1 引言(Introduction)

氟(Fluoride, 简称F)是机体微量元素之一, 但长期过量摄入会导致机体全身性病理改变(Chong et al., 2011), 称为地氟病(Sivasankar et al., 2012).氟能透过血-脑屏障蓄积在脑组织中, 影响脑功能(Li et al., 2009；张璟等, 2010), 但其具体分子机制尚待阐明.

Ca²⁺是神经细胞内重要的信息分子(孙天水等, 2016), 参与神经细胞突触传递和神经毒性等病理生理过程.氟暴露会导致脑细胞内Ca²⁺超载, 引起钙信号转导通道一些与学习记忆功能相关基因/蛋白表达异常, 从而影响脑的高级神经功能(Zhang et al., 2011).本课题组前期研究表明, 亚慢性氟暴露致小鼠学习记忆损伤与海马细胞内钙超载、细胞内Ca²⁺信号通路CaMKII分子及下游凋亡相关分子表达异常有关(年未未等, 2018).但慢性氟暴露致脑细胞内Ca²⁺超载机制及Ca²⁺信号通路诱导CaMKII活化的激活分子表达水平的变化尚未见报道.鉴于L-型钙离子通道是细胞膜调节Ca²⁺内流的主要通道(Wang et al., 2001), 海马是学习记忆主要脑区, 对氟暴露敏感(章子贵等, 2015).本研究在前期工作的基础上, 拟通过小鼠5 mg·L^-1和30 mg·L^-1 NaF溶液与L-型钙离子通道激动剂/拮抗剂联合慢性暴露, 检测小鼠海马组织抗氧化能力及其海马CA₁区细胞凋亡、细胞膜L-型钙通道Cav1.2和Ca²⁺信号转导通路CaM/CaMKII分子及下游凋亡调节相关蛋白表达水平, 进一步探讨慢性氟暴露对小鼠海马的影响及分子机制, 并筛选新型有效抗氟药物.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 主要试剂与仪器

主要试剂：NaF购自金华试剂公司；FPL64176购自Sigma公司；Nifedipine购自BOMEI公司；Bax、Bcl-2、钙调蛋白激酶(CaMKII)和钙调蛋白(CaM)抗体(一抗)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(二抗)购自上海氟博蕴公司.

主要仪器：酶标仪(SPECTRA MAX 190)；蛋白质转膜仪、垂直电泳槽、平行电泳(美国Bio-Rad公司)；Olympus光学显微镜(美国Bio-Rad公司)；组织切片机(Shandon Finesse ME+, 美国).

2.2 实验方法 2.2.1 实验动物

选用健康初断乳ICR雄性小鼠140只(购自浙江省实验动物中心, SCYK(Zhejiang)20030001), 体重15~20 g.饲养房温度(23±2) ℃, 湿度40%~70%, 光暗周期为12 h, 小鼠标准饮食, 自由饮水, 所有程序均根据《NIH实验动物的护理和使用指南》进行.

2.2.2 动物分组

140只ICR小鼠适应1周后, 随机分为7组(表 1)：对照组(C组)、高氟组(HF组, 饮用30 mg·L^-1 NaF溶液)、低氟组(LF组, 饮用5 mg·L^-1 NaF溶液)、高氟注射L-型钙通道激动剂组(FPL64176) (HF+FPL)、高氟注射L-型钙通道拮抗剂组(Nifedipine) (HF+NIF)、低氟注射L-型钙通道激动剂组(FPL64176) (LF+FPL)、低氟注射L-型钙通道拮抗剂组(Nifedipine) (LF+NIF).对照组饮用自来水(氟化物浓度 < 0.2 mg·L^-1)、高氟组和低氟组分别饮用30 mg·L^-1和5 mg·L^-1的NaF溶液, 氟暴露6个月.慢性氟暴露结束前1周, 对照组腹腔内注射生理盐水, 各氟暴露组分别腹腔注射生理盐水配制的L-型钙通道激动剂或拮抗剂(5 mg·kg^-1·d^-1) (苏林博等, 2016).

