2020, Vol. 40
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2. 浙江工业大学环境学院, 杭州 310014
2. College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014
氯苯(Chlorobenzene, CB)是一种重要的化工原料, 广泛应用于染料、制药、农药和有机合成等工业领域(Ralph et al., 2010; 任志远等, 2013; Aparna et al., 2017).氯苯水溶性小、稳定性高、生物毒性大(Tang et al., 2013; Jiang et al., 2017), 并且具有“三致作用”, 对中枢神经具有抑制作用(陈东之等, 2015; Jiang et al., 2019).本研究首次将硅酮母粒作为两相生物反应器中的固态非水相(SNAP)来处理氯苯废气；结果表明该两相体系相较于单相体系, 在1000 mg·m-3的初始进气浓度下, 氯苯的去除率从60%提高到了90%, 同时具有良好的抗冲击负荷能力, 并且发现硅酮母粒的添加使得最大传质分数提升了20%以上(阮静雯等, 2019).然而, 硅酮母粒的加入对两相体系的影响, 尤其是对体系中微生物的影响还尚未见报道.
细胞表面疏水性(Cell-surface Hydrophobicity, CSH)是微生物黏附到各种生物或者非生物的表面以及界面的关键因素之一, 故细胞表面疏水性的变化可直接影响微生物的分布.Rosenberg等(1991)发现细菌表面疏水性能促进微生物黏附于石油表面.王鑫等(2014)发现石油降解菌的细胞表面疏水性变化与石油降解率变化趋势相近, 细胞疏水性达到最高时, 石油降解菌对石油的降解效果也最好.Tribedi等(2014)发现聚丁二酸乙二酯(PES)降解菌AKS2的细胞表面疏水性的增加提高了细菌的粘附能力, 促进了PES的降解.Nguyen等(2011)研究发现弯曲杆菌对非生物表面的附着能力与细胞表面疏水性显著相关.菌体表面胞外多聚物(Extracellular polymeric substances, EPS)的含量、物质组成及结构上的松紧都会影响其亲疏水性.Rathi等(2012)发现次氯酸钠对细菌产生EPS具有抑制作用, 进而降低了细菌的表面粘附能力.
电子传递体系(Electron transport system, ETS)是通过测定微生物的电子传递速率来间接指示微生物的呼吸活性, 进而反映微生物降解有机污染物的能力.Li等(2011)研究发现表面活性剂的加入使细菌表面产生更多的脂多糖, 进而提高了细胞的表面疏水性和ETS活性, 从而促进了疏水性有机污染物的生物降解.
本课题组猜测以硅酮母粒为SNAP的两相体系去除率的显著提高可能是由于硅酮母粒改变了微生物的生长环境, 影响了微生物细胞代谢活性和在反应体系中的分布, 从而有利于氯苯的传质和降解.因此, 本研究从CSH、ETS和EPS来探究硅酮母粒的加入对微生物的影响, 阐述硅酮母粒对氯苯降解的促进作用, 并且对底物耐受性和硅酮母粒的回收利用性进行了考察.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验菌株及培养基组成本实验所选用的硅酮母粒为固体颗粒状, 密度为970 kg·m-3, 球形, 粒径为1.5 mm, 购自杭州和氏璧化工公司.
本实验所选用的菌株是由实验室保藏并以氯苯为唯一碳源的高效降解菌Delftia sp. LW26.
无机盐培养基(g·L-1)：(NH4)2SO4：2.5；Na2HPO4·12H2O：4.5；KH2PO4：1.0；CaCl2：0.023；MgSO4·7H2O：0.2.微量元素母液1 mL·L-1；pH 7.0 ~ 7.5；110 ℃, 灭菌40 min.
所述微量元素母液组成(g·L-1)：ZnSO4：0.10；CoSO4·6H2O：0.02；FeSO4：1.0；MnSO4：0.10；H3BO3：0.014；Na2MoO4·2H2O：0.02.
R2A液体培养基(g·L-1)：酵母粉0.50；胰蛋白胨0.50；葡萄糖0.50；可溶性淀粉0.50；丙酮酸钠0.30；KH2PO4 0.45；MgSO4 0.05；pH 7.2；121 ℃, 灭菌20 min.
