1 引言(Introduction)

酸性矿山废水(Acid mine drainage, AMD)以极端酸性, 并富含硫酸根和大量有毒金属元素为主要特点(Aguiar et al., 2016；Bao et al., 2018), 是目前全球采矿业面临的最严重的环境问题之一.在AMD及受AMD影响的环境中发现了大量含铁次生矿物, 这些含铁次生矿物可分为铁硫酸盐次生矿物(如黄钾铁矾和施氏矿物等)和一些含水氧化铁矿物(如针铁矿和水铁矿等)(Bigham et al., 2000).大量研究表明, 这些含铁次生矿物, 特别是铁硫酸盐次生矿物, 对AMD环境中重金属的迁移转化会产生重要影响.例如, 施氏矿物因具有较大的比表面积, 同时含有大量羟基、硫酸根等基团, 具有很强的吸附能力, 能大量吸附AMD中重金属等有毒有害元素(Liao et al., 2011；Chen et al., 2015).此外, 施氏矿物结构中的Fe³⁺和SO₄^2-点位常存在广泛的类质同象现象, 矿物中的Fe³⁺常被Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺等取代, 矿物结构内的SO₄^2-则可能被离子半径相当、电荷相当、与Fe³⁺配位能力强的含氧阴离子AsO₄^3-、CrO₄^2-等取代, 从而使得AMD中有毒有害元素随矿物的析出而钝化(Casiot et al., 2005；Regenspurg et al., 2005；Lee et al., 2006；Antelo et al., 2013；Vu et al., 2013).在AMD环境中, 铁氧化细菌(如嗜酸性氧化亚铁硫杆菌, A. ferrooxidans)的参与, 是形成铁硫酸盐次生矿物的重要条件(周立祥, 2008).A. ferrooxidans能高效催化酸性环境中Fe²⁺向Fe³⁺转化, Fe³⁺随之水解形成含铁次生矿物(宋永伟等, 2018).目前, 实验室利用A. ferrooxidans来合成施氏矿物和黄钾铁矾已经有大量报道(Bao et al., 2018；Zhang et al., 2018).

在自然界水环境中广泛分布着溶解性有机质(Dissolved organic matter, DOM), 其为环境中较为活跃的有机组分.DOM包括分子量较小的脂肪酸、芳香酸、氨基酸、单糖、低聚糖和一些高分子(如酶、酚类和腐殖质等).同时, DOM含有多种官能团, 如羧基、醌基和其他基团, 这些基团能与环境中的金属离子(如Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺等)发生配位、络合作用, 从而影响金属离子的环境地球化学行为(Wu et al., 2011；Pan et al., 2012；Kikuchi et al., 2017).研究发现, DOM在AMD环境中也是广泛存在的(Bao et al., 2017；Xie et al., 2017).由此推测, 在AMD环境中, DOM对铁硫酸盐次生矿物的形成会产生重要影响.然而, 目前关于AMD环境中DOM对铁硫酸盐次生矿物形成的影响研究还较少涉及.

Xie等(2017)在针对广东大宝山矿区AMD污染的横石河流域开展的调查研究中发现, 河水中的DOM种类以色氨酸类物质为主.L-色氨酸(L-tryptophan, L-trp)是一种常见的天然氨基酸.为了研究色氨酸是否会影响铁硫酸盐次生矿物的形成和形貌特征, 本研究拟通过生物法并供应不同浓度L-色氨酸的方式, 来模拟研究AMD环境中L-色氨酸对铁硫酸盐次生矿物合成量、组成和形态等的影响, 以期增加对AMD环境中DOM在次生矿物形成中的影响的认识, 为研究AMD环境中次生矿物的形成提供理论依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 A. ferrooxidans休止细胞的制备

