸; 四分位分析天平, ME204E, 上海梅特勒-托利多; 高速离心机, 5417C, 德国艾本德; 烘箱, DKM610C, 武汉雅马拓仪器.
实验试剂药品包括：胰蛋白胨大豆肉汤培养基, TSB, 杭州微生物试剂; 3种病原菌的选择性显色培养基, 法国科玛嘉公司(CHROMagar)生产, 购自上海欣中生物工程公司; 其他试剂和药品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.
2.1.2 黑水虻幼虫的准备黑水虻虫卵, 购自江苏安佑生物科技有限公司, 虫卵产于该公司位于广西南宁市宾阳县王灵镇的巴奥泰昆虫养殖场.黑水虻虫卵运至实验室以后, 于到达当天转入孵化基质中, 进行孵化培养.孵化基质使用干燥的豆粕：玉米粉：麸皮按质量比6:3:1的比例配制, 添加去离子水, 使含水率达到65%.约500 g孵化基质, 平铺放入4 L的长方形塑料盒以后, 加入25 g虫卵, 于塑料盒上覆盖2层无纺布, 并用夹子固定, 于25 ℃室温下, 进行孵化.约6 d时间, 虫卵孵化出肉眼可见的小幼虫, 小幼虫经10目筛网爬行掉落, 从而与孵化基质分离, 称重和计数后于当天使用.
2.1.3 厨余垃圾的准备厨余垃圾, 为餐后食物垃圾, 取自大连理工大学盘锦校区的校园食堂.麦麸, 用于调节厨余垃圾的含水率, 购自辽宁省盘锦市的农家河蟹大米店铺.新鲜的厨余垃圾转运至实验室以后, 用多功能碎菜机切碎搅拌, 使物料充分混合均匀, 测试含水率约为70%±4%, 向厨余垃圾中添加质量约为厨余湿重的10%的麦麸, 使厨余垃圾含水率达到约65%, 随后将厨余垃圾在4 ℃(1~2 d)或-20 ℃(长期)保存备用.此厨余垃圾经3种病原菌的显色培养基检测, 均为病原菌阴性.
2.1.4 病原菌的制备本实验选用的病原菌, 分别是大肠杆菌O157：H7(Escherichia coli O157:H7), 简写EC, 菌种编号NCTC12900, 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium), 简写ST, 菌种编号ATCC14028, 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus), 简写SA, 菌种编号ATCC43300, 均购自江苏南京百思一基生物材料公司.3种致病菌的检测计数, 使用选择性显色培养基(法国科玛嘉CHROMagar)的平板计数法.其中EC使用改良大肠杆菌O157显色培养基, 阳性菌种呈现浅红色至淡紫色, 中心灰褐色; ST使用沙门氏菌显色培养基, 阳性菌种呈现淡紫色; SA使用金黄色葡萄球菌显色培养基, 阳性菌种呈现紫红色、红色或粉红色.3种病原菌EC、ST和SA, 以斜面培养物的形式运输至实验室, 斜面培养物经无菌接种针分别挑取, 接入灭菌的TSB培养基中, 于37 ℃和200 r·min-1的条件下摇床培养12~16 h, 4 ℃下保存备用.同时, 菌液经磷酸盐缓冲液(pH 7.4)10倍梯度稀释, 于显色培养基上37 ℃培养16 h后计数, 菌液浓度通常可达108~109 CFU·mL-1.
2.2 黑水虻幼虫处理厨余垃圾的实验方法 2.2.1 实验分组实验共分为两个大组, 分别是添加了黑水虻的实验组和不添加黑水虻的对照组, 每个大组内又分为3个小组, 分别是添加了EC、ST和SA的实验小组, 且每个小组两个平行.
2.2.2 实验设计按照每500 g厨余垃圾由800只黑水虻幼虫处理来设计实验.其中500 g厨余垃圾分两次, 在第0和第6 d分别加入, 每次加入250 g, 且在加入前混入病原菌培养液, 800只黑水虻在第0 d一次加入.实验共持续18 d, 在18 d内阶段性采集虫沙(虫粪及处理剩余物)样品和黑水虻幼虫样品, 在第18 d实验结束, 手工分离虫沙和幼虫, 并采集终点虫沙和幼虫样品.
2.2.3 饲养管理黑水虻处理厨余垃圾的实验, 整体是在一个封闭、通过纱窗透气并防止外来生物入侵的室内环境下完成的, 室温(25±3) ℃, 日照时间12~14 h.黑水虻幼虫的饲养在容积为4.6 L的长方形塑料饭盒(240 mm×120 mm×160 mm)容器中进行.黑水虻幼虫先经手工数出100只称重, 并重复3次, 3次平均值为0.0375 g/100只虫, 则若要获得800只虫, 需称量0.30 g幼虫.在第0 d, 根据实验分组, 向每个容器中添加250 g厨余垃圾, 再添加2.5 mL的EC、ST或SA菌液, 用无菌金属棒充分搅拌和混合均匀后, 添加0.3 g即800只6日龄的黑水虻幼虫.第0 d黑水虻组和对照组制备完成后, 分别采集约5 g厨余垃圾样品, 进行病原菌的平板计数和pH值检测.
在第0~6 d中, 容器盒盖保持关闭, 防止幼虫逃逸, 盒盖上制作有10个ϕ 6 mm的通气孔, 以利于空气交换, 同时每天通过无菌金属棒搅拌约5 min, 增加换气.在第2、4、6 d, 金属棒搅拌完成后, 黑水虻组和对照组各自采集约5 g虫沙(黑水虻组)或剩余物(对照组)样品, 进行病原菌的平板计数和pH值检测.并在第6 d, 各采集4~6只黑水虻幼虫, 进行幼虫体内的病原菌检测.
在第6 d, 采样结束后, 向黑水虻组和对照组中, 再次添加250 g含水率为65%的厨余垃圾, 并对应添加2.5 mL的过夜培养的病原菌菌液, 用无菌金属棒搅拌均匀后, 开始第二轮处理.在第6~12 d中, 容器盒盖同样保持关闭, 每天搅动5 min来增强通气, 在第6、7、8、9、10、12 d, 黑水虻组和对照组各自采集约5 g虫沙(黑水虻组)或剩余物(对照组)样品, 进行平板计数和pH值检测.在第12 d, 每个实验组采集3~5只幼虫, 进行幼虫体内的病原菌检测.在第12~18 d中, 不添加新的厨余垃圾或致病菌液, 但每天混合搅拌5 min, 同时实验饭盒盒盖以1/2的面积敞开约8 h, 促进虫沙水分的挥发和散失.