2.2.3 小鼠脑组织脂质过氧化酶检测

迅速处死小鼠, 冰上取新鲜脑组织, 匀浆后, 以3500 r·min^-1离心15 min, 然后取脑组织匀浆上清液置于4 ℃冰箱保存备用.根据试剂盒说明进行海马组织GSH-Px、SOD酶活性和MDA含量检测.

2.2.4 各组小鼠海马细胞凋亡水平观测

冰上快速取小鼠脑组织, 10%福尔马林固定海马, 海马组织梯度酒精脱水, 石蜡包埋、切片、苏木精染色(Liu et al., 2015)等.按照凋亡检测试剂盒的方法, 用TUNEL法测定各组海马细胞凋亡水平.先对海马组织石蜡切片进行常规脱蜡和蛋白酶K消化、反应、孵育和着色, 然后用苏木素复染细胞核、脱水、封片(Lou et al., 2013).阳性标记的凋亡细胞核是棕色的, 在光学显微镜下观察阳性标记细胞的数目.用ImageJ软件计算凋亡细胞数量.

2.2.5 Western Blot检测蛋白表达水平

用Western Blot法检测小鼠海马CA₁区细胞膜L-型钙通道Cav1.2、Ca²⁺信号通道分子和下游凋亡调节相关分子蛋白表达水平, 选取10只小鼠海马组织进行检测.主要实验步骤包括总蛋白提取、蛋白上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、显影、定影、扫描仪扫描, 蛋白条带用Quantityone软件分析扫描目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值, 内参调整值为目的蛋白灰度值与β-actin灰度值之比.计算每一组内参调整值与对照组内参调整值的比值用以表征该孔样品蛋白表达量.

2.3 统计分析

用SPSS20.0软件对实验数据进行统计学分析.结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示, 进行单因素方差分析(One Way ANOVA)和两两比较LSD检验.以p < 0.05表示表示具有统计显著性, p < 0.01具有统计极显著性.

3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 慢性氟暴露对小鼠海马组织抗氧化能力的影响

慢性氟暴露对小鼠海马组织抗氧化能力的影响见表 2.表 2结果表明, 与C组比, 各试验组GSH-Px酶活力显著或极显著降低(p < 0.05或p < 0.01), HF、LF+NIF和HF+FPL组SOD酶活力显著或极显著降低(p < 0.05或p < 0.01), HF、LF组、HF+FPL组和LF+FPL组MDA含量极显著或显著升高(p < 0.01或p < 0.05)；与HF组比, HF+FPL组SOD酶活力显著降低(p < 0.05), HF+FPL和HF+NIF组MDA含量显著下降(p < 0.05)；与LF组比, LF+NIF组MDA含量显著下降(p < 0.05), 各氟暴露加药物注射组GSH-Px、SOD酶活力均无显著性变化(p>0.05).

3.2 慢性氟暴露对小鼠海马CA₁区细胞凋亡的影响 3.2.1 小鼠海马CA₁区细胞凋亡观察结果

各组小鼠海马CA₁区细胞凋亡状况见图 1.图 1表明, C组海马CA₁区细胞排列整齐, 凋亡细胞数较少；HF、LF、HF+FPL、LF+FPL组凋亡细胞明显增多, 而HF+NIF和LF+NIF组凋亡细胞有所减少.

3.2.2 小鼠海马CA₁区细胞凋亡率统计结果

慢性氟暴露对小鼠海马CA₁区细胞凋亡率影响观测统计结果见图 2.图 2结果表明, 与C组比, 各试验组小鼠细胞凋亡率均极显著升高(p < 0.01)；与HF组比, HF+FPL组细胞凋亡率显著升高(p < 0.05), 而HF+NIF组细胞凋亡率无显著性变化(p>0.05).与LF组比, LF+NIF组海马CA₁区细胞凋亡率显著降低(p < 0.05).

