1 引言(Introduction)

纳米CuO颗粒(CuO NP)由于具有良好的催化活性、热传导电性和抗菌性能(王淑玲等, 2014), 目前已广泛应用于气体传感器、医药杀菌、光伏电池和新型催化剂等与人们生活息息相关的行业中(Aruoja et al., 2009).随着CuO NP的大量生产和使用, 其不可避免的会释放到环境水体中, 并因独特的物理化学特性成为潜在的污染物(刘振宇等, 2015).因此, 研究CuO NP的环境转化归趋行为及生态毒性效应具有重要意义.

环境水体介质具有复杂性, 而CuO NP具有高反应活性, 当CuO NP排放到环境水体后, 不可避免的会发生物理化学转化过程, 从而改变其在水体中的环境赋存形态及生态毒性(Otero-González et al., 2014; 李旭光等, 2017).已有研究表明, CuO NP的溶解性受水化学条件(天然有机质、盐离子等)影响(Wang et al., 2013; Grillo et al., 2015).盐离子的存在能够诱导纳米颗粒发生聚集(Keller et al., 2010), 溶解性有机质(DOM)可通过静电吸附、配位体交换、疏水等作用吸附到CuO NP上, 形成纳米级的包被, 导致表面理化性质发生变化, 如增加表面电负性和空间位阻, 从而改变悬浮液的分散性、稳定性和吸附能力(Liu et al., 2008; Yang et al., 2009).CuO NP在中性超纯水中由于颗粒表面带正电荷, 易发生团聚, 导致悬浮液稳定性低；腐殖酸(HA)的加入可显著减弱CuO NP的团聚, 减小其水动力学半径, 增强电负性和悬浮液稳定性, 促进Cu²⁺的释放(Shi et al., 2014; Peng et al., 2015).还有研究发现, 纳米氧化铜对白菜(Brassica pekinensis)根和芽的伸长具有明显的抑制作用(向垒等, 2011).纳米氧化铜悬浮液培养后的玉米(Zea mays)幼苗叶片明显发黄, 须根减少, 根伸长被抑制, 且抑制作用随浓度的增加而增强, 同时, CuO NP还可以被玉米根部吸收, 并向地上部运输(Wang et al., 2012).

尽管如此, 目前对CuO NP环境归趋行为、生物毒性等方面仍缺乏系统研究.相关的研究主要集中在腐殖酸(SRHA)对CuO NP环境转化行为的影响上, 有关水体中普遍存在的盐离子对其溶解行为的影响却鲜见报道, 进而导致对CuO NP的环境暴露风险评估缺乏有效认识.考虑到酸根离子可以络合CuO NP表面暴露的Cu原子, 进而诱导CuO NP释放Cu²⁺, 故本研究选择酸根离子作为出发点考察其对CuO NP环境转化行为的影响, 进而评估环境转化过程对其环境暴露风险的影响.基于此, 本研究选取自然水环境中最典型存在的酸根离子, 如Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、HCO₃^-、PO₄^3-、CO₃^2-、H₂PO₄^-、HPO₄^2-等, 系统研究酸根离子和腐殖酸对CuO NP在水体环境中稳定性与溶解性的影响, 进而以大型溞为模式生物, 评估CuO NP在环境水体中转化后的毒性效应和环境暴露风险.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 主要材料

实验使用的CuO NP购置于美国Sigma-Aldrich公司, 平均粒径小于50 nm.腐殖酸标准样品购自国际腐殖酸协会, 来源于Suwannee河.氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、碳酸氢钠和磷酸钠均为分析纯(AR).本实验所使用的高纯水(电阻率>18 MΩ · cm)由Millipore Milli-Q(Bedford, MA, USA)净化系统处理所得.

2.2 CuO NP在水体中的转化

CuO NP悬浮液(20 mg · L^-1)通过在室温下将5 mg CuO NP加入到250 mL高纯水中制备, 溶液pH稳定在6.4左右.溶液配制后, 迅速放到25 ℃恒温培养箱中振荡, 振荡速率为150 r · min^-1.振荡6、12、24、36、48、60、70 h后取4 mL样品在13000 r · min^-1下离心15 min, 取上清液通过电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定水体中Cu²⁺浓度.