在第18 d, 厨余垃圾处理实验结束, 黑水虻组与对照组的EC、ST和SA小组分别采集10 g虫沙或剩余物样品, 用于病原菌和pH值检测, 采集5~10只幼虫样品用于幼虫体内病原菌检测.随后, 黑水虻幼虫和虫沙, 经过人工搅拌和分离, 分出虫沙和虫体以后, 分别称重, 于-20 ℃下冷冻保存以备后续检测.
2.3 相关指标的测定方法 2.3.1 病原菌的计数检测方法对EC、ST及SA的计数检测主要采用梯度稀释和涂布平板计数法.厨余垃圾、虫沙(黑水虻组)及剩余物(对照组)样品, 于采样当天进行病原菌检测.样品按照1:10(W/V)比例添加无菌磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4), 经涡旋振荡混匀5 min以后, 室温静置10 min, 取上清液, 使用PBS缓冲液进行10倍梯度稀释, 取适宜稀释度的100 μL溶液, 涂布于选择性显色培养基上, 于37 ℃恒温条件下倒置培养18~24 h, 选择显阳性颜色的菌落计数, 每个样品2个平行.此方法的理论检测极限为100 CFU·g-1(CFU, cell forming unit).
黑水虻幼虫体内的病原菌的检测, 同样使用梯度稀释和平板计数法, 不同之处是样品前处理步骤, 具体如下：黑水虻幼虫经无菌水清洗后, 放入84消毒液中浸泡2 min, 去除体表微生物, 再用无菌水冲洗3次, 擦干后放入2 mL灭菌离心管中, 同时放入若干无菌钢珠, 按1:10(W/V)的比例加入无菌PBS缓冲液, 利用高通量组织研磨仪(宁波新芝SCIENTZ-48)在40 Hz条件下研磨2 min, 得到组织匀浆液.匀浆液经2000 r·min-1离心5 min, 得上清液后, 进行梯度稀释和平板计数, 如上文所述.
在操作中, 若检测结果为阴性, 则对样品重新处理, 进行1:10(W/V) PBS混合和匀浆处理后, 取混合液或匀浆液200 μL涂布于选择性显色培养基上, 培养和计数同上.此操作可将检测极限进一步降至50 CFU·g-1.若200 μL的混合液或匀浆液的检测结果仍然为阴性, 则认为样品中病原菌的浓度低于检测极限, 数据处理中以0 CFU·g-1计入.
2.3.2 病原菌的灭活机理分析方法为了进一步研究黑水虻幼虫的肠道微生物和自身免疫分子对病原菌灭活的作用, 本研究采集了黑水虻组中EC、ST和SA小组第9 d的黑水虻幼虫5~8只, 进行了体外抑菌实验.具体如下：在EC、ST、SA实验组的两个平行实验容器中, 分别取第9 d的黑水虻幼虫5~8只, 表面经84消毒液浸泡2 min、无菌水清洗3次后, 以1:10(W/V)的比例加入无菌PBS后, 利用组织研磨仪匀浆研磨, 所得溶液经2000 r·min-1离心5 min后, 得到含有黑水虻肠道菌群和体液免疫分子的匀浆液, 匀浆液的一半于4 ℃下保存, 另一半通过0.22 μL的滤膜过滤, 得到去除了黑水虻肠道菌群、主要含有体液免疫分子的过滤匀浆液.随后, 在1×TSB培养基的体系内, 分别接入1/10体积的匀浆液或过滤匀浆液(对照组为无菌水), 1/10体积的EC、ST或SA菌液(约106 CFU·mL-1), 并在37 ℃的条件下摇床(190 r·min-1)培养8 h.培养液经PBS缓冲液10倍梯度稀释后, 在选择性显色培养平板上计数.以对照组(无菌水)的病原菌数量为基准, 匀浆液和过滤匀浆液相对于对照组病原菌数量的减少率, 计为二者的抑菌率.
2.3.3 理化性质检测及转化效率评价方法① 含水率的检测.取3~5 g待测样品, 放入105 ℃的烘箱内, 烘干至重量不再减少为止, 烘干过程中减少的重量占样品总重的比率为含水率.
② pH值的检测.取2~3 g待测样品, 按照1:10(W/V)的比例添加无菌去离子水, 涡旋振荡混匀2 min后, 室温静置30 min, 使用FE38型pH计读取上清液的pH值.
③ 虫体测量.从不同小组中随机挑选10只黑水虻幼虫, 用清水洗净, 纸巾擦干后, 用天平称量10只虫总重, 随后计算平均体重.用数显游标卡尺测量幼虫体长.幼虫体重和体长的测量为每个小组4个平行.测量完毕后, 幼虫放回原实验容器内.
④ 预蛹率.在第18 d, 不同实验组分别随机挑选20~30只黑水虻虫体, 黑色虫体计为预蛹, 白色虫体计为幼虫, 对黑色虫体进行计数并计算其所占比率, 即为预蛹率.
⑤ 减量化率.对于第0 d的厨余垃圾样品和第18 d的虫沙样品, 测量湿重和含水率, 换算得到干重.厨余垃圾的减量化率, 计算如下：
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(1) |
式中, DM初为第0 d厨余垃圾干重(g), DM终为第18 d虫沙干重(g).
⑥ 生物转化率.黑水虻转化厨余垃圾的生物转化率计算公式如下：
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(2) |
式中, DM虫为第18 d黑水虻虫体干重(g), DM初为第0 d厨余垃圾干重(g), DM终为第18 d虫沙干重(g).
⑦ 虫产率.黑水虻取食厨余垃圾并将其转化为自身生物质, 虫产率的计算公式如下：
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(3) |
式中, DM虫为第18 d黑水虻虫体干重(g), DM初为第0 d厨余垃圾干重(g).