3.3 慢性氟暴露对小鼠海马CA₁区细胞膜L-型钙通道Cav1.2、Ca²⁺信号通道分子CaM、CaMKII蛋白表达水平影响

慢性氟暴露对小鼠海马CA₁区细胞膜L-型钙通道Cav1.2、CaM、CaMKII蛋白表达水平影响检测统计结果见图 3.由图 3可见, 与C组比, 各试验组Cav1.2蛋白表达水平均极显著或显著降低(p < 0.01或p < 0.05), 各试验组CaM蛋白表达均显著或极显著升高(p < 0.05或p < 0.01), HF、HF+FPL、HF+NIF组CaMKII蛋白表达极显著升高(p < 0.01), LF组CaMKII蛋白表达显著升高(p < 0.05)；与HF组比, HF+FPL组Cav1.2蛋白表达显著降低(p < 0.05), HF+NIF组CaMKII蛋白表达显著升高(p < 0.05)；与LF组比, LF+NIF组CaMKII蛋白表达显著降低(p < 0.05).

3.4 慢性氟暴露对小鼠海马CA₁区细胞内下游凋亡调节相关分子蛋白表达水平的影响

慢性氟暴露对小鼠海马CA₁区细胞内促凋亡Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2蛋白表达水平影响检测结果见图 4.由图 4可见, 与C组比, HF、HF+FPL、HF+NIF组Bax蛋白表达水平极显著升高(p < 0.01), LF、LF+FPL组显著升高(p < 0.05), 各试验组Bcl-2蛋白表达水平显著或极显著降低(p < 0.05或p < 0.01), 各试验组Bax/Bcl-2蛋白表达水平比值均显著或极显著升高(p < 0.05或p < 0.01)；与HF组比, HF+FPL组Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达水平比值显著升高(p < 0.05), HF+NIF组Bcl-2蛋白表达极显著升高(p < 0.01)；与LF组比, LF+NIF组Bcl-2蛋白表达显著升高(p < 0.05), LF+FPL组Bax/Bcl-2蛋白表达水平比值极显著升高(p < 0.01).

4 讨论(Discussion)

我国地氟病分为饮水型、燃煤型(Ando et al., 2001)和饮茶型(Cao et al., 2003)3类, 其中以饮水型地氟病影响最为广泛, 分布于山西、浙江等30个省市, 饮用高氟水的6300多万人中有近3000万人出现病症, 已成为我国重大公共卫生问题, 但其发病机理迄今未明.深入开展饮水型地氟病发病机理和防治研究具有重要的科学和实际意义.

目前, 有关氟中毒的学说众说纷纭, 但没有一个学说能完整解释地氟病的发病机制, 氟致氧化应激是比较公认的学说之一(Hassan et al., 2009).本研究得到的高氟暴露使小鼠海马组织抗氧化酶GSH-Px和SOD活性极显著或显著降低, 而脂质过氧化产物MDA含量极显著提高的实验结果再次为该学说提供了实验佐证.

由于地氟病发病机制十分复杂, 众多研究已表明, 除氧化应激机制外, 可能还涉及其它机制.细胞凋亡(Apoptosis)是基因调控程序性死亡.近年来, 细胞凋亡在疾病发生/发展过程中的生理/病理学意义已引起关注(Susan et al., 2007).Bcl-2家族成员在细胞凋亡中具有重要作用, 抗凋亡蛋白Bcl-2可能通过抑制DNA转录抑制凋亡相关基因的激活机制(Sun et al., 2017).而促凋亡蛋白Bax高表达时, Bax与Bcl-2形成异二聚体, Bcl-2蛋白失活, 使细胞凋亡加剧.Bax/Bcl-2蛋白比例决定了细胞存活或凋亡(王长松等, 2003).贾丽玲等(2010)研究结果表明, Bax与Bcl-2蛋白表达比值升高会导致细胞凋亡数增加.本研究结果得到的高氟暴露致小鼠海马CA₁区细胞凋亡率、促凋亡蛋白表达水平和Bax/Bcl-2蛋白表达比值均极显著升高, 而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平极显著下降的实验结果与有关氟中毒可导致细胞结构异常、诱导细胞凋亡的文献报道(张爱君等, 2003；韩璐等, 2010；Teng et al., 2017)相一致.提示细胞凋亡异常可能也是氟暴露致小鼠海马损伤机制之一, 但氟致脑细胞凋亡的上游一些分子事件迄今仍有待阐明.