为考察典型环境共存离子对CuO NP在水体中转化过程的影响, 配制0.1 mol · L^-1的NaCl、NaNO₃、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₃PO₄、Na₂CO₃、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄储备溶液, 将不同酸根离子溶液加入到CuO NP悬浮溶液中, 使酸根离子在悬浮液中的最终浓度均为1 mmol · L^-1, 振荡不同时间后, 离心取上清液通过ICP-MS测定水体中Cu²⁺浓度.为考察腐殖酸对CuO NP在水体中转化过程的影响, 首先称取0.05 g腐殖酸加入到50 mL高纯水中, 配置成1 g · L^-1的SRHA储备液, 每次使用前搅拌30 min使其分散均匀, 然后加入到CuO NP悬浮液中, 使其在最终水体中的浓度分别为0、1、2、5、10 mg · L^-1, 采用同样方法测定水体中Cu²⁺浓度.考察腐殖酸和酸根离子共存对CuO NP转化过程的影响时, 酸根离子在悬浮液中的浓度均为1 mmol · L^-1, SRHA在悬浮液中的浓度均为5 mg · L^-1, 水体中Cu²⁺浓度测定采用上述同样方法.

2.3 CuO NP的表征

CuO NP在转化过程中的水动力学直径和Zeta电位采用Malvern Zetasizer Nano ZS动态光散射仪(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)进行测量.CuO NP在水体中孵化不同时间后水体中的Cu²⁺浓度采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, Agilent-7500a, USA)进行测定.CuO NP在转化过程中的形貌结构变化通过透射电子显微镜(TEM, JEM-2100F, Japan)进行表征；CuO NP在转化过程中表面官能团的结构变化通过傅里叶变换红外光谱仪(Jasco, FT/IR-6100, Japan)进行分析, 制样方法采用溴化钾(KBr)压片法.利用X射线粉末衍射(XRD, X′Pert PRO MPD, Netherlands)对CuO NP在转化过程中的晶型结构进行表征.

2.4 CuO NP环境转化对大型溞的毒性效应

大型溞培养过程采用英国伯明翰大学制订的大型溞培养标准(Standard Operating Procedure (SOP) for culturing Daphnia magna, 2017, http://www.biosci.rdg.ac.Uk/Research/eb/daphnia.htm)：在16 h光照/8 h黑暗的恒温(20±2) ℃培养箱中培养大型溞, 每天喂食一次小球藻悬浮液0.5~2.0 mL, 随着大型溞的成熟, 藻类的用量增加, 在成年后保持不变.在第8~10 d孵化成自由游动的新生儿(第一代), 在接下来的2~4 d内, 成熟雌虫孵化出第二代, 在第三代(12~14 d)左右达到繁殖高峰.本研究选用从第三代开始的新生大型溞(6~24 h), 放置于未加藻液的培养基中1~2 h排空它们的食道, 然后从同一个培养杯中挑选10只放置于100 mL烧杯中, 暴露介质为CuO NP在水体中转化72 h后的悬浮液, 温度为20 ℃, 测试溶液为80 mL, 每个样品平行测定3次, 将暴露烧杯放置于恒温培养箱中, 并随时观察大型溞的生命体征情况.观察在溶液中超过15 s不动的生物体被认为是死亡, 计算致死中浓度(24 h LC₅₀).

在大型溞体内Cu含量测定实验中, 选取100只7 d的大型溞放置于未加藻液的培养基中1~2 h排空它们的食道, 暴露介质为CuO NP在水体中转化72 h后的悬浮液, 暴露浓度为4 mg · L^-1, 测试溶液为800 mL, 每个样品平行测定3次.暴露3 h和12 h时从3个烧杯中分别取20只大型溞, 首先在超纯水清洗1 min去除大型溞体表的暴露介质, 然后用5 mmol · L^-1 Na₂EDTA溶液冲洗1 min去除纳米颗粒和聚集物, 再用0.1 mol · L^-1磷酸钾缓冲液(pH=7.0)快速冲洗去除Cu²⁺, 最后用超纯水快速冲洗去除Na₂EDTA和磷酸钾缓冲液(Adam et al., 2014).清洗完毕后放置于烘箱中60 ℃干燥24 h, 通过微波消解仪将大型溞消解, 然后将水样稀释到1%~2% HNO₃, 最后通过ICP-MS测定水体中Cu浓度(Li et al., 2016).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 CuO NP在不同酸根离子溶液中的转化