2.4 统计分析方法病原菌计数结果换算为log10 CFU·g-1或log10 CFU·mL-1后, 进行数据分析.数据制图使用SigmaPlot 12.0软件.显著性差异分析使用R软件的multcomp程序包完成, 对于含有时间为自变量的数据, 使用单因素协方差分析方法(ANCOVA), 设定时间为协变量, 对于不含时间为自变量的数据, 使用单因素方差分析方法(ANOVA), 均辅助以glht和cld命令比较因变量大小.将p < 0.05的情况定义为差异显著.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 病原菌的灭活规律对于黑水虻组和对照组, 虫沙或处理剩余物中的EC、ST和SA的检测结果如图 1所示.对于EC, 黑水虻组中, 第0 d, EC的接种浓度为6.9~7.1 log10 CFU·g-1, 在第2~4 d, EC浓度快速下降, 第6 d降到检测极限以下.在第6 d二次接种后, EC浓度达到5.2~5.8 log10 CFU·g-1.在第6~10 d, EC浓度更加快速下降, 并于第10 d降低到检测极限以下.黑水虻组和对照组在的EC浓度差异方面不显著(p=0.308).对于ST(图 1), 黑水虻组中, 第0 d, ST的接种浓度为6.0~6.3 log10 CFU·g-1, 在第2~4 d, ST的浓度快速下降, 在第4 d降到检测极限以下.在第6 d二次接种以后, ST浓度达到5.9~6.0 log10 CFU·g-1.在第6~9 d, ST浓度更加快速下降, 在第9 d降到检测极限以下.黑水虻组和对照组的ST浓度差异不显著(p=0.814), 但在第7和第8 d, 黑水虻组的ST浓度低于对照组.对于SA, 黑水虻组, 第0 d, SA的接种浓度为6.8~7.0 log10 CFU·g-1, 处理6 d后, SA的浓度下降到2.3~2.6 log10 CFU·g-1.在第6 d二次接种后, SA浓度达到6.6~6.7 log10 CFU·g-1.在第6~12 d, SA浓度逐渐下降到1.9~2.0 log10 CFU·g-1.在第18 d处理结束时, SA浓度维持在2.0~2.3 log10 CFU·g-1.黑水虻组和对照组的SA浓度差异不显著(p=0.350).以上为虫沙或处理剩余物的检测结果, 对于黑水虻体内病原菌的检测, 在第6、12、18 d收集到的黑水虻体内, 均未检测到EC、ST、SA的存活.
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| 图 1 黑水虻转化厨余垃圾过程中病原菌的灭活规律 Fig. 1 The inactivation of pathogen during the bio-conversion of kitchen waste by BSFL |
总的来说, ①在黑水虻处理厨余垃圾的过程中, EC在4~6 d的处理时间中, 被全部灭活, ST在3~4 d的时间被彻底灭活, SA在6 d的时间内达到约5个log10 CFU·g-1数量级的下降, 但处理结束时仍有约2.3 log10 CFU·g-1的数量存在(图 1).②黑水虻组的虫沙中, 病原菌的下降速度呈现EC=ST>SA的趋势(p < 0.001), 即EC和ST的下降速度相似, 都显著快于SA.③黑水虻组(虫沙)和对照组(剩余物)中, EC、ST和SA的下降趋势差异均不显著.④黑水虻样品(第6、12、18 d)体内未检测到EC、ST、SA的病原菌存活.
本实验中, 黑水虻组(虫沙)和对照组(剩余物)的EC、ST和SA下降速度相似, 说明环境微生物在抑制病原菌的繁殖复制方面可能起到重要作用.黑水虻处理厨余垃圾的环境中, 以Morganella, Bacteroides, Dysgonomonas, Phascolarctobacterium等菌属较为主要和常见(Jeon et al., 2011; Zheng et al., 2012; De Smet et al., 2018), 而厨余垃圾中, 以Stenotrophomonas, Enterobacter, Bacteroides, Clostridium等菌属报道较多(Hemdan et al., 2019; Sahu et al., 2019).所以, 虽然黑水虻组和对照组都通过环境微生物的竞争生长, 对病原菌的繁殖产生显著的抑制作用, 但是实际作用菌群不同.处理厨余的过程中, 黑水虻通过影响和维持环境微生物的菌群结构, 对病原菌的繁殖复制产生了间接抑制作用.另一方面, 黑水虻体内没有检测到活的病原菌, 说明黑水虻对于病原菌的存活有直接抑制作用.
对于EC, 本研究中发现EC在厨余垃圾(黑水虻组)中的灭活速度(4~6 d)快于或接近于EC在畜禽粪便中的灭活速度.EC在畜禽粪便中的灭活速度受到处理温度、粪便种类等因素的显著影响.比如, Erickson等(2004)的研究发现, E.coli O157:H7在27 ℃和32 ℃的条件下, 在鸡粪中经黑水虻处理3 d后, 浓度下降6个log10 CFU·g-1的数量级, 但在23 ℃环境中, E.coli O157:H7经3 d仅能下降1个log10 CFU·g-1的数量级, 同时E.coli O157:H7在鸡粪3 d后(27 ℃)几乎全部灭活, 而在猪粪中同样条件下仅能下降3个log10 CFU·g-1的数量级, 在牛粪中则无下降趋势.与此不同的是, 在Liu等(2008)所报道的绿色荧光蛋白标记的E.coli在牛粪中经黑水虻处理3 d(27 ℃), 可以下降6个log10 CFU·g-1的数量级.以上两项研究的菌种差异可能是灭活效率差异的原因之一, 而牛粪的组成和性质、黑水虻幼虫状态等, 可能对最终的抑菌效率都有影响.与以上两项畜禽粪便的研究相比, 本研究中所处理的厨余垃圾, 相比于畜禽粪便, 养分更高, 虽然更容易滋生细菌, 而且EC与其他菌群的竞争不存在明显优势, 使得黑水虻组中的EC的数量下降较快, 即使在25 ℃的条件下, 在4~6 d的时间内也能被全部灭活.另一方面, 以餐后食物为主的厨余垃圾相比于牛粪等畜禽粪便, 密度更大, 空隙更少, 可能更有利于黑水虻的蠕动以及与垃圾的全面均匀接触, 从而有利于病原菌的灭活.