早在1981年, Siesjö等(1981;1985)的研究就已表明, 细胞内钙超负荷会引起缺血性神经元损伤.近些年来研究已逐步表明, 氟暴露确能改变骨相器官钙平衡, 机体整体低钙-靶细胞内Ca²⁺超载参与了氟骨症发生发展过程(Duan et al., 2014), 这就是“钙矛盾疾病”学说的主要内容(Fujita et al., 2000).本课题组前期研究亦已证明, 氟暴露能引起脑细胞内Ca²⁺超载(Zhang et al., 2011), 但氟暴露致脑细胞内Ca²⁺超载机制却鲜有报道.钙离子通道是Ca²⁺进出细胞的主要途径, Ca²⁺通道分为电压依赖型(Voltage-dependent calcium Channal, VDCCs)、受体操纵型(Receptor operated calcium channal, ROCCs)和机械门控型(MGCCs)三大类.根据VDCCs对电压和传导性的不同, VDCCs又分为N、T、L、P/Q、R型等5类(Catterall et al., 2005).其中, L-型(L-type calcium channel, LTCC)备受关注, LTCC普遍存在海马CA₁区锥体细胞膜上, 所产生的电流占所有钙通道电流的30%~50%, 是Ca²⁺内流的主要通道, 不仅在调节胞质内Ca²⁺水平中发挥重要作用, 还能将钙调信号传至细胞核(Deissemth et al., 2003), 参与神经细胞钙稳态、突触可塑性、学习记忆等的调控(Stefan et al., 2014).LTCC又可分Cav1.1(α1S)、Cav1.2(α1C)、Cav1.3(α1D)和Cav1.4(α1F) 4类, Cav1.2是细胞膜上最常见钙通道拮抗剂结合靶点和Ca²⁺流入细胞内的通道(Serysheva et al., 2002).已有文献表明, 氟中毒对成骨细胞膜Cav1.2蛋白/基因表达水平有显著影响(Duan et al., 2014).本课题组前期研究也证明, 氟暴露致PC12细胞内Ca²⁺超载与Cav1.2钙通道分子表达水平异常有关(Liao et al., 2017).本研究首次探讨了慢性氟暴露对在体动物海马CA₁区细胞膜L-型钙通道Cav1.2蛋白表达水平的影响, 所得到高氟暴露能使小鼠海马细胞L-型钙离子通道Cav1.2蛋白表达水平显著下降的实验结果提示, L-型钙通道Cav1.2分子可能是氟暴露致脑细胞Ca²⁺超载的重要靶分子.

当前, 细胞内Ca²⁺超载所引发的细胞一系列病理生理反应已逐渐成为衰老性脑功能障碍机制(章子贵等, 2000)和地氟病机理研究(Duan et al., 2014)的热点.Ca²⁺-CaM-CAMKII是参与脑高级神经活动的重要信号转导通路, 与学习记忆、LTP等密切相关(马婧等, 2018).CaMKII是钙/钙调蛋白激酶CaMK的主要成员之一, 能被Ca²⁺/CaM结合而激活, 活化的CaMKII通过多种途径调节细胞内Ca²⁺平衡, 具有广泛的生物学活性, 且与凋亡细胞等密切相关(Robison et al., 2014).本课题组前期研究已表明, 氟暴露致神经细胞内Ca²⁺超载一方面引起钙信号转导系统主要途径之一—非PKC途径即钙调蛋白激酶成员CaMKII和c-fos蛋白表达异常, 从而引起Ca²⁺信号转导通路的失调和紊乱；另一方面, Ca²⁺信号转导通路失调和紊乱使受Ca²⁺调节的核转录因子Nuclear Factor-κB(NF-κB)表达异常(Zhang et al., 2011), NF-κB表达异常又影响促凋亡Bcl-2和抗凋亡Bax蛋白表达(Zhang et al., 2013), 诱导神经细胞凋亡的增强, 最终导致脑损伤.本研究不仅得到了与本课题组前期研究相一致的结果(年未未等, 2018), 即氟暴露使海马细胞CAMKII蛋白表达水平明显上升, 还首次得到了氟暴露使小鼠海马神经细胞CAMKII蛋白的活化分子CaM蛋白表达水平也显著上升的重要实验结果.提示Ca²⁺-CaM-CAMKII信号转导通路功能异常可能是氟致海马细胞凋亡异常的重要环节.