2.2 试验方法 2.2.1 氯苯扩散率的测定向250 mL的厌氧瓶加入4.9 g硅酮母粒以及5 μL氯苯, 并用聚四氟乙烯塞密封瓶口, 放置于摇床中振荡, 摇床设置的条件为30 ℃, 160 r·min-1, 并间隔相同的时间测定气相中的氯苯含量, 通过质量平衡计算硅酮母粒捕集的氯苯量.
氯苯在硅酮母粒中的扩散率可以通过以下公式(Montes et al., 2011)进行计算：
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(1) |
式中, Mt为单个硅酮母粒在时间t捕集的氯苯量；M∞为单个硅酮母粒捕集的氯苯总量；De为平均扩散率；
r为平均半径.
α通过以下公式获得：
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(2) |
qn通过以下公式获得：
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(3) |
向若干厌氧瓶中加入4.9 g硅酮母粒、1 mL处于对数生长期的LW26菌液和一定量的无机盐培养基, 使得最后形成的拟均相总体积为50 mL, 随后加入不同浓度的氯苯, 在培养过程中保证pH和温度恒定, 测定氯苯的含量来反映LW26菌对氯苯的利用情况, 并将不加硅酮母粒的无机盐培养基作为对照.
2.2.3 硅酮母粒的回收再利用向250 mL厌氧瓶加入4.85 g硅酮母粒、1 mL培养至对数生长期的LW26菌悬液和一定量的无机盐培养基, 使得最后的拟均相总体积为50 mL, 再加入5 μL氯苯, 密封瓶口, 然后置于摇床中进行振荡培养, 摇床设置的条件为30 ℃, 160 r·min-1.测定氯苯的去除效果, 当瓶中的氯苯去除完全时, 除去菌液, 回收硅酮母粒, 并用去离子水洗涤3次；重新加入回收的硅酮母粒和如上所述的菌悬液与无机盐, 重复上述实验.重复数次, 来考察回收再利用的硅酮母粒是否会对两相体系降解氯苯的效果有影响.
2.2.4 细胞表面疏水性微生物粘着碳氢化合物法(Bacteria adhesion to hydrocarbons, MATH)是表征细菌在油水界面粘附量较为简单可行的方法(Rosenberg, 2006).选用d=10 mm的圆底玻璃试管, 向管中加入4 mL菌悬液, 再加入2 mL硅油作为有机相, 密封后在室温下剧烈振荡60 s, 静置30 min, 分层.用无菌注射针头快速吸取3.0 mL下层水相溶液, 并以磷酸盐缓冲液为空白对照, 在600 nm波长下测定吸光度, 每个实验重复3次；将加入硅酮母粒的实验组记为OD1, 不加硅酮母粒的对照组记为OD0, 按下式计算：
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(4) |
通过测定电子传递链(Electron transport chain, ETS)中脱氢酶活性来表征其电子传递链活性(袁磊等, 2010).ETS活性即每g菌体每min转化碘硝基四唑紫(INT)生成甲臜(INTF)的物质的量.将菌体在6000 r·min-1下离心5 min, 并用磷酸盐缓冲溶液清洗3次.清洗后的菌体用5 mL磷酸盐缓冲溶液重新悬浮, 随后加入100 μL浓度为2.0 mg·L-1的INT溶液, 混匀后于30 ℃恒温水浴30 min, 再加入10 μL甲醛终止反应.在6000 r·min-1下离心10 min后收集菌体以及反应生成的不溶性甲臜(INTF), 再用甲醇萃取INTF, 然后用0.22 μm的特氟龙滤头过滤萃取液, 滤液在490 nm的吸光度下测其吸光度, 滤头在60 ℃干燥箱中烘干至恒重, 滤头烘干前后的质量差即为菌体质量.以无菌的反应液作为空白对照, 并设置3个平行样.
2.2.6 胞外聚合物测定本实验采用超声波法(王淑莹等, 2016)提取菌液中的胞外聚合物(Extracellular polymeric substances, EPS).将菌液在6000 r·min-1、4 ℃的条件下离心5 min, 收集到的菌体用磷酸盐缓冲溶液清洗3次并重悬, 重悬后的菌悬液体积为15 mL.在20 kHz、40 W、4 ℃条件下将菌悬液超声10 min.然后在15000 r·min-1的条件下离心30 min, 上清液经0.45 μm的滤膜过滤得到EPS.EPS中多糖含量采用苯酚-硫酸法(陈琪等, 2016)测定；EPS中蛋白质含量采用福林酚法(贾学斌等, 2018)测定.