对于ST, 本研究发现ST在厨余垃圾(黑水虻组)中的灭活速度(3~4 d)快于ST在畜禽粪便中的灭活速度.Erickson等(2004)发现, 在黑水虻处理鸡粪(27 ℃)的过程中, Salmonella在6 d内下降5个log10 CFU·g-1的数量级, 但仍有1.53 log10 CFU·g-1的残余, 而且检测到黑水虻感染Salmonella, 体内约有0.22 log10 CFU·g-1的数量存活.而与此不同的是, Lalander等(2015)检测到黑水虻在处理猪粪和人粪的混合物过程(25 ℃)中, Salmonella在6 d时间内可以被全部灭活.本研究结果发现, Salmonella在黑水虻体内无存活, 说明黑水虻对ST有直接抑制作用, 而黑水虻组和对照组ST浓度下降的相似性, 说明环境微生物对抑制ST的显著促进作用, 同时, 厨余垃圾的高营养, 导致微生物的大量滋生, 这可能是ST在厨余垃圾中的灭活速度显著快于畜禽粪便的主要因素之一.
对于SA, 不同于EC和ST, 黑水虻对于SA的灭活效力在已发表研究中未见报道.相比于EC和ST, SA有更强的抗逆性, 比如, 在O3灭活水中病原菌的研究中(Ofori et al., 2018), 同样条件下S. aureus的下降速度低于E. coli; 在亚热超声波灭菌的研究中(Chantapakul et al., 2019), 同样条件下S. aureus的下降数量低于E. coli 2个log10 CFU·mL-1的数量级.这些结果, 均与本研究中SA的灭活速度慢于EC、ST的结果相符.而此结果除了与SA的较强抗逆性有关以外, 同时也可能与SA是革兰氏阳性菌有关.比如Choi等(2012)就发现黑水虻的抗菌肽(甲醇提取物)对部分革兰氏阴性菌有显著抑菌作用, 但对革兰氏阳性菌的抑菌作用不明显.而且, 本研究中, 在第二轮的第6~12 d中, 黑水虻组的SA的下降速度相对于对照组还略高, 说明黑水虻间接影响的环境菌群对SA的抑制作用弱于对照组的菌群.虽然SA的数量在实验结束时(第18 d)下降了约5个log10 CFU·g-1的数量级, 但由于SA未被彻底去除, 还是不能完全满足卫生安全的需要.未来的研究中, 还需要针对提高SA灭活效率的方法做深入研究和探讨.
3.2 环境pH的变化规律环境pH值在黑水虻组和对照组两个大组内, 在EC、ST和SA小组中的变化趋势如图 2所示.第6 d, 由于添加了第二轮厨余垃圾, 为了区别添加之前和添加之后的环境pH值, 作图时, 对第6 d的环境pH值做了断线处理(图 2).第0 d, 黑水虻组和对照组的初始环境pH值均为5.3±0.1, 在0~6 d中, 均快速下降至4.0~4.4.在第6 d补加新的厨余垃圾以后, 环境pH值回归到4.4~4.8, 但随后又快速下降, 从第10 d开始, 环境pH开始逐渐上升.在第18 d, 黑水虻组达到中性-弱碱性(pH 6.9~7.4), 而对照组维持在弱酸性(pH 5.3~6.0).总的来说, 黑水虻组的环境pH值呈先下降后上升由酸性变碱性的趋势, 即在前12 d维持在酸性条件下, 在第12~18 d逐渐过渡到弱碱性, 而对照组在所有的18 d处理时间中, 均维持在酸性环境下.对于EC、ST和SA小组, 黑水虻处理和对照处理的pH值差异均不显著, (EC p=0.472, ST p=0.627, SA p=0.168), 黑水虻大组内, EC、ST和SA小组的差异也不显著(p=0.623).
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| 图 2 不同病原菌存在条件下厨余处理环境中的pH值变化规律 Fig. 2 pH change during the kitchen waste larval treatment in the presence of pathogens |
本研究中发现, 黑水虻的处理厨余垃圾的过程, 是一个环境pH值先下降后上升、由酸性变碱性的过程, 这一现象与已发表的多项黑水虻养殖环境的研究类似.比如Ma等(2018)将黑水虻饲料的pH值调节到4.0~10.2, 而Meneguz等(2018)将黑水虻饲料的pH值调节到4.0~9.5, 在黑水虻生长的过程中, 环境pH值均未受初始pH值的显著影响, 呈先酸性下降或持平, 再碱性上升的趋势.同时, 在以畜禽粪便为基质的研究中, Erickson等(2004)和Lalander等(2015)也报道了环境pH值是一个逐渐上升的过程, 虽然畜禽粪便的初始环境是一个碱性环境.综合以上报道和本研究可见, 黑水虻处理厨余垃圾、畜禽粪便等有机固体废弃物时, pH值呈现逐渐上升的趋势, 而pH值的上升趋势与程度, 可能显著指示了垃圾处理的进展程度以及虫沙的熟化度或稳定度.另一方面, 黑水虻处理过程的pH值的上升, 可能与垃圾中有机质的快速降解有关.Kim等(2011)报道了黑水虻幼虫有高于家蝇幼虫的消化酶活性, Cickova等(2015)说明了黑水虻是优于绿头苍蝇和麻蝇等昆虫的有机垃圾降解昆虫, 这都与黑水虻具有较强的有机质降解和消化能力有关.在黑水虻处理的早期和中期, 大量有机质快速分解, 产生有机酸, 使得系统呈现酸性, 但随着有机质的进一步降解和有机酸的彻底利用, 系统有机酸减少, 从而碱性增强.本研究中, 黑水虻组和对照组的pH值变化趋势无显著差异, 说明对照组中的环境菌群和黑水虻组的菌群起到了相似的作用, 即垃圾中有机质的快速降解和有机酸的释放, 但在处理的中后期, 黑水虻组呈现了显著高于对照组的pH值, 说明黑水虻组内的有机质还在持续降解并最终达到熟化和稳定, 但对照组中有机质的降解趋于缓慢, 在最终实验结束时, 降解程度显著小于黑水虻组.
