1 引言(Introduction)

近年来, 随着我国机动车产量和使用量的不断增加, 汽车尾气排放已成为空气污染物的主要来源, 有研究表明机动车尾气排放是对北京空气中PM₁贡献最大的源, 其贡献率按照春夏秋冬依次为30.7%、33.3%、32.1%、29.8%(樊啸辰, 2018).纽约市空气中PM_2.5的源解析表明, 其空气中16%~39%的PM_2.5来源于交通源, 同时2016年监测数据表明美国约有1.7万人因移动污染源(包括所有机车、飞机、船舶等)排放的PM_2.5而死亡(Ito et al., 2004; Lall et al., 2006; Kheirbek et al., 2016), 表明汽车尾气颗粒物会对人类健康产生严重危害.另有研究发现降水可以降低空气中PM_2.5与PM₁₀等颗粒物的浓度(于彩霞等, 2018), 表明空气中的颗粒物可以通过降水淋洗或降水溶解等作用进入水环境中, 因此, 进入空气中的汽车尾气颗粒物可通过降水等作用进入水环境并对水生生物产生影响.有学者开展了汽车尾气颗粒物对水生生物的毒性效应研究, 如Chang等通过石英过滤器采集尾气颗粒物, 用二氯甲烷浸提后配置成一系列不同浓度的培养液, 开展其对大肠杆菌(Escherichia coli)的毒性研究, 发现四冲程发动机尾气颗粒物的毒性远低于二冲程发动机尾气颗粒物的毒性(Chang et al., 2008)；Vouitsis等用滤膜采集汽油车和柴油车尾气颗粒物, 通过二氯甲烷进行提取, 对发光菌(Photobacterium phosphoreum)进行毒性试验, 发现两种车型的尾气颗粒物均对发光菌活性产生强烈的抑制作用(Vouitsis et al., 2009).上述研究表明研究者们应关注汽车尾气颗粒物对水生态系统中水生生物的毒性效应.

发光菌试验常被用于生态毒性监测(Girotti et al., 2008; Xu et al., 2014; Kratasyuk et al., 2015), 在生物技术、医学、生态监测等方面也得到广泛应用(Esimbekova et al., 2014; Kratasyuk et al., 2015).与草履虫、藻类、鱼类、溞类等其他水生生物相比, 发光菌的测试速度更快、更敏感, 污染物的生态毒性通常可以在15 min内通过发光菌试验检测(Kaci et al., 2005; Medvedeva et al., 2009), 由于发光菌的发光强度与细菌呼吸、生长、代谢等生理过程有关, 这些生理过程对毒性比较敏感, 因此发光菌发光度可以用来评价污染物的毒性大小(Kaskova et al., 2016).有少量学者开展了大气中PM_2.5(Jing et al., 2019)、汽车尾气颗粒物(Vouitsis et al., 2009)对发光菌(P. phosphoreum)的毒性效应研究, 表明发光菌可被用于颗粒物生态毒性效应的测试.

为了加强对机动车的污染排放管理工作, 改善环境空气质量, 我国不断完善国内的汽车尾气排放标准, 在2016年12月23日发布了《轻型汽车污染物排放限值及测量方法(中国第六阶段)》(GB 18352.6—2016), 即国六标准, 并规定于2020年7月1日, 所有的销售和注册登记的轻型汽车均应符合国六标准.国六标准实施后, 尚未发现国五和国六两类汽车尾气颗粒物生态毒性及化学成分综合比较的研究报道, 本文以国五与国六两类汽车为研究对象, 进行尾气颗粒物的排放情况与尾气颗粒物的化学成分分析, 此外, 选取明亮发光杆菌(P. phosphoreum)为受试生物, 进行两类汽车尾气颗粒物对发光菌的生态毒性分析, 通过化学成分与生态毒性分析结果, 为进一步探索和完善我国汽车尾气排放标准提供技术支持.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 汽车尾气颗粒物的采集