A. ferrooxidans菌株是从广东省的一座硫铁矿山的AMD中分离纯化得到(张婷等, 2013).采用9K培养基对该菌株进行培养.9K培养基配置：称取(NH₄)₂SO₄ 3.5 g、KCl 0.119 g、K₂HPO₄ 0.058 g、Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.0168 g、MgSO₄·7H₂O 0.583 g, 溶于1 L蒸馏水中, 用5 mol·L^-1 H₂SO₄调节pH至2.5, 高温高压灭菌.将A. ferrooxidans接种在灭菌后的9K培养基中(接种量10%, V:V), 加入FeSO₄·7H₂O使其浓度约为44.5 g·L^-1, 用1 mol·L^-1 H₂SO₄调节pH至2.5.将接种好的培养液置于30 ℃摇床中160 r·min^-1振荡培养, 对数生长期后停止培养(约需2 d).随后将培养液经定性滤纸过滤以除去铁沉淀物, 滤液在10000 r·min^-1下离心收集菌体.菌体用H₂SO₄溶液(pH~2.5)洗涤3次, 再用H₂SO₄溶液(pH~2.5)悬浮, 1 L培养液大约收集100 mL细菌悬浮液, 其中A. ferrooxidans密度约为1×10⁸ cells·mL^-1.

2.2 试验设计

本实验共设5个处理, 每个处理3个重复.取一系列250 mL三角瓶, 分别准确称取8.34 g的FeSO₄·7H₂O和0.86 g的K₂SO₄, 用130 mL灭菌后的蒸馏水溶解.然后分别在5个处理体系中添加0、0.01、0.05、0.25和1.00 g的L-色氨酸, 并用1 mol·L^-1 H₂SO₄调节体系pH至2.5.最后在各个体系中分别加入上述制备好的A. ferrooxidans休止细胞悬浮液20 mL, 使三角瓶内溶液的总体积为150 mL.此时, 溶液中Fe²⁺浓度为200 mmol·L^-1, K⁺浓度为65.9 mmol·L^-1, FeSO₄·7H₂O和K₂SO₄的添加量参考黄姗等(2012)的研究；5个处理体系中L-色氨酸的浓度分别为0、0.07、0.33、1.67和6.67 g·L^-1.将上述三角瓶置于30 ℃、160 r·min^-1摇床中培养.培养过程中, 定期取样, 测定溶液pH、ORP、Fe²⁺和Fe³⁺浓度.取样检测时间设定为0、1、2、3、4、6、8、10和12 d.参照公式(1)计算Fe²⁺氧化率(R₁)和总Fe沉淀率(R₂).培养结束后, 将体系中的矿物沉淀用定性滤纸过滤收集, 用H₂SO₄溶液(pH~2.5)清洗矿物3次, 再用中性去离子水清洗至滤液呈中性.将收集的矿物于50 ℃下烘干, 称重, 过筛, 备用.

(1)

式中, C₀为处理体系Fe²⁺初始浓度或总Fe初始浓度；C_t为处理体系不同时刻溶液中Fe²⁺浓度或总Fe浓度.

2.3 分析方法与仪器

溶液pH用Thermo Orion便携式pH计(Star A 120P-01A, 美国Thermo Fisher Scientific公司)测定；ORP采用氧化还原电位计(台湾衡欣)测定；Fe²⁺与Fe³⁺浓度使用可见分光光度计(UV-5500, 上海元析)利用邻菲罗啉比色法测定(Bao et al., 2017).

矿物相采用X-射线衍射仪(XRD, D8 ADVANCE, 德国Bruker公司)测定, Jade 6.5软件分析矿物组成；矿物形貌特征采用扫描电镜(SEM, Carl Zeiss SUPRA40, 德国Carl Zeiss公司)进行观察, 同时采用X射线能谱仪(EDS, Quantax, 德国Bruker公司)对SEM图片中指定的目标区域进行扫描分析, 分析矿物表面元素的相对组成.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 色氨酸对矿物合成体系溶液pH和ORP变化的影响

矿物合成体系中溶液pH随培养时间的变化如图 1a所示.在A. ferrooxidans催化合成铁硫酸盐次生矿物的过程中, 5个处理的pH均呈下降的趋势.在培养的前4 d, pH下降最快.其中, L-trp 1.00 g体系溶液pH下降幅度最小, 由2.5下降至1.8；L-trp 0.25 g体系和L-trp 0.05 g体系溶液pH下降至1.5；L-trp 0.01 g体系和空白对照体系溶液pH下降至1.6.A. ferrooxidans氧化Fe²⁺至Fe³⁺是消耗H⁺的过程(式(2)).刘奋武等(2015)研究表明, A. ferrooxidans催化合成含铁次生矿物初期, Fe²⁺氧化成Fe³⁺过程会消耗体系中的H⁺, 使得合成初期体系pH上升.本实验可能因取样时间间隔较长而没有观察到培养初期体系pH上升的现象.随着培养时间延长, Fe³⁺产生, Fe³⁺水解成矿产生大量H⁺(式(3)和式(4)), 这就使得体系pH在后续的培养中出现下降的趋势.A. ferrooxidans催化形成铁硫酸盐次生矿物的相关反应式如下所示(刘奋武等, 2014；周立祥, 2008)：

