2020, Vol. 40
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2. 山西农业大学, 食品科学与工程学院, 太谷 030801;
3. 广西水产科学研究院, 南宁 530021;
4. 安阳工学院, 生物与食品工程学院, 安阳 455000
2. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801;
3. Guangxi Academy of Fishery Sciences, Nanning 530021;
4. College of Biotechnology and Food Engineering, Anyang Institute of Technology, Anyang 455000
氟是机体正常生长发育必需的微量元素之一, 适量摄入对于预防龋齿、保持神经冲动传导、维持钙磷代谢等生理活动都具有非常重要的意义(Rojo et al., 2007), 但过量摄取也可能导致机体发生氟中毒, 造成多种组织、器官受损(Cao et al., 2013a; 2013b;Zhang et al., 2017; 年未未等, 2018; 田晓琳, 2018).我国部分地区地下水及地方性饮用水中氟含量高的现象颇为严重, 据报道, 我国氟中毒病区地下水中氟含量约是国家生活饮用水卫生标准的2~10倍(Zheng et al., 2006; 韩颖等, 2017; 刘春华等, 2018).一些学者对水氟含量过高导致的毒性效应进行了研究, 为进一步探讨氟中毒机制提供了基础(曹谨玲等, 2013; Cao et al., 2014;刘茂等, 2018; 马燕燕等, 2018; 刘忠慧等, 2018; 郭文静等, 2019).
鱼类等水生生物的生命活动都依赖于水环境, 因此, 高水氟对其造成的影响更直接.关于氟对鱼类的毒性作用国内外已经有了一些报道, 如Kumar等(2007)发现高浓度的氟能引起淡水雄性鲶鱼肌肉、肝脏和睾丸中的胆固醇水平显著升高；Bhatnagar等(2007)发现氟能够引起南亚野鲮鳃、肠组织的损伤；Cao等(2013)研究发现, 高浓度的氟可以造成鲤鱼肝、脑抗氧化能力的减弱并引起肝、脑组织的损伤；Chen等(2016)研究表明, 水氟能够干扰雄性斑马鱼甲状腺内分泌功能；Singh等(2017)研究指出, 氟暴露可以引起斑马鱼促炎反应减弱并能够诱导其体内细胞凋亡, 导致其易受细菌侵害.但有关氟对鱼类生殖功能的毒性效应研究却未见报道.鉴于此, 本试验选取毒理学常用实验动物斑马鱼为研究对象, 探讨氟对斑马鱼生殖功能的毒性效应, 以期为进一步探究氟对鱼类的生殖毒性机制提供科学资料, 并为氟的生态毒理学和风险评估研究提供一些可用的理论依据和资料.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验动物成年斑马鱼((0.278±0.031) g)购买于太原市花鸟鱼市场.在实验室水族箱中暂养一周, 从中挑选大小均匀、健康活泼的斑马鱼进行试验.试验于山西农业大学水产科学实验室进行.
2.2 主要试剂及仪器试剂：氟化钠(天津市天大化工厂)；苏木精、伊红(广东台山化工厂)；斑马鱼睾酮(Testosterone, T)、雌二醇(Estradiol, E2)、卵黄蛋白原(Vitellogenin, VTG)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海桥杜生物技术公司)；RNAiso Plus、反转录试剂盒、SYBR Green PCR kit(大连Takara生物工程公司)；其余试剂均为分析纯级.
仪器：切片机(KD-1508R, 浙江金华科迪仪器设备有限公司)；显微分析系统(RCH1-NK50i, 日本尼康)；匀浆仪(HFJ-10, 北京京晶科技有限公司)；酶标仪(iMark, 美国BioRad公司)；电热恒温培养箱(HPP-9162, 北京东联哈尔仪器制造有限公司)；冷冻离心机(Allegra 25R, 上海强智生物科技有限公司)；实时荧光定量PCR仪(Mx3000P, 美国安捷伦)；分光光度计(Nano Drop 2000, Thermo Fisher)；电子分析天平(AUY-120, 日本岛津)；全自动水质分析仪(Aquakem200, 芬兰赛默飞).