本文对国五和国六两类汽车进行汽车尾气颗粒物的采集, 采样车辆为企业提供测试的新产车辆, 发动机均为直喷式发动机, 排量为1.4 T, 两类汽车采用相同的汽油.其中国五汽车采样执行国五标准规定的NEDC(New European Driving Cycle)工况(环境保护部等, 2013), 该工况包括市区循环与市郊循环两部分, 市区循环包括4个重复单元, 每个单元平均车速为19 km·h^-1, 行驶时间为195 s；市郊循环平均车速为62.6 km·h^-1, 行驶时间为400 s.国六汽车采样执行国六标准规定的WLTC(Worldwide Light-duty Test Cycle)工况(环境保护部等, 2016), 该工况由低速段、中速段、高速段和超高速段4部分组成, 持续时间共1800 s.颗粒物采集采用CVS全流稀释系统进行排气稀释.滤膜采用pall 7221滤膜, 该滤膜直径为47 mm, 由玻璃纤维与PTFE材质复合组成, 该滤膜对0.3 μm以上空气中颗粒物捕集效率大于99.95%.

2.2 样品的制备

样品用于化学成分和生态毒性的制备方法均采用索氏提取, 将采集的滤膜用剪刀剪碎放入索氏提取筒中, 用200 mL二氯甲烷提取24 h, 保证二氯甲烷以恒定速率蒸发, 回流速度控制在每小时4~6次, 提取完毕后, 提取液用氮吹浓缩仪进行浓缩, 浓缩条件为：气压：1.5 PSI, 浓缩温度：30 min, 针追随速度：1.0 mm·min^-1, 浓缩至1 mL.用于化学成分分析的将浓缩液转换溶剂为正己烷, 移入进样瓶中, 用气相-质谱联用仪(GC-MS)进行化学成分分析；用于生态毒性分析的将浓缩液转换溶剂为二甲亚砜, 移入10 mL容量瓶中, 加少许去离子水多次润洗浸提物并移入容量瓶中, 最后用去离子水进行定容.

2.3 汽车尾气颗粒物的化学成分分析

汽车尾气颗粒的化学成分分析采用气相-质谱联用仪(GC-MS)进行分析, 用NIST标准谱库进行定性分析, 用内标法对其进行定量分析, GC-MS条件设置为：进样口温度：280 ℃, 离子源温度：230 ℃, 四级杆温度：150 ℃, 色谱温度为35 ℃保持4 min, 以25 ℃·min^-1升温至105 ℃, 以5 ℃升温至310 ℃, 保持0.2 min, 不分流进样, 扫描方式采用SIM扫描.

2.4 汽车尾气颗粒物的毒性测定

发光菌毒性试验依据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(国家环境保护局, 1995).将提取液按表 1所示倍数用3 g/100 mL的氯化钠进行稀释, 稀释倍数与稀释浓度如表 1所示, 稀释完毕后取各个浓度样品2 mL于测试管中, 每个浓度样品设置3个平行和一个CK管, CK管中加入2 mL的3 g/100 mL的氯化钠溶液, 设置CK管的目的是测试发光菌在溶剂中的发光度, 消除溶剂对发光菌的影响.从冰箱2~5 ℃室取出含有0.5 g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和氯化钠溶液, 用0.5 mL移液枪吸取0.5 mL冷的2 g/100 mL的氯化钠溶液注入已开口的冻干粉安瓿瓶中, 充分摇动使其充分混匀, 放入2~5 ℃冰箱内复苏约0.5 h, 同时提前打开生物发光计, 预热15 min, 调零备用.取一空测试管加入2 mL的3 g/100 mL的氯化钠溶液, 加入复苏0.5 h的发光菌液10 μL, 盖上瓶塞, 上下颠倒5次, 立即放入生物发光计内测量, 若发光量立即显示600 mV以上, 则此瓶冻干粉可用于测试, 否则将倍率调制“X2”挡, 大于600 mV即可使用.分别向各样品管和测试管加入10 μL发光菌复苏液, 记录每个样品管和测试管的加液时间(精确至秒), 15 min后进行发光量测定.