饮水氟安全阈值问题一直备受争议(戴力维等, 2017；熊传龙等, 2017).当前, 我国饮水氟标准为1.0~1.2 mg·L^-1.近年来, 随着毒理学领域中分子生物学检测技术的不断应用, 低氟暴露对机体分子水平的损害逐渐引起关注.本课题组前期电生理研究已表明, 低氟暴露(5 mg·L^-1, 根据药理试验大小鼠与人体等效剂量换算约为10:1(黄继汉等, 2004), 可知5 mg·L^-1 NaF溶液在人体中约为0.5 mg·L^-1)也能影响小鼠海马细胞L-型钙通道, 引起海马细胞内钙超载(Yu et al., 2019).本研究结果表明, 低氟暴露能使小鼠海马组织抗氧化能力、细胞凋亡率、Cav1.2和Ca²⁺信号转导通路分子及凋亡调节相关分子表达水平呈现异常改变, 提示低氟暴露具有脑健康风险.

迄今国内外尚无治疗氟中毒的特效药.近年来, 本课题组实验室进行了一些抗氟药/剂的筛选工作, 如一定剂量硒及膳食高钙对氟神经毒性有一定干预作用(Zheng et al., 2016；Sun et al., 2017).氟中毒能够造成细胞内钙离子超载(Zhang et al., 2011), 因此, 抑制细胞内钙超载可能成为氟中毒治疗研究的新领域.已有研究发现, 利用L-型钙通道拮抗剂心痛定等处理原代培养孕妇子宫平滑肌细胞, 在钙波形成前可明显抑制细胞钙波的形成(张荣荣等, 2003).而L-型钙通道兴奋剂FPL64176则与L-型钙通道拮抗剂呈相反的作用(Fan et al., 2000).根据Cav1.2钙离子通道具有药理特性及与药物结合的功能特性(Serysheva et al., 2002)和上述文献报道的提示, 本研究首次较为系统地探讨了L-型钙通道激动剂FPL64176和拮抗剂Nifedipine对氟暴露致小鼠海马损伤的影响.海马组织抗氧化能力检测结果表明, 虽然Nifedipine对氟暴露致海马抗氧化酶GSH-Px和SOD活性降低的干预作用不明显, 但能显著地降低海马组织MDA含量.与氟暴露相比, 高/低氟和FPL64176联合暴露对海马细胞凋亡水平、L-型钙通道Cav1.2和Ca²⁺信号转导通路分子及下游凋亡调节相关分子表达水平的影响加剧；而高/低氟和Nifedipine联合暴露对海马细胞凋亡率和上述蛋白表达趋势有一定的逆转作用.这不仅进一步验证了L-型钙离子通道、Ca²⁺信号转导通路分子在氟暴露致海马损伤过程中的作用, 同时也提示, FPL64176对氟暴露有协同毒性作用, 而L-型钙离子通道拮抗剂Nifedipine对氟暴露致海马损伤则有一定的干预作用, 可能是一种新型有效的抗氟药物.

总之, 慢性氟暴露致海马损伤机理涉及多机制级联反应, 除氟致氧化应激外, 细胞凋亡异常和钙代谢失衡可能也参与了氟致脑损伤, 其具体的分子机制可能是(图 5)：慢性氟暴露使脑组织内氧化应激过强, 产生过多的自由基, 影响海马细胞膜, 使海马细胞膜L-型钙离子通道Cav1.2蛋白表达改变, 细胞内钙超载, 引起下游Ca²⁺-CaM-CAMKII信号转导通路功能异常, 使细胞核内核转录因子NF-κB表达异常, 促凋亡Bax蛋白表达水平升高, 抗凋亡Bcl-2蛋白表达水平下降, 细胞凋亡加剧, 最终损伤海马细胞, 而注射L-型钙离子通道拮抗剂(Nifedipine)能够逆转氟暴露致海马损伤, 可能是一种新型有效的抗氟药物.