2.3 试验方法将斑马鱼随机分为3个试验组(雌雄分开)进行氟化钠暴露, 暴露浓度分别为0、40和80 mg·L-1, 每个暴露浓度设置3个平行组, 每个平行组投放斑马鱼20尾.试验期间自然光照, 定时定量投喂食物.
2.4 样品检测及方法 2.4.1 组织切片制备在试验45 d和90 d时, 每个平行分别取2尾鱼, 采集性腺组织并用Bouin′s液固定24 h, 流水冲洗后梯度酒精(75%、85%、95%、100%)脱水, 然后二甲苯透明, 常规方法制作石蜡切片, H.E染色中性树胶封片, 显微镜观察并拍照.
2.4.2 生殖相关激素测定在氟暴露45 d和90 d时, 每个平行分别取3尾鱼的性腺, 按照1:9(1 g组织:9 mL PBS缓冲液)的比例加入PBS缓冲液, 冰浴匀浆后4 ℃条件下3000 r·min-1离心20 min, 取上清液.用ELISA分析试剂盒测定睾酮、雌二醇及卵黄蛋白原的含量, 具体操作严格参照酶联免疫分析说明书进行.
2.4.3 生殖相关基因表达检测在氟暴露45 d和90 d时, 每个平行分别取3尾鱼, 解剖后取其性腺.冰浴匀浆后, 采用Trizol法提取总RNA, 进行纯度测定, 并采用凝胶电泳检验总RNA完整性.测定后的总RNA利用TakaRa一步法反转录试剂盒进行反转录, 具体操作按照试剂盒说明书进行.根据发表在NCBI上的基因序列, 采用primer3在线软件设计特异性引物, 相关引物序列见表 1, 内参基因为斑马鱼β-肌动蛋白(β-actin).实时荧光定量PCR具体操作步骤按照说明书进行.运用2-ΔΔCT方法进行基因表达量的计算.
| 表 1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 The primer sequences of genes for Q-PCR |
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采用SPSS19.0软件进行单因素方差(One-way ANOVA)分析和最小显著差数法(LSD)多重比较, 以p < 0.05表示差异的显著性.实验数据釆用平均值±标准差表示.
3 结果(Results) 3.1 氟对斑马鱼性腺组织显微结构的影响图 1结果显示, 对照组斑马鱼精巢组织精子分布比较丰富, 精子细胞、精母细胞、精原细胞分布较均匀(图 1a、1d).氟暴露45 d时, 与对照组相比, 40 mg·L-1氟暴露组斑马鱼精巢组织中精子数量减少, 精原细胞数量增加(图 1b)；80 mg·L-1氟暴露组斑马鱼精巢组织中精子数量比较稀少, 精原细胞、精母细胞数量有所增加(图 1c).氟暴露90 d后, 与对照组相比, 40 mg·L-1氟暴露组斑马鱼精巢中精子数量减少, 精原细胞、精母细胞数量有所增加(图 1e)；80 mg·L-1氟暴露组斑马鱼精巢组织中精子数量减少严重, 精原细胞、精母细胞数量明显增加(图 1 f).
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| 图 1 氟暴露45 d和90 d时斑马鱼精巢组织切片(a、b、c为45 d时组织切片, d、e、f为90 d时组织切片；a、d为对照组, b、e为40 mg·L-1组, c、f为80 mg·L-1组；Sg.精原细胞；Sc.精母细胞；St.精子细胞；Sz.精子) Fig. 1 Histopathological images of testes in male zebrafish after exposure to fluoride for 45 and 90 days |
图 2结果显示, 实验45 d时, 对照组斑马鱼卵巢中以初级卵泡和次级卵泡为主(图 2a、2d), 40 mg·L-1氟暴露组斑马鱼卵巢中次级卵泡数量有所减少而初级卵泡数量有所增多(图 2b), 80 mg·L-1氟暴露组斑马鱼卵巢中初级卵泡较多而次级卵泡数量较少(图 2c).实验90 d时, 40 mg·L-1氟暴露组斑马鱼卵巢中次级卵泡数量出现下降而初级卵泡数量增加(图 2e), 80 mg·L-1氟暴露组斑马鱼卵巢切片中初级卵泡增加明显而次级卵泡数量降低较为严重(图 2f).