3 结果与讨论(Results and discussion)

我国汽车尾气排放标准从国一到国五一直沿用欧系标准, 由于环境污染的日趋严重以及我国大城市的实际路况与欧洲工况存在一定差异(张鹏宇, 2016), 我国颁布了更为严格的国六标准.国六标准实施后, 尚未发现国五和国六汽车尾气颗粒物生态毒性及比较的研究报道；目前关于汽车尾气颗粒物的研究大多是关于汽车尾气颗粒物化学成分或毒性的单一研究(zhang et al., 2018; Liu et al., 2019), 尚未发现关于汽车尾气化学成分与生态毒性综合分析的研究报道.现有研究多关注汽车尾气颗粒物对人体健康和哺乳动物的毒性研究, 鉴于生物是生态环境的重要组成部分, 是反应生态环境质量好坏的重要指标之一, 十九大以来, 我国进一步强调了人与自然和谐共生的生态文明观, 因此, 我们也应关注汽车尾气颗粒物对生态环境中生物的影响.基于此, 本文选取国五和国六两种类型的试验车辆, 开展其化学成分和生态毒性的综合分析.

3.1 国五和国六汽车尾气颗粒物排放比较

本研究使用滤膜分别对国五和国六汽车尾气颗粒物进行采集, 国五和国六汽车尾气颗粒物的排放情况如图 1所示.采用SPSS软件对国五与国六两类汽车的尾气颗粒物浓度进行正态性检验, 根据本研究样本量与正态性检验区分标准(罗文海等, 2018), 本文采用Shapiro-Wilk检验结果, 国五与国六两类汽车的尾气颗粒物质量均不符合正态分布(p < 0.05).因此, 本文采用Mann-Whitney U(Nachar, 2008)检验进行均值比较, 结果表明国五与国六两类汽车尾气颗粒物排放存在显著差异(p=0.006 < 0.01).国五与国六两类汽车排放的尾气颗粒物质量浓度分别为(8.81±2.92)和(1.51±0.35) mg·km^-1, 表明行驶单位距离国六汽车排放的尾气颗粒物质量远远小于国五汽车, 有研究指出机动车尾气排放是城区站点与城市背景站点PM_2.5的主要来源, 分别占22.7%和22%(李妙玲, 2018), 于娜等报道北京市细粒子(OC)的主要来源为柴油车排放(15.3%)、汽油车排放(20.5%)(于娜等, 2009).因此, 国六标准的实施将对我国环境空气质量的改善起到重要支撑作用.

3.2 国五与国六汽车尾气颗粒物的化学成分

本文对汽车尾气颗粒物进行了包括氯代烃类、邻苯二甲酸酯类、亚硝胺类、醚类、苯胺类、硝基芳香烃类、硝基酚类、苯酚类、多环芳烃类等SVOCs的分析(表 2).结果表明尾气颗粒物中含量最高的为多环芳烃类物质, 这与Pham等(2013)的研究相符, 其次为苯酚类、苯胺类、硝基芳香烃类, 结果如图 2所示.与国五汽车尾气颗粒物的化学物质含量相比, 国六汽车尾气颗粒物中的多环芳烃类(苯并[k]荧蒽、苯并[b]荧蒽、芴除外)物质含量低19.6%~57.8%；苯并[b]荧蒽、苯酚类、苯胺类、硝基芳香烃类含量高29.4%~60.5%.

表 3为本文与国外研究(Vouitsis et al., 2009)的NEDC循环工况汽车尾气颗粒物多环芳烃的含量对比, 表明本研究的汽车尾气颗粒物中主要多环芳烃的含量与文献报道相近, 其中菲的含量相差较大, 分析其原因可能与汽油型号、发动机磨损状态等有关(瞿芳等, 2016).袁佳雯(2016)对20种汽油车排气管烟尘中多环芳烃含量进行分析, 发现其多环芳烃总量含量为79.4 ~3341.5 μg·g^-1, 与本研究(国五：237.4 μg·g^-1, 国六：159.8 μg·g^-1)较为一致.