酸根离子在环境水体中普遍存在, 考虑到不同酸根离子可能会与Cu²⁺发生络合配位作用, 因此, 本文选择水体中普遍存在的Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、HCO₃^-、PO₄^3-、CO₃^2-、H₂PO₄^-、HPO₄^2-, 考察其对CuO NP在水体中释放Cu²⁺能力的影响, 结果如图 1所示.由图可知, CuO NP在不含酸根离子时表现出一定的释放Cu²⁺的能力, 这是由于在水体中CuO NP呈现如方程(1)的平衡状态.与不含酸根离子的体系相比, H₂PO₄^-促进了CuO NP释放Cu²⁺, 这是由于H₂PO₄^-在水中呈酸性(pH=5.09), 加速了CuO NP在水体中的转化；Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-对CuO NP的转化行为没有显著影响；而CO₃^2-、HCO₃^-、PO₄^3-、HPO₄^2-抑制了CuO NP释放Cu²⁺, 进而导致水体中游离态Cu²⁺浓度显著降低, 这可能是由于CO₃^2-、HCO₃^-、PO₄^3-、HPO₄^2-与CuO NP表面的Cu²⁺反应生成溶度积常数(K_sp)值更小的物质如Cu(OH)₂、Cu₃(PO₄)₂等所致(郭依玲等, 2019), 进而有效抑制了CuO NP释放Cu²⁺.

(1)

3.2 CuO NP在腐殖酸存在水体中的转化

腐殖酸是环境水体中最普遍存在的天然有机质, 其含有丰富的含氧官能团, 如羟基、羧基等, 极易与金属离子发生络合作用.本研究进一步考察了SRHA对CuO NP在水体中转化行为的影响.由图 2可见, SRHA的存在显著促进了CuO NP中Cu²⁺的释放, 并且随着SRHA浓度的增加, 释放的Cu²⁺浓度逐渐升高.这是由于腐殖酸丰富的表面官能团可与Cu²⁺发生络合反应, 进而促进CuO NP的转化过程(Liu et al., 2010；Zhang et al., 2011).

3.3 CuO NP在腐殖酸和酸根离子共存水体中的转化

图 3为CuO NP在腐殖酸和酸根离子(Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、HCO₃^-、PO₄^3-)共存时在水体中的转化行为曲线.尽管SRHA的存在可显著促进CuO NP在水体中释放Cu²⁺, 但不同酸根离子的存在均在一定程度上抑制了SRHA促进CuO NP中Cu²⁺释放的进程.这可能是盐离子对腐殖酸表面官能团的竞争络合所致, 从而有效降低了CuO NP与腐殖酸的相互作用.特别值得注意的是, HCO₃^-、PO₄^3-对CuO NP中Cu²⁺释放行为的抑制作用明显大于Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-, 这与图 1的结果是一致的, HCO₃^-、PO₄^3-与CuO NP表面反应后生成的不溶性物质, 抑制了SRHA促进CuO NP在水体中转化的效果.

3.4 CuO NP在环境水体中的形貌结构变化

CuO NP在环境水体中的形貌结构转化如图 4所示.初始的CuO NP呈颗粒状结构, 其直径约为(50±10) nm(图 4a).加入Cl^-、PO₄^3-后, 其形貌结构无明显变化(图 4b, 4c), 但在加入SRHA后, 可以观察到CuO NP表面有明显的有机物包被(图 4d~4f), 说明SRHA吸附在CuO NP表面, 进而与CuO NP发生相互作用, 同时CuO NP在水体中的分散性有不同程度的提高.