2.3 分析方法采用气相色谱仪(Agilent 6890, 美国)测定气相中的氯苯浓度.色谱柱为HP-Innowax型毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm), 柱温为100 ℃, 检测器为FID检测器, 汽化室和检测器的温度分别为200、200和180 ℃；氮气为载气, 进样量为800 μL；柱流量为1 mL·min-1；分流比为30:1.
采用液相色谱仪(Agilent Technologies 1200 Se-ries, 美国)测定水相中的氯苯浓度.色谱柱选用Eclipse XDB-C18反相柱(4.6 mm×150 mm×5 μm), 柱温为25 ℃, 检测器为紫外检测器, 检测波长为200 nm；流动相为V(甲醇)/V(水)=7:3的混合溶液；流速为1.5 mL·min-1；进样量为20 μL.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 氯苯扩散系数NAP对疏水性化合物的捕集能力是选择NAP的一个重要标准, 即NAP可以在氯苯浓度过高时能迅速捕集氯苯, 避免液相中的LW26因氯苯浓度过高而丧失生物活性, 从而不影响微生物正常的新陈代谢.
如图 1所示, 氯苯在1 h内已在SNAP/气相间达到了平衡, 70%以上的氯苯可被硅酮母粒捕集.经计算, 氯苯在硅酮母粒中的扩散系数为5.3×10-5 cm2·s-1.
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| 图 1 氯苯在SNAP和气相间的平衡 Fig. 1 CB normalized concentration profile in absorption test with silicone masterbatch |
实验中比较了在单相和两相体系中加入不同初始浓度的氯苯, LW26菌对氯苯的去除情况.从图 2可明显看出两相体系处理效果优于单相体系.当氯苯初始浓度为1~3 mmol·L-1时, 单项体系和两相分配体系均能在30 h内将氯苯全部降解, 但是后者的降解速率要高于前者；当氯苯浓度在4~8 mmol·L-1时, 虽然两相分配体系的降解时间有所延长, 且在7~8 mmol·L-1时只能降解部分氯苯, 但仍能保持较好的降解效果, 而在单相体系中, 氯苯浓度大于5 mmol·L-1时, 氯苯的含量已无下降的趋势, 说明LW26菌已基本失活.
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| 图 2 不同初始底物浓度下单相(a)和两相分配(b)反应体系中LW26菌体耐受性 Fig. 2 Substrate tolerance of strain LW26 in one-phase (a) and two-phase partitioning (b) systems |
加入的氯苯有部分被两相体系中的硅酮母粒捕集, 这降低了液相中的氯苯浓度, 使得在初始氯苯浓度较高的体系中的LW26菌仍保持良好的生物降解活性, 从而间接提升了菌体的底物耐受性.
3.3 硅酮母粒的回收再利用在两相体系中, 相较于硅油等液态NAP, 可回收利用是SNAP的一大优势, 因此本实验考察了循环使用过程中的硅酮母粒是否仍保持原先强化反应器去除氯苯废气的效果.在硅酮母粒5次再回收利用过程中, 氯苯的去除情况如图 3所示, 两相体系在1 d内对氯苯的去除率均在99%以上, 这说明回收再利用的硅酮母粒仍旧保持原先的良好性能, 并未对两相体系去除氯苯废气有太大的影响.
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| 图 3 硅酮母粒回收利用5次的氯苯去除情况 Fig. 3 CB removal performance of recycling of silicone masterbatch for 5 times |
细胞表面疏水性是微生物黏附到各种生物或者非生物的表面以及界面的关键的因素之一, 同时也是影响微生物吸收疏水性有机污染物的重要因素之一.但是细胞的表面疏水性很强的变异性, 且容易受到生长环境的影响, Antonio等(2017)研究发现环境因子(pH、温度、菊粉)的改变对细胞表面疏水性有不同程度的影响.两相分配反应体系中NAP的加入改变了微生物的生长环境条件, 因此细胞表面疏水性很可能发生变化, 从而影响细菌在体系中的分布, 最终影响氯苯的去除效果.在Neumann等(2006)构建的两相分配体系中发现, 将10%(V/V)1-癸醇作为有机相, 菌株P. putida的细胞表面疏水性提高了3倍.但并不是所有的有机相加入都会改变细胞的表面疏水性.在Hernández等(2011)构建的两相分配体系中, 硅油的加入对正己烷降解菌P. putida的细胞表面疏水性并没有影响.