3.3 国五与国六汽车尾气颗粒物的生态毒性

本文研究了汽车尾气颗粒物对发光菌急性毒性效应, 试验结果如图 3所示.汽车尾气颗粒物对发光菌的毒性效应采用对数方程(y=a-b×lnx)进行拟合, 国五货车、国五轿车与国六汽车尾气颗粒物对发光菌的剂量-效应方程分别为y=1.45-0.24×ln(x+10.37)、y=1.54-0.27×ln(x+5.09)和y=0.94-0.27×ln(x-0.27), 3条剂量-效应曲线的相关系数r值均高于0.9.由剂量-效应方程可计算出国五货车、国五轿车和国六汽车尾气颗粒物对发光菌的EC₅₀分别为42.00、41.99和5.37 mg·L^-1.以单位质量的尾气颗粒物对发光菌的毒性进行比较, 国五货车与国五轿车尾气颗粒物对发光菌的毒性效应无明显差异, 国六汽车尾气颗粒物对发光菌的毒性高于国五汽车.

本文的试验结果与汞、砷和汽车尾气颗粒物中主要的化学物质(多环芳烃、硝基苯、邻硝基苯胺)对发光菌的毒性数据进行了对比分析(表 4).表明：国五汽车尾气颗粒物对发光菌的毒性低于汞、砷、多环芳烃的毒性；国六汽车尾气颗粒物的毒性低于汞、部分多环芳烃(菲、、苯并[a]蒽)的毒性, 与砷的毒性相当.汞被联合国列为危及人类健康和环境的十大化学品之一(张群芳, 2018), 无机砷毒性强且易在生物体累积(曾晨, 2018), 因此本文分别选取二价汞和五价砷为标准参考物质, 分别设其毒性当量因子(TEF)为1, 汽车尾气颗粒物及汽车尾气颗粒物中主要化学物质的毒性当量因子如表 4所示.根据毒性分级标准(国家环境保护局, 1990)(EC₅₀ < 1 mg·L^-1, 高毒性；1~10 mg·L^-1, 中等毒性；>10 mg·L^-1, 低毒性)可知国五汽车和国六汽车对发光菌的急性毒性分别属于低毒性和中等毒性.