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| 图 2 氟暴露45 d和90 d时斑马鱼卵巢组织切片(a、b、c为45 d时组织切片, d、e、f为90 d时组织切片；a、d为对照组, b、e为40 mg·L-1组, c、f为80 mg·L-1组；Pf.初级卵泡; Sf.次级卵泡) Fig. 2 Histopathological images of ovary in female zebrafish after exposure to fluoride for 45 and 90 days |
如图 3所示, 对于雌性斑马鱼, 与对照组比较, 45 d时80 mg·L-1氟暴露组E2含量及40、80 mg·L-1氟暴露组VTG含量均显著降低(p < 0.05)；90 d时40、80 mg·L-1氟暴露组E2含量均显著降低(p < 0.05), 80 mg·L-1氟暴露组VTG含量下降和T含量升高均显(p < 0.05).对于雄性斑马鱼, 与对照组比较, 45 d时80 mg·L-1氟暴露组E2、VTG含量均显著升高(p < 0.05)；90 d时80 mg·L-1氟暴露组E2含量升高和T含量降低均显著(p < 0.05).
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| 图 3 氟对斑马鱼生殖相关激素水平的影响(A1、B1、C1为雌性斑马鱼生殖相关激素变化, A2、B2、C2为雄性斑马鱼生殖相关激素变化, 不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)) Fig. 3 The changes of hormone levels in adult zebrafish after exposure to fluoride for 45 and 90 days |
如图 4所示, 对于雌性斑马鱼, 在实验45 d和90 d时, 80 mg·L-1氟暴露组Prg基因和GR基因表达水平较对照组和40 mg·L-1氟暴露组均显著升高(p < 0.05).与对照组相比, 在实验45 d和90 d时, 各暴露组AR基因和CYP19a基因表达水平均升高显著(p < 0.05)；与40 mg·L-1氟暴露组相比, 80 mg·L-1氟暴露组AR基因表达水平在90 d时显著升高(p < 0.05).
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| 图 4 氟对雌性斑马鱼生殖相关基因相对表达量的影响(不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)) Fig. 4 The expressions of reproductive-related genes in female zebrafish after exposure to fluoride for 45 and 90 days |
如图 5所示, 对于雄性斑马鱼, 与对照组相比, 40 mg·L-1氟暴露组Prg基因表达水平在45 d和90 d时均显著升高(p < 0.05), 80 mg·L-1氟暴露组Prg基因表达水平在90 d时显著降低(p < 0.05)；与40 mg·L-1氟暴露组相比, 80 mg·L-1氟暴露组Prg基因表达水平在45 d和90 d时均显著下降(p < 0.05).与对照组相比, 40 mg·L-1氟暴露组GR和CYP19a基因表达水平在45 d时均显著升高(p < 0.05), 而80 mg·L-1氟暴露组均无差异, 80 mg·L-1氟暴露组CYP19a基因表达水平在90 d时升高显著(p < 0.05)；与40 mg·L-1氟暴露组相比, 80 mg·L-1氟暴露组GR和CYP19a基因表达水平在45 d和90 d时均无明显差异.与对照组相比, 各暴露组AR基因表达水平在45 d和90 d时均显著下降(p < 0.05).