对于EC、ST和SA, 3种致病菌的最适生长pH值为7.2~7.6, 酸性环境相比于中性或弱碱性环境, 显然更有利于致病菌的灭活.比较本研究和畜禽粪便研究的差异可以发现, 厨余处理过程的环境酸性高于粪便基质, 这与EC和ST在厨余垃圾中的灭活效力高于粪便基质的现象相紊合.同时, 在另一项弱酸性(pH 5.6)电解水灭活EC、ST、SA的研究发现, 3种病原菌在60 s内, 都呈现了约5.0 log10 CFU·mL-1数量级的下降, 但是三者的下降程度接近, 无显著差异(Issa-Zacharia et al., 2010).这说明, 酸性环境对于EC、ST、SA都存在较大的抑制作用, 但是抑制程度接近.本研究中, 黑水虻大组的EC、ST、SA小组间, pH值差异不显著, 可以推断酸性环境对EC、ST、SA的抑制作用接近, 而黑水虻大组中三者的灭活效力呈现EC=ST>SA的趋势, 说明除了酸性条件以外的其他因素可能对EC、ST、SA的灭活效力差异有显著影响.
3.3 黑水虻体内环境的抑菌因素比较对于黑水虻大组EC、ST、SA小组, 在第9 d收集到的黑水虻样品的抑菌因素分析, 如表 1所示.在抑菌率方面, 横向比较EC、ST、SA小组内匀浆液和过滤匀浆液的差异, EC组内p=0.017, ST组内p=0.014, SA组内p=0.025, 即各小组内匀浆液的抑菌率都显著高于过滤匀浆液; 纵向比较EC、ST、SA小组间的差异, 匀浆液组内p=0.0311, 呈现SA略大于ST率大于EC的趋势, 过滤匀浆液组内p=0.008, 呈现ST>EC>SA的趋势.
| 表 1 黑水虻体内环境的抑菌效能分析 Table 1 The analysis of in vivo antibacterial effects in the black soldier fly larvae |
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虽然此项分析中使用的黑水虻样品仅为第9 d的黑水虻, 但是由于第9 d的黑水虻已经进入幼虫的2~3龄时期, 有较好的体重和大小, 且经过第0和第6 d两轮的病原菌接种, 免疫系统的反应已经基本稳定, 可以较好的反映黑水虻体内的抑菌因素和机理, 所以选用第9 d的黑水虻作为抑菌因素研究的主要对象.实验中的匀浆液, 仅经过匀浆和低速离心处理, 所以为同时含有黑水虻体液免疫蛋白和肠道菌群的溶液.而过滤匀浆液, 经过匀浆、离心和0.22 μm滤膜的过滤处理, 所以只含有黑水虻体液免疫蛋白, 不含有黑水虻肠道菌群.匀浆液的抑菌率显著高于过滤匀浆液, 说明黑水虻肠道菌群对于3种病原菌的灭活有显著促进作用, 过滤匀浆液中, 抑菌率所呈现的ST>EC>SA的趋势, 说明黑水虻对3种病原菌产生的体液免疫蛋白有显著差异, 其中针对于ST的免疫蛋白活性最高, 而针对于SA的免疫蛋白活性最低.而且由于SA过滤匀浆液的抑菌率是负值, 所以黑水虻体内未产生有效的抑制SA的免疫蛋白, 进一步的, 黑水虻对于SA的抑制可能主要依靠体内肠道菌群的竞争性抑制作用, 而非体液免疫.
已有的研究表明, 黑水虻体内的免疫抑菌分子主要是抗菌肽.比如, Choi等(2012)报道了黑水虻的甲醇提取物对于3种革兰氏阴性菌具有显著的抑菌作用, Zdybicka-Barabas等(2016)证明了甲醇提取物中起抑菌作用的主要物质是短链(分子量3.5~6.5 kDa)多肽分子, 即抗菌肽; Park等(2014)纯化到了对于金葡菌和地衣芽孢杆菌(均革兰氏阳性)有显著抗菌能力的抗菌肽DLP4(分子量4.3 kDa), Park等(2017)分离到了对大肠杆菌、Enterobacter aerogenes和Pseudomonas aeruginosa(均革兰氏阴性)有显著抗菌能力的抗菌肽CLP1(分子量4.8 kDa), Choi等(2018)获得了对Klebsiella pneumoniae和Shigella dysenteriae(均革兰氏阴性)有显著抑制作用的抗菌肽分子HP/F8(分子量22 kDa)和HP/F9(分子量20 KDa)等.本研究中, 过滤匀浆液的抑菌效率为ST>EC>SA, 暗示了黑水虻对ST、EC和SA产生抗菌肽的效率为ST>EC>SA, 而这与黑水虻处理过程中3种病原菌的灭活效率ST=EC>SA基本紊合.这一结果也进一步说明, 如果黑水虻对病原菌(如ST和EC)能够产生有效的抗菌肽免疫分子, 则病原菌可能得到快速和彻底的灭活, 但当黑水虻对病原菌(如SA)产生的免疫反应有限, 需要依靠肠道菌群或环境菌群作为主要的抑菌因素时, 病原菌的抑制效率可能下降, 灭活可能不彻底.虽然Park等(2014)报道了黑水虻体内可以产生抑制金葡菌的抗菌肽蛋白DLP4, 但此研究中金葡菌的感染使用了针刺免疫法, 不同于本研究中SA的吞食过程.食入SA没有激活黑水虻的免疫反应, 但针刺方法可以获得SA抗菌肽, 说明了黑水虻对于SA的免疫识别和应答具有特殊机制, 需要在接下来的研究中进一步探讨.最终激活黑水虻对于吞食的SA的免疫应答反应, 可能是促进SA在黑水虻处理过程中, 彻底去除的主要途径.
3.4 黑水虻的生长发育比较在EC、ST和SA存在条件下, 黑水虻的体重和体长均呈逐渐增大的趋势(图 3), 且没有显著性差异(体长p=0.841, 体重p=0.581).其中第0~12 d为快速增长阶段, 第12~18 d保持不变或略有下降.在第12 d, EC组黑水虻平均体长20 mm, 平均体重0.16 g; ST组平均体长18 mm, 平均体重0.17 g; SA组平均体长18 mm, 平均体0.16 g, 3组之间的体长和体重差异不显著.