3.4 国五和国六汽车尾气颗粒物毒性差异分析

汽车尾气颗粒物中含有无机物、有机物等各种各样的化学物质, 化学物质成分的差异和物质间联合毒性效应的差异, 均可能对国五和国六汽车尾气颗粒物对发光菌的毒性效应产生影响, 如：①有学者发现蒽与苯并[a]芘、蒽与1, 2-苯并蒽、蒽, 苯并[a]芘与1, 2-苯并蒽进行等浓度混合时对绿藻的的联合作用均为拮抗作用(黄健等, 2003)；王照华等发现蒽与苯并芘进行等浓度混合对米氏凯伦藻的联合毒性为拮抗作用(王照华等, 2014).另有学者研究硝基苯及其降解产物对发光菌的联合急性毒性, 发现硝基苯与邻、间、对硝基苯酚的联合作用为部分相加或协同作用(朱骏等, 2010).唐柱云等发现苯酚与二苯胺及苯酚与苯胺混合时的联合毒性主要表现为协同作用(唐柱云等, 2014).基于此推测国六汽车比国五汽车毒性高的原因可能是多环芳烃之间存在拮抗作用, 而硝基苯、邻硝基苯胺、苯酚类之间存在相加或协同作用.②有研究指出汽车尾气颗粒物中含有烷烃、有机酸、多环芳烃、酚类、芳香酮等有机物(袁佳雯, 2016)；有研究发现芳香烃和烷烃是轻型汽油车排放的主要VOCs成分, 分别占43.38%和39.62%(乔月珍等, 2012).另有学者指出柴油机尾气颗粒物除了多环芳烃外, 还含有脂肪烃和极性化合物, 具有较强的致突变性(叶舜华等, 1995).有文献指出汽车尾气颗粒物中含有一定量的重金属(许晓辉, 2002), 如Hg(Ozaki et al., 2004)、Pb(Mortada et al., 2001)等；有研究发现土壤中重金属的含量受交通量的影响较大, 且随着与道路距离的增加, 土壤中重金属的含量显著降低(Mafuyai et al., 2015), 表明汽车尾气颗粒物中含有一定的重金属.有研究发现Hg和Pb对发光菌具有一定的毒性效应(Wang et al., 2014; Rosado et al., 2016).因此, 国五和国六汽车尾气颗粒物的毒性差异也可能与本研究检测的SVOCs以外的其他化学成分有关, 如：烷烃类、脂肪烃类、重金属等.③另有研究比较了不同粒径汽车尾气颗粒物对人肺癌上皮细胞A549的毒性作用, 发现PM_0.18~1.00的毒性强于PM_1.00~3.20, 而PM_0.56~1.00的毒性又强于PM_0.18~0.56(徐雯等, 2013).由于车况与工况的不同, 国五和国六汽车排放的颗粒物粒径应存在差别, 因此, 国五和国六汽车尾气颗粒物的毒性差异也可能与其颗粒物粒径的不同有关.

此外, 汽车尾气颗粒物对发光菌的毒性差异可能主要是由循环工况的差异引起的.WLTC循环工况在最大车速、最大加速度和最大减速度均大于NEDC循环工况, 有学者研究机动车油耗及污染物排放情况与行驶过程车速和加速度的关系, 发现机动车油耗与排放基本随加速度增加而上升, 车速越快, 上升幅度越大(黄成等, 2007).另有研究发现高速段WLTC工况下THC、CO、NO_x、CH₄和CO₂的排放占比均大于NEDC工况占比, 高速与加速段会引起油耗与污染物排放的增加(郑从兴等, 2016).由此推测国六和国五汽车对发光菌的毒性差异可能主要是由WLTC超高速工况排放的污染物引起的.

3.5 不确定性分析

本文选用发光菌为受试生物, 发光菌作为受试生物虽然有众多优点, 同时也有一些局限性, 如：发光菌的pH适应范围较窄(朱丽娜等, 2011)；同时研究结果是本次各类研究车辆的测试结果.要使结果更具有代表性, 今后还需开展更多代表性生物物种(包括水生生物、土壤生物等)的生态毒理学验证试验, 同时还需开展更多不同国五、国六车型的验证试验.本文对尾气颗粒物的化学成分与毒性之间做了定性分析, 今后还应继续开展定量分析研究, 如通过主成分分析得出每种化学物质对其毒性的贡献率.

4 结论(Conclusions)

1) 国五和国六汽车的尾气颗粒物排放浓度分别为(8.81±2.92)和(1.51±0.35) mg·km^-1, 用Mann-Whitney U检验发现国六汽车的颗粒物排放浓度显著低于国五汽车.

2) 本次研究的国五货车、国五轿车和国六汽车的尾气颗粒物对发光菌的EC₅₀分别为42.00、41.99和5.37 mg·L^-1, 以单位质量尾气颗粒物进行比较, 国六汽车对发光菌的毒性明显大于国五汽车, 根据毒性分级标准, 国五和国六汽车对发光菌的急性毒性分别属于低毒性和中等毒性.

3) 在检出的64种SVOCs, 多环芳烃是国五与国六两类汽车中主要的化学成分, 其次是邻硝基苯胺、硝基苯与苯酚类等物质.今后, 应加强国六汽车尾气和尾气颗粒物的生态毒性研究.