(2)

(3)

(4)

由图 1b可知, 在培养的前4 d, 本研究5个体系的ORP除L-trp 0.25 g和L-trp 1.00 g体系外, 均由346 mV升至575 mV；而L-trp 0.25 g体系的ORP则由342 mV升至524 mV, L-trp 1.00 g体系的ORP由341 mV升至410 mV.L-trp 1.00 g体系的ORP于第4 d达到平衡；其余4个体系的ORP均持续上升, 于第6 d达到最高值, 随后略有下降, 至培养结束, 空白对照组、L-trp 0.01 g、L-trp 0.05 g、和L-trp 0.25 g体系的ORP分别降至625、595、574和556 mV.可见, 在A. ferrooxidans催化合成铁硫酸盐次生矿物的前期(0~4 d), 低浓度色氨酸的加入对体系ORP变化幅度的影响不大, 其显著影响主要作用于中后期(4~12 d).总体上, 随着体系中色氨酸浓度的增加, 体系pH降低幅度越小, ORP上升越不明显.

3.2 色氨酸对矿物合成体系Fe²⁺氧化率及总Fe沉淀率的影响

根据图 2a所示, 除L-trp 1.00 g体系外, 其余4个培养体系在培养前4 d的Fe²⁺氧化率均呈直线上升, 直到第6 d后趋于平衡, Fe²⁺基本氧化完全.没有色氨酸或低浓度色氨酸的体系(L-trp 0.01 g体系和L-trp 0.05 g体系)Fe²⁺氧化速率基本一致, 说明低浓度色氨酸对A. ferrooxidans催化Fe²⁺氧化没有明显影响.L-trp 0.25 g体系培养前6 d Fe²⁺氧化率略低于没有色氨酸或低浓度色氨酸的体系(L-trp 0.01 g体系和L-trp 0.05 g体系).而色氨酸浓度最高的L-trp 1.00 g体系中Fe²⁺氧化速率明显低于其他体系, 至培养结束Fe²⁺氧化率仅为28.5%.这说明高浓度色氨酸对A. ferrooxidans催化Fe²⁺氧化产生了抑制作用.这可能是因为：一方面, Fe²⁺和DOM结合形成Fe(Ⅱ)-DOM配合物, 可减缓Fe(Ⅱ)的氧化(Knorr et al., 2007)；另一方面, 色氨酸对A. ferrooxidans可能产生了毒害作用, 抑制了Fe²⁺的氧化.有研究证实, 制革污水处理厂污泥中高浓度DOM能够抑制A. ferrooxidans的生长；进一步研究发现, 包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸在内的小分子有机酸对A. ferrooxidans产生明显的毒害作用, 而一元有机羧酸葡萄糖、淀粉、甘油和柠檬酸几乎没有表现出毒性(Fang et al., 2006).

总Fe沉淀率随时间的变化趋势见图 2b.A. ferrooxidans催化合成含铁次生矿物过程的实质是Fe²⁺氧化和Fe³⁺水解成矿, 矿物随之从液相中析出沉淀(Gramp et al., 2008).如图 2b所示, L-trp 1.00 g体系总Fe沉淀率明显较低, 该体系最终总Fe沉淀率只有27.7%, 不到空白对照组的一半, 说明高浓度色氨酸不利于含铁次生矿物的形成, 这主要是因为高浓度色氨酸对Fe²⁺的氧化产生抑制作用.而总Fe沉淀率最高的是L-trp 0.25 g体系, 最终的总Fe沉淀率为67.8%.L-trp 0.01 g体系和L-trp 0.05 g体系最终的总Fe沉淀率分别为67.2%和67.7%, 比空白对照组的沉淀率(64.4%)略高.由此可见, 低浓度的色氨酸能够促进总Fe的沉淀.