为进一步探究CuO NP在环境水体中与腐殖酸和酸根离子的相互作用, 采用FTIR测试对转化前后的CuO NP进行表征.如图 5a所示, 初始CuO NP在400~600 cm^-1区域有明显的Cu—O伸缩振动吸收峰, 1435 cm^-1处为CuO NP表面羟基官能团的伸缩振动吸收峰(Da et al., 2017).在含SRHA的水溶液中, 可以观察到1612 cm^-1和1721 cm^-1处存在明显的吸收峰, 这是由于SRHA中—COOH和C=O的伸缩振动引起的, 说明SRHA分子吸附在了CuO NP表面, 这与文献报道的腐殖酸通过—COOH和C=O与纳米颗粒表面相互作用是一致的(Zhang et al., 2019).在含PO₄^3-的水溶液中, 1011 cm^-1处的吸收峰是典型的PO₄^3-红外吸收, 这意味着PO₄^3-与CuO NP可能发生反应生成了Cu₃(PO₄)₂物质.红外谱图的变化说明SRHA和PO₄^3-极易与CuO NP表面发生相互作用, 这与CuO NP在水体中的转化行为曲线是一致的.

图 5b是CuO NP在环境水体中转化后的XRD谱图.CuO NP的XRD谱图与标准XRD卡片(JCPDS File no. 41-0254)是一致的, 呈明显的单斜晶结构.与初始的CuO NP样品相比, 在SRHA、Cl^-、SRHA + Cl^-存在时, CuO NP的衍射峰强度明显变弱, 说明CuO NP的晶体结构受到一定破坏, 这与在含SRHA、Cl^-、SRHA+Cl^-水溶液中CuO NP的转化行为曲线是一致的, CuO NP的转化行为影响了其晶体结构；但在含PO₄^3-、SRHA+PO₄^3-溶液中CuO NP的衍射峰强度有一定增强, 说明PO₄^3-的存在可抑制CuO NP的转化, 保持CuO NP良好的晶体结构, 这与图 1、图 3中CuO NP在水体中转化行为曲线是一致的.由于转化生成的不溶性物质如Cu(OH)₂、Cu₃(PO₄)₂等含量极低, 在XRD谱图中没有检测到.

3.5 CuO NP在水体中的稳定性

为进一步阐明CuO NP在水体中的稳定性, 对CuO NP在不同介质条件下转化过程中的水动力学直径和Zeta电位进行了表征.图 6a为CuO NP在转化过程中的水动力学直径变化曲线.由图可知, 水体中CuO NP在转化过程中的水动力学直径不断增加, 说明CuO NP发生了聚集, 这可能与CuO NP在水体中释放的Cu²⁺有关, 水环境中离子强度的增加可以加速胶体颗粒的聚集, 这与文献的报道结果是一致的(Shi et al., 2014; Peng et al., 2015).与单独CuO NP存在时相比, Cl^-的加入对CuO NP的水动力学直径没有显著影响；PO₄^3-存在时, CuO NP的水动力学直径都有一定程度的降低, 可能是由于PO₄^3-与纳米颗粒表面的Cu²⁺反应生成钝化层, 抑制了CuO NP的聚集；而当SRHA存在时, CuO NP的水动力学直径明显减小, 说明SRHA能够明显增加CuO NP胶体溶液的稳定性.

图 6b为CuO NP在转化过程中Zeta电位的变化曲线.由图可知, 单独水体中CuO NP的Zeta电位稳定在-25 mV；单独Cl^-存在时, Zeta电位没有显著变化；当有PO₄^3-存在时, Zeta电位明显降低, 可能由于PO₄^3-与纳米颗粒表面的Cu²⁺发生相互作用所致, 增加了纳米颗粒之间的静电斥力, 提高了CuO NP在水体中的稳定性, 这与CuO NP在水体中的转化行为曲线是一致的.在SRHA存在条件下, 随着时间的延长, Zeta电位由-22 mV下降到-35 mV, 这是因为SRHA能够吸附在CuO NP表面(图 5a), 从而增加CuO NP表面的负电荷量, 提高CuO NP水溶液的稳定性.