因此, 实验探究了不同比例(0、5%、10%、15%、20%、25%)的硅酮母粒对菌株LW26细胞表面疏水性的影响, 结果如图 4所示.菌株LW26的细胞表面疏水性总体随硅酮母粒比例的增加而增加, 且在20%时达到最大值.LW26菌体的细胞表面疏水性提高, 使得菌体更趋向于粘附在固/液界面, 缩短了氯苯从气相到生物相的传质路径, 提升了传质效率.
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| 图 4 硅酮母粒对菌株LW26细胞表面疏水性的影响 Fig. 4 Effect of silicon masterbatch on CSH of strain LW26 |
ETS可通过测定微生物的电子传递速率来间接指示微生物的呼吸活性, 进而反映微生物降解有机污染物的能力.实验结果如图 5所示, 随着初始氯苯浓度的升高, 单相和双相体系中菌株ETS活性均有下降的趋势, 但是两相体系中的菌株的ETS活性始终高于单相体系, 并且随着初始氯苯浓度的升高变化幅度较小.当初始氯苯浓度为1 mmol·L-1时, 单相体系和两相体系中微生物的ETS活性均可以达到较高水平(约400 mg·g-1·h-1), 但是当氯苯初始浓度增加到10 mmol·L-1时, 单相体系中已基本检测不到ETS活性；但在两相体系中仍能达到112 mg·g-1·h-1.表明在两相体系中在水-固-液三相之间存在底物的动态平衡, 硅酮母粒的加入起到了“储藏室”的作用, 使得两相体系中的氯苯浓度维持在一定的浓度范围内, 让降解菌在不受底物抑制的情况下始终保持良好的降解性能, 从而保证了两相体系的稳定高效运行.
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| 图 5 硅酮母粒的添加对菌株ETS活性的影响 Fig. 5 Effect of silicon masterbatch on ETS activities during CB biodegradation |
胞外聚合物的主要成分是多糖、蛋白质和核酸等高分子聚合物(史龙月等, 2013).在有毒环境下, 微生物细胞会产生更多的EPS来保护自身, 减少环境的影响.Laspidou等(2002)指出微生物EPS中的蛋白质含有更多的疏水键以及氨基酸, 蛋白质含量会影响细胞表面疏水性.邵尤炼等(2014)研究发现污泥细胞表面疏水性随着EPS中蛋白质和多糖的比值的增大而增大.因此, 本实验检测了两相体系和单相体系中的EPS总量和各组分含量, 结果如表 1所示.
| 表 1 单相体系和两相分配体系中EPS的比较 Table 1 EPS in one-phase and two-phase partitioning systems |
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两相分配体系中的胞外聚合物总量为(38.2 ± 5.5) mg·g-1, 是单相体系中的1.09倍, 并且EPS中的蛋白质含量增多, 多糖含量减少, 蛋白质和多糖的比值是单相体系的2.34倍.这说明硅酮母粒的加入确实对两相体系中EPS的产生有一定的影响, 尤其是EPS中的蛋白质含量较单相体系有了明显的增加, 这一定程度上增强了细胞疏水性, 使得菌体更趋向吸附在固/液界面, 缩短了氯苯的传质路径, 提高了传质效率, 从而提升了氯苯的净化效果.
4 结论(Conclusions)1) 探究了硅酮母粒存在下氯苯的扩散系数, 结果表明1 h以内氯苯就在硅酮母粒相/气相间达到平衡, 70%以上的氯苯可被硅酮母粒捕集.
2) 两相分配体系中加入硅酮母粒可以提高菌体的底物耐受性, 起到“储藏室”的作用.
3) 硅酮母粒可以回收再利用, 5次回收再利用后两相体系对氯苯的去除效率仍在99%以上.
4) 将硅酮母粒作为两相体系的NAP, LW26菌株的细胞表面疏水性随硅酮母粒比例的增加有所提高, 微生物ETS活性变化对氯苯初始浓度的提高起伏较小, 两相体系较单相体系细胞EPS产量增加, 且EPS中蛋白质与多糖的比值是单相体系的2.34倍.
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