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| 图 3 不同病原菌存在条件下黑水虻体长和体重的增长变化规律 Fig. 3 The development of larval body length and weight in the presence of pathogens |
本研究中黑水虻幼虫的终点平均体重为0.12~0.16 g与Meneguz等(2018)和Ma等(2018)所报道使用Gainesville饲料的终点体重0.14~0.16 g相近, 说明致病菌的存在并没有抑制黑水虻幼虫的生长与增重.ST组与SA组的黑水虻的体长和体重在处理后期有增长缓慢或下降趋势, 这一现象可能与黑水虻幼虫在12 d后, 活动量减弱, 采食量减少, 逐渐进入预蛹期的生理周期有关, 此结果与代发文等(2017)所报道的幼虫采食速度和增重速度正相关, 采食量减少则增重速度减弱的研究结果相似.3种病原菌存在下黑水虻虫体的生长规律, 呈现初期优先生长体长, 再优先生长体重, 之后体长和体重均衡生长的趋势, 这与马加康等(2016)研究新鲜鸭粪中黑水虻的生长发育规律相同.另一方面, 黑水虻幼虫可能存在发育高峰期, 在对鸭粪的处理中10日龄是日增重的转折点(马加康等, 2016), 而本实验中12 d可能是黑水虻日增重增长的转折点.
3.5 厨余垃圾处理能力的比较黑水虻转化厨余垃圾18 d以后, EC组、ST组和SA组的黑水虻预蛹率分别达到了89.5%、81.3%、96.3%(图 4a), 虽然3组存在显著差异(p =0.004), 但预蛹率均超过了80%.若以18 d预蛹率达到80%计, 本研究中黑水虻达到预蛹的时间与Diener等(2009)报道的16~20 d达到50%预蛹率的结果相似, 与Ma等(2018)报道的20~29 d全部达到预蛹的结果相近, 所以EC、ST和SA未对黑水虻由幼虫转化为预蛹的过程产生影响.
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| 图 4 不同病原菌存在条件下黑水虻处理厨余垃圾的转化效率 Fig. 4 The conversion rate of kitchen waste larval treatment in the presence of pathogens |
在黑水虻产率方面(图 4b), EC组、ST组、SA组分别达到9.5%、10.5%和15.4%, 且存在显著差异(p=0.003), SA组的黑水虻产率最高.在生物转化率方面(图 4c), EC组、ST组、SA组分别达到13.0%、13.2%和19.4%, 同样的, SA组显著高于EC组和ST组(p=0.012).在减量化率方面(图 4d), EC组、ST组、SA组分别达到74.0%、79.1%和78.5%, ST组和SA组显著高于EC组(p=0.018).综合上述研究结果, 在EC、ST和SA存在的条件下, 黑水虻转化厨余垃圾, 可以达到74%~79%的垃圾减量化率, 13%~19%的生物转化率, 以及9%~15%的虫产率, 这与其他研究所报道的以厨余垃圾为底物的黑水虻的转化效率相似, 如李武等(2014)报道黑水虻转化厨余垃圾的减量化率达到50%~60%, 生物转化率达到17%~20%, Diener等(2011)报道的厨余垃圾平均减量化率为68%, Zheng等(2012)报道的平均厨余垃圾减量化率为62%, 虫产率为7%.与上述报道相比较发现, 本研究中EC、ST或SA的存在, 并未影响或降低黑水虻的厨余垃圾转化效率, 即黑水虻在灭活或抑制EC、ST和SA的同时, 完成了对于厨余垃圾的高效转化, 进一步说明了黑水虻处理厨余垃圾是一种具有卫生安全性的高效资源转化方法.
根据厨余干重质量守恒的原理, 计算得出EC组厨余转化为虫沙、虫体、以及代谢消耗的比例分别为16.5%、9.5%、74.0%, ST组转化为虫沙、虫体、代谢的比例分别为21.0%、10.5%、68.7%, SA组转化为虫沙、虫体、代谢的比例分别为21.5%、15.4%、63.1% (图 4e), 可见厨余垃圾的减量化率主要由黑水虻的代谢消耗贡献, 其次为黑水虻虫体. Diener等(2009)在以鸡饲料为基质的研究中发现, 虫沙、虫体和代谢消耗的质量转化比例分别为59%~77%、6%~16%、17%~33%, 江承亮等(2018)也报道了在利用黑水虻处理餐前和餐后厨余垃圾的过程中, 厨余的虫沙、虫体和代谢消耗的质量转化率分别为61.2%、9.5%、29.3%的研究结果.与上述两项研究相比, 本研究的虫体转化率相似, 但虫沙剩余率明显较低, 代谢消耗率则明显较高, 这可能与处理基质的有机质含量、矿物质比例、转化时间有关.本研究中, 黑水虻的处理基质为餐后厨余垃圾, 相对于Diener研究的鸡饲料和江承亮等研究的餐前餐后混合垃圾, 本研究的餐后垃圾的能量与生物可利用性更高, 而在处理时间上本研究为18 d, 较Diener等(2009)的16~20 d处理时间相似, 比江承亮等(2018)的10 d处理时间要长, 所以最终本研究的垃圾代谢消耗比率更大, 虫沙得率则更小.
4 结论(Conclusions)在黑水虻处理含有大肠杆菌O157:H7 (EC)、鼠伤寒沙门氏菌(ST)和金黄色葡萄球菌(SA)的厨余垃圾的过程中, 3种病原菌的灭活效率呈现EC= ST>SA的趋势, 其中EC在4~6 d内被灭活, ST在3~4 d内被灭活, SA在6 d内减少99.99%, 且EC、ST和SA在黑水虻体内无残留.环境微生物和酸性pH值条件(4.0~5.3)对EC、ST和SA的灭活起到了显著的促进作用.黑水虻对于EC和ST能够产生体液免疫分子, 且抑菌活性ST>EC, 但对SA的免疫应答有限, SA在黑水虻体内的灭活主要依赖于肠道菌群的竞争性抑制作用.黑水虻的体长、体重、预蛹率、产率, 以及厨余垃圾的生物转化率和减量化率均不受EC、ST或SA存在的影响.综上, 黑水虻能够在彻底灭活EC、ST, 99%灭活SA的同时, 高效降解厨余垃圾(减量化率>74%), 并转化成为虫体有机质(虫产率>10%), 是一种高效卫生的厨余垃圾资源化方法.今后的研究中, 还需要加强以金葡菌为代表的抗逆性病原菌的灭活机制的探讨.