3.6 CuO NP在环境水体中转化后的毒性效应变化

采用大型溞为模式生物, 考察CuO NP在环境水体中转化对其毒性效应的影响, 结果如图 7a所示.单独Cu²⁺具有非常强的生物毒性, 对大型溞的致死中浓度(24 h LC₅₀)为20 μg · L^-1.与单独水体中CuO NP转化后对大型溞的致死中浓度(16 mg · L^-1)相比, CuO NP在含Cl^-、PO₄^3-、SRHA+PO₄^3-水体中转化72 h后, CuO NP对大型溞的24 h LC₅₀在16~32 mg · L^-1之间, 无显著性差异(p>0.05, n=3)；但CuO NP在SRHA、SRHA+Cl^-体系中转化72 h后, 其大型溞的24 h LC₅₀分别降低到0.8、2.5 mg · L^-1, 毒性效应显著增强(p < 0.005, n=3).由于CuO NP本身的生物毒性要远低于单独Cu²⁺, 这说明CuO NP在水体中释放的Cu²⁺可能是转化后CuO NP对大型溞毒性增强的重要原因.尽管在SRHA+Cl^-体系中Cu²⁺的释放量略低于单独CuO NP溶液, 但SRHA的存在显著提高了CuO NP在水体中的稳定性, 因而毒性效应有一定增强.与CuO NP在环境水体中的转化行为曲线对比表明, CuO NP对大型溞毒性效应与水体中游离态的Cu²⁺浓度、CuO NP形态密切相关, SRHA促进了CuO NP释放Cu²⁺, 提高了CuO NP溶液的稳定性, 进而导致CuO NP的生物毒性显著增强(Karlsson et al., 2008).

图 7b为不同暴露介质中暴露不同时间后大型溞体内的Cu元素含量(以干重计).由图可知, 尽管CuO NP在水体环境中有一定聚集, 但在不同暴露介质中的大型溞体内均检测到了不同含量的Cu, 说明轻度聚集不影响大型溞对CuO NP颗粒的摄取.CuO NP在含Cl^-、PO₄^3-、SRHA+PO₄^3-的水体中转化72 h后, CuO NP在大型溞体内的含量为26~35 mg · g^-1, 差异并不明显, 这与它们对大型溞的24 h LC₅₀值差异不明显是一致的.但在SRHA、SRHA+Cl^-体系中, 大型溞体内的Cu含量显著降低到10 mg · g^-1左右, 与24 h LC₅₀值对比发现, 尽管大型溞体内Cu的含量降低, 但其毒性效应显著增强, 这可能是SRHA的存在促进了Cu²⁺释放, 提高了CuO NP颗粒的稳定性导致的.在大型溞体内Cu元素主要以两种形式存在：CuO NP和Cu²⁺.在含Cl^-、PO₄^3-、SRHA+PO₄^3-的介质体系中, CuO NP的聚集导致其主要在大型溞肠道内富集, 不易被周围组织细胞吸收, 因而毒性较弱.在SRHA、SRHA+Cl^-体系中, 由于SRHA的稳定分散作用, 导致CuO NP易被大型溞摄入和排出, 因而大型溞体内Cu的含量相对较低, 但由于Cu元素主要以游离的Cu²⁺和分散的CuO NP存在, 易于被组织细胞吸收, 因而呈现出高毒性.这进一步说明CuO NP在环境介质中的赋存形式对其毒性效应有重要影响.

4 结论(Conclusions)

水体中含有的SRHA、酸根离子影响了CuO NP的环境转化行为, 其中, H₂PO₄^-显著促进了CuO NP释放Cu²⁺, Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-对CuO NP的转化行为没有显著影响, 而CO₃^2-、HCO₃^-、PO₄^3-、HPO₄^2-抑制了CuO NP释放Cu²⁺；SRHA的存在显著促进了CuO NP在水体中释放Cu²⁺, 但HCO₃^-、PO₄^3-的存在可以明显抑制SRHA促进CuO NP释放Cu²⁺的能力.环境转化对CuO NP的生态毒性效应有显著影响, 环境水体中CuO NP表面Cu²⁺的释放增加了其对大型溞的毒性效应, 进而导致环境暴露风险提高.