3.3 色氨酸对次生矿物合成量及化学组成的影响

本研究合成的矿物量及矿物的元素组成见表 1.色氨酸对次生矿物产量的影响依赖于其浓度, 当色氨酸浓度低于1.67 g·L^-1时, 矿物产量随着色氨酸浓度的升高而增加.进一步说明, 一定浓度的色氨酸对矿物的形成有促进作用.Škrtić和Füredi-Milhofer(1993)研究色氨酸对草酸钙晶体成核的影响时发现, 当色氨酸达到一定浓度(2.73×10^-4~3.79×10^-4 mmol·L^-1)时可促进晶体成核.本研究还发现, 当色氨酸浓度为6.67 g·L^-1时, 矿物产量非常低, 收集到的矿物量不到对照组矿物产量的一半, 这跟L-trp 1.00 g体系中极低的Fe²⁺氧化率有关, 即Fe²⁺氧化得到的Fe³⁺减少, 则Fe³⁺水解沉淀得到的矿物的量也相应减少.针对尿石的形成的研究发现, 氨基酸可以作为配合剂与钙离子形成配合物, 降低溶液过饱和度和尿石形成危险因子, 从而抑制含钙尿石生长(邓穗平等, 2005).同样地, 过量的色氨酸的加入可以与Fe形成大量配合物, 抑制矿物的生长.此外, 过量的色氨酸可能吸附在次生矿物或凝结核表面, 抑制矿物晶体的增长和次生矿物的形成.方胜强等(2008)研究表明, 在溶液内添加葡聚糖时, 葡聚糖吸附在次生矿物或凝结核表面, 从而将结晶核隔离核分散, 阻碍了结晶核的自由扩散和团聚, 并抑制晶体的增长和次生矿物的形成.

合成矿物的元素组成也跟色氨酸的浓度有关.所有处理得到的矿物内K含量均相对较高, 说明合成的铁硫酸盐次生矿物以黄钾铁矾为主.合成体系色氨酸浓度较低时, 形成的次生矿物内Fe和K含量随着色氨酸浓度的增加而增加, 当色氨酸浓度达到0.33 g·L^-1时, 次生矿物内Fe和K含量达到最大值.当色氨酸浓度继续增加, 次生矿物内Fe含量略有下降.次生矿物的Fe/S也有类似的现象, 且Fe/S介于施氏矿物和黄钾铁矾的理论值之间, 表明合成的次生矿物是黄钾铁矾和施氏矿物的混合物, 但以黄钾铁矾为主, 这可能跟实验中K⁺的添加量有关.宋永伟等(2018)研究发现, 当Fe/NH₄⁺=2.0、pH=2.6时, 获得的次生矿物为纯的施氏矿物；当NH₄⁺浓度升高或体系pH下调时, 才出现黄铵铁矾.而K⁺的成矾能力远大于NH₄⁺(柏双友等, 2011).Bai等(2012)的研究结果表明, 初始Fe²⁺浓度为160 mmol·L^-1溶液中, Fe/K≤100时, 合成体系中便开始出现黄钾铁矾.柏双友等(2010)研究发现, 在FeSO₄-K₂SO₄-H₂O体系中, 当Fe²⁺浓度为160 mmol·L^-1、Fe/K=3时, 矿物相由结晶度差的施氏矿物逐渐过渡到结晶度较好的黄钾铁矾.本实验初始Fe²⁺浓度为200 mmol·L^-1、Fe/K=3, 正是在这种含高浓度K⁺的体系中产生了大量的黄钾铁矾.

3.4 色氨酸对次生矿物矿物相的影响

X射线衍射(XRD)分析是区分晶型矿物与非晶型矿物, 以及鉴别矿物相的有效手段.已知黄钾铁矾为晶型矿物, 在XRD图谱上有非常尖锐的谱峰；施氏矿物为无定型矿物, 有8条特征宽峰.图 3是各体系培养结束后收集的次生矿物的XRD分析图.参考JCPDS黄钾铁矾(PDF#22-0827)的标准图谱可知, 随着色氨酸浓度的升高, 表现为黄钾铁矾衍射峰逐渐减弱.根据JCPDS施氏矿物(PDF#47- 1775)标准图谱, 典型衍射峰位于2θ=35.15°处.从图 3可以看出, 当色氨酸的添加量达到6.67 g·L^-1时, 出现了明显的施氏矿物特征峰.可见, 色氨酸的加入抑制了黄钾铁矾的形成.