Andino A, Hanning I. 2015. Salmonella enterica:Survival, colonization, and virulence differences among serovars[J]. The Scientific World Journal, 2015: 16. |
Argudín M Á, Mendoza M C, Rodicio M R. 2010. Food poisoning and staphylococcus aureus enterotoxins[J]. Toxins, 2(7): 1751-1773. DOI:10.3390/toxins2071751 |
Bondari K, Sheppard D C. 1981. Soldier fly larvae as feed in commercial fish production[J]. Aquaculture, 24: 103-109. DOI:10.1016/0044-8486(81)90047-8 |
Bradley S W, Sheppard D C. 1984. House fly oviposition inhibition by larvae ofHermetia illucens, the black soldier fly[J]. Journal of Chemical Ecology, 10(6): 853-859. DOI:10.1007/BF00987968 |
毕少杰, 洪秀杰, 韩晓亮, 等. 2016. 餐厨垃圾处理现状及资源化利用进展[J]. 中国沼气, 34(2): 58-61. |
Chantapakul T, LV R, Wang W, et al. 2019. Manothermosonication:Inactivation of escherichia coli and staphylococcus aureus[J]. Journal of Food Engineering, 246: 16-24. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2018.10.009 |
Choi W H, Yun J H, Chu J P, et al. 2012. Antibacterial effect of extracts of Hermetia illucens(Diptera:Stratiomyidae) larvae against Gram-negative bacteria[J]. Entomological Research, 42(5): 219-226. DOI:10.1111/j.1748-5967.2012.00465.x |
Choi W H, Choi H J, Goo T W, et al. 2018. Novel antibacterial peptides induced by probiotics in Hermetia illucens (Diptera:Stratiomyidae) larvae[J]. Entomological Research, 48(4): 237-247. DOI:10.1111/1748-5967.12259 |
Čičková H, Newton G L, Lacy R C, et al. 2015. The use of fly larvae for organic waste treatment[J]. Waste Management, 35: 68-80. DOI:10.1016/j.wasman.2014.09.026 |
代发文, 葛远凯, 梁伟才, 等. 2017. 黑水虻处理餐厨垃圾浆料的生产性能及其幼虫生长发育规律研究[J]. 养猪, (6): 73-75. |
段妮娜, 董滨, 李江华, 等. 2013. 污泥和餐厨垃圾联合干法中温厌氧消化性能研究[J]. 环境科学, 34(1): 321-327. |
De Smet J, Wynants E, Cos P, et al. 2018. Microbial community dynamics during rearing of black soldier fly larvae (Hermetia illucens) and impact on exploitation potential[J]. Applied and Environmental Microbiology, 84(9): e02722-02717. |
Diener S, Studt Solano N M, Roa Gutiérrez F, et al. 2011. Biological treatment of municipal organic waste using black soldier fly larvae[J]. Waste and Biomass Valorization, 2(4): 357-363. DOI:10.1007/s12649-011-9079-1 |
Diener S, Zurbrügg C, Tockner K. 2009. Conversion of organic material by black soldier fly larvae:establishing optimal feeding rates[J]. Waste Management & Research, 27(6): 603-610. |
Erickson M C, Islam M, Sheppard C, et al. 2004. Reduction of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica Serovar Enteritidis in Chicken Manure by Larvae of the Black Soldier Fly[J]. Journal of Food Protection, 67(4): 685-690. DOI:10.4315/0362-028X-67.4.685 |
Hemdan B A, El-Liethy M A, Elmahdy M E I, et al. 2019. Metagenomics analysis of bacterial structure communities within natural biofilm[J]. Heliyon, 5(8): e02271. DOI:10.1016/j.heliyon.2019.e02271 |
Hermos C R, Janineh M, Han L L, et al. 2011. Shiga toxin-producing Escherichia coli in children:diagnosis and clinical manifestations of O157:H7 and non-O157:H7 infection[J]. J Clin Microbiol, 49(3): 955-959. DOI:10.1128/JCM.02119-10 |
Issa-Zacharia A, Kamitani Y, Tiisekwa A, et al. 2010. In vitro inactivation of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella spp. using slightly acidic electrolyzed water[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 110(3): 308-313. DOI:10.1016/j.jbiosc.2010.03.012 |
Jeon H, Park S, Choi J, et al. 2011. The intestinal bacterial community in the food waste-reducing larvae of hermetia illucens[J]. Current Microbiology, 62(5): 1390-1399. DOI:10.1007/s00284-011-9874-8 |
江承亮. 2018.黑水虻幼虫肠道菌群对餐厨垃圾生物降解的影响机制研究[D].杭州: 浙江大学 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10335-1018206652.htm
|
Kim W, Bae S, Park K, et al. 2011. Biochemical characterization of digestive enzymes in the black soldier fly, Hermetia illucens (Diptera:Stratiomyidae)[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology, 14(1): 11-14. DOI:10.1016/j.aspen.2010.11.003 |
Kotova A L, Kondratskaya S A, Yasutis I M. 1988. Salmonella carrier state and biological characteristics of the infectious agent[J]. Journal of hygiene, epidemiology, microbiology, and immunology, 32(1): 71-78. |
Lalander C H, Fidjeland J, Diener S, et al. 2015. High waste-to-biomass conversion and efficient Salmonella spp. reduction using black soldier fly for waste recycling[J]. Agronomy for Sustainable Development, 35(1): 261-271. |
Liu Q, Tomberlin J K, Brady J A, et al. 2008. Black soldier fly (Diptera:Stratiomyidae) larvae reduce escherichia coli in dairy manure[J]. Environmental Entomology, 37(6): 1525-1530. DOI:10.1603/0046-225X-37.6.1525 |
李武, 郑龙玉, 李庆, 等. 2014. 亮斑扁角水虻转化餐厨剩余物工艺及资源化利用[J]. 化学与生物工程, 31(11): 12-17. DOI:10.3969/j.issn.1672-5425.2014.11.003 |