SEM照片显示(图 4), 不同色氨酸浓度处理形成的矿物均有晶体团聚现象.随着色氨酸浓度的增加, 次生矿物的结晶度越来越差, 次生矿物的颗粒由以菱形晶体为主变为以颗粒较大的球状体为主.空白对照组的颗粒表面较圆滑, 添加了6.67 g·L^-1色氨酸的处理组矿物颗粒表面则较为粗糙.此外, 同L-trp 0.25 g体系相比, L-trp 1.00 g体系合成的矿物颗粒更大.

矿物学特征分析表明, L-色氨酸能够抑制晶型黄钾铁矾的形成, 并降低铁矿物的结晶度.生物合成含铁次矿物可分为3个过程：Fe²⁺在A. ferrooxidans作用下氧化为Fe³⁺；Fe³⁺水解生成矿物合成所需的初始晶核；次生铁矿物在晶核表面逐渐长大(王敏等, 2013).黄姗和周立祥(2012)研究葡聚糖对酸性矿山废水中次生铁矿物形成的影响时也发现了类似的现象, 葡聚糖能够抑制次生矿物的合成, 并且阻止次生矿物由施氏矿物向黄钾铁矾的转变.本研究发现, 色氨酸的添加同样地抑制了黄钾铁矾的形成.推测色氨酸可能从以下几个方面影响次生铁矿物的形成：一方面, 高浓度色氨酸对A. ferrooxidans有毒害作用, 抑制了Fe²⁺的氧化；另一方面, 相比于更高的色氨酸添加量体系, 色氨酸添加量少的体系pH更低, 低的pH对施氏矿物合成产生一定的抑制作用.这主要是因为Fe³⁺水解生成施氏矿物将产生更多的H⁺, 不利于反应的进行.从反应式(3)和反应式(4)可以看出, 1 mol Fe³⁺水解形成施氏矿物可释放出2.75 mol的H⁺, 而水解形成黄钾铁矾只释放出2 mol的H⁺.再者, 在溶液内添加色氨酸, 当色氨酸浓度较低时可促进晶体成核, 从而促进了矿物的形成.当色氨酸浓度较高时, 过量的色氨酸与铁离子形成配合物, 抑制了矿物的生长；或色氨酸吸附在次生矿物或凝结核表面, 从而将结晶核隔离核分散, 抑制晶体的生长和次生矿物的形成.

4 结论(Conclusions)

1) 色氨酸浓度差异导致了矿物合成体系中pH、ORP、Fe²⁺氧化率、沉淀率等参数的变化.随着体系色氨酸浓度的增加, 体系pH降低幅度越小, ORP上升越不明显.当色氨酸浓度小于1.67 g·L^-1时, 不影响Fe²⁺氧化, 各体系Fe²⁺基本氧化完全, 同时随着色氨酸浓度升高总Fe沉淀去除效果更好.而当色氨酸浓度增加至6.67 g·L^-1时, Fe²⁺氧化率仅为28.5%, 总Fe沉淀率为27.7%, 远低于空白对照组64.4%的沉淀率.

2) 次生矿物的产量和化学组成与色氨酸的浓度有关.当色氨酸浓度低于1.67 g·L^-1时, 总Fe沉淀率及矿物产量随着色氨酸浓度升高而增加, 说明低浓度色氨酸促进含铁次生矿物的形成.而当色氨酸浓度增加至6.67 g·L^-1时, 色氨酸对含铁次生矿物的形成产生抑制作用, 总Fe沉淀率及矿物的产量不到对照组矿物产量的一半.次生矿物内Fe/S比介于施氏矿物和黄钾铁矾的理论值之间, 表明不同体系所得次生矿物均为黄钾铁矾和施氏矿物的混合物.

3) 矿物学特征分析表明, 随着色氨酸浓度的升高, 矿物的合成表现为黄钾铁矾向施氏矿物转移.