马加康, 郭浩然, 王立新. 2016. 新鲜鸭粪对黑水虻幼虫生长发育及粪便转化率的影响[J]. 安徽科技学院学报, 30(1): 12-18. DOI:10.3969/j.issn.1673-8772.2016.01.003 |
Ma J, Lei Y, Rehman K U, et al. 2018. Dynamic effects of initial pH of substrate on biological growth and metamorphosis of black soldier fly (Diptera:Stratiomyidae)[J]. Environmental Entomology, 47(1): 159-165. DOI:10.1093/ee/nvx186 |
Meneguz M, Gasco L, Tomberlin J K. 2018. Impact of pH and feeding system on black soldier fly (Hermetia illucens, L; Diptera:Stratiomyidae) larval development[J]. PLOS ONE, 13(8): e0202591. DOI:10.1371/journal.pone.0202591 |
牛颖, 吴传鑫. 2016. 餐厨垃圾处理技术的研究进展[J]. 山东化工, 45(21): 64-65. |
Newton G L, Booram C V, Barker R W, et al. 1977. Dried hermetia illucens larvae meal as a supplement for swine[J]. Journal of Animal Science, 44(3): 395-400. DOI:10.2527/jas1977.443395x |
Nguyen T T, Tomberlin J K, Vanlaerhoven S. 2015. Ability of black soldier fly (Diptera:Stratiomyidae) larvae to recycle food waste[J]. Environ Entomol, 44(2): 406-410. DOI:10.1093/ee/nvv002 |
Ofori I, Maddila S, Lin J, et al. 2018. Ozone initiated inactivation of escherichia coli and staphylococcus aureus in water:Influence of selected organic solvents prevalent in wastewaters[J]. Chemosphere, 206: 43-50. DOI:10.1016/j.chemosphere.2018.04.164 |
Park S I, Chang B S, Yoe S M. 2014. Detection of antimicrobial substances from larvae of the black soldier fly, Hermetia illucens (Diptera:Stratiomyidae)[J]. Entomological Research, 44(2): 58-64. DOI:10.1111/1748-5967.12050 |
Park S I, Yoe S M. 2017. A novel cecropin-like peptide from black soldier fly, Hermetia illucens:Isolation, structural and functional characterization[J]. Entomological Research, 47(2): 115-124. DOI:10.1111/1748-5967.12226 |
Purrello S M, Garau J, Giamarellos E, et al. 2016. Methicillin-resistant staphylococcus aureus infections:A review of the currently available treatment options[J]. Journal of Global Antimicrobial Resistance, 7: 178-186. DOI:10.1016/j.jgar.2016.07.010 |
Sahu N, Sharma G, Chandrashekhar B, et al. 2019. Performance evaluation of methanogenic digester using kitchen waste for validation of optimized hydrolysis conditions for reduction in ammonia accumulation[J]. Renewable Energy, 139: 110-119. DOI:10.1016/j.renene.2019.02.023 |
Sheppard C. 1983. House fly and lesser fly control utilizing the black soldier fly in manure management systems for caged laying hens[J]. Environmental Entomology, 12(5): 1439-1442. DOI:10.1093/ee/12.5.1439 |
Sheppard D C, Tomberlin J K, Joyce J A, et al. 2002. Rearing methods for the black soldier fly (Diptera:Stratiomyidae)[J]. Journal of Medical Entomology, 39(4): 695-698. DOI:10.1603/0022-2585-39.4.695 |
宋宇琨, 何俊. 2019. 4种动物性蛋白质饲料的营养特性及其在畜禽养殖中的应用[J]. 动物营养学报, 31(1): 109-118. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2019.01.015 |
Tomberlin J K, Adler P H, Myers H M. 2009. Development of the black soldier fly (Diptera:Stratiomyidae) in relation to temperature[J]. Environmental Entomology, 38(3): 930-934. DOI:10.1603/022.038.0347 |
Tomberlin J K, Huis A V, Benbow M E, et al. 2015. Protecting the environment through insect farming as a means to produce protein for use as livestock, poultry, and aquaculture feed[J]. Journal of Insects as Food and Feed, 1(4): 307-309. DOI:10.3920/JIFF2015.0098 |
Tomberlin J K, Sheppard D C, Joyce J A. 2002. Selected life-history traits of black soldier flies (Diptera:Stratiomyidae) reared on three artificial diets[J]. Annals of the Entomological Society of America, 95(3): 379-386. DOI:10.1603/0013-8746(2002)095[0379:SLHTOB]2.0.CO;2 |
Wang H, Sangwan N, Li H Y, et al. 2017a. The antibiotic resistome of swine manure is significantly altered by association with the Musca domestica larvae gut microbiome[J]. ISME J, 11(1): 100-111. DOI:10.1038/ismej.2016.103 |
Wang Y S, Shelomi M. 2017b. Review of black soldier fly (Hermetia illucens) as animal feed and human food[J]. Foods, 6(10): 91. DOI:10.3390/foods6100091 |
王攀, 任连海, 甘筱. 2013. 城市餐厨垃圾产生现状调查及影响因素分析[J]. 环境科学与技术, 36(3): 181-185. |
Yang C, Yang M, Yu Q. 2012. An analytical study on the resource recycling potentials of urban and rural domestic waste in China[J]. Procedia Environmental Sciences, 16: 25-33. DOI:10.1016/j.proenv.2012.10.005 |
袁宏林, 马静, 邢保山, 等. 2019. 污泥停留时间对餐厨垃圾与剩余污泥中温厌氧混合发酵系统的影响[J]. 环境科学, 40(2): 994-1002. |
Zdybicka-Barabas A, Bulak P, Polakowski C, et al. 2016. Immune response in the larvae of the black soldier fly Hermetia illucens[J]. Invertebrate Survival Journal, 14(1): 9-17. |
Zheng L, Hou Y, Li W, et al. 2012. Biodiesel production from rice straw and restaurant waste employing black soldier fly assisted by microbes[J]. Energy, 47(1): 225-229. |