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| 图 5 氟对雄性斑马鱼生殖相关基因相对表达量的影响(不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)) Fig. 5 The expressions of reproductive-related genes in male zebrafish after exposure to fluoride for 45 and 90 days |
氟是动物机体生命活动过程中具有重要作用的微量元素之一, 但摄入过量氟化物会对动物的生殖系统产生损伤, 影响雄性动物精子数目、抑制雌性动物卵泡的发育(Dimcevici et al., 2013; Niu et al., 2015).本试验也发现, 氟暴露组雄性斑马鱼出现精子、精细胞减少现象, 雌性斑马出现卵巢中次级卵泡数量减少而初级卵泡数量增多的现象.吴培福等(2011)研究发现染氟组小鼠精子数量会减少, Huang等(2007)研究表明小鼠饮水给氟染毒8周后随着剂量的增加精子数量明显减少, Zhou等(2013)研究发现氟能够抑制卵泡发育, 唐文超等(2016)发现饲料中添加氟化钠会导致家蚕精子数量、卵细胞数目减少, 这与本实验观察到的现象相似.吴培福等(2011)研究发现, 小鼠饮水给氟染毒120 d后染毒小鼠出现生精细胞、次级精母细胞从生精上皮脱落, 部分细胞的胞膜破裂, 精子相互粘连的现象, 这在本试验中没有发现.这可能是由于剂量、动物品种、染毒时间长短的不同导致对组织器官的损伤程度不一样, 从而表现出的组织变化情况也不同.
许多污染物会扰乱内分泌系统、抑制激素的产生, 从而导致性腺和配子发育受到影响(张群芳, 2018; Cao et al., 2019).性激素的测定被认为是评估污染物生殖毒性最综合和最有效的方法之一(庄太凤等, 2017).本研究中, 随着氟暴露浓度的增加和时间的延长, 雄性斑马鱼出现睾酮(T)含量减低而雌二醇(E2)含量增加的趋势, 这可能是氟暴露破坏了机体内睾酮和雌二醇的平衡, 使睾酮通过一定的机制转化为雌二醇从而出现睾酮水平下降、雌二醇水平上升的现象(Demers, 2008；卢向明等, 2012).雌性斑马鱼出现雌二醇含量降低、睾酮含量增加的趋势, 这可能是由于氟抑制了卵泡的发育使卵泡成熟过程延长, 而雌性动物中的雌二醇主要来自于成熟卵泡(赵文鹏, 2019).这与已有的氟对性激素影响的报道基本一致(马晓英, 2007；孙发等, 2011；王飞清等, 2015；周进等, 2019).鱼类卵黄蛋白原(VTG)一般是在雌激素作用下于肝细胞合成, 经血液循环到达卵巢, 再通过微胞饮作用被卵母细胞吸收利用, 其积累程度是卵巢(卵母细胞)成熟发育的重要标志(Leonardi et al., 2010).正常情况下, 雄鱼和幼鱼体内几乎没有VTG, 但在污染物的干扰下也可生成, 因此, VTG被认为是内分泌干扰效应的一种敏感的生物标志(郑丽丽等, 2008).本研究中氟暴露组雌性斑马鱼VTG水平下降而雄性斑马鱼VTG水平上升, 这可能是氟暴露干扰了雌二醇的生成导致的.
Prg在雌、雄动物体内都具有重要的生理意义, 动物体内孕酮的作用效应不仅与孕酮本身的分泌与代谢有关, 还与Prg基因的表达与功能密切相关(包大鹏等, 2006；田二坡, 2007).在Prg基因的表达调控方面, 雌激素可以对其进行正调控, 孕酮则对其进行反馈性的负调控(Wan et al., 2006).本研究发现, 氟暴露后雌性成年斑马鱼体内Prg基因表达水平随氟浓度的增加呈现先降后升的趋势, 而在雄性成年斑马鱼体内则完全相反.这可能是低浓度氟暴露时, 动物体内雌激素(R)是保守的核受体家族中的一员, 与配子形成复合物后入核, 进而与糖皮质激素反应元件结合发挥其生物学效应(陈凯等, 2019).本研究发现, 氟暴露后雌性斑马鱼体GR基因表达水平随氟浓度的增加呈现先降后升的趋势, 且随着染毒时间的延长这种趋势程度更加显著.而雄性斑马鱼GR基因表达水平在45 d时呈先升后降趋势, 90 d时呈下降趋势.出现这种现象可能是由于在试验期间内, 雌性斑马鱼GR基因的表达主要受氟暴露浓度的影响, 即在低浓度时抑制其表达而高浓度时诱导其表达.而雄性斑马鱼受染毒时间和浓度两者的影响, 短时间低浓度氟暴露时为诱导作用, 而高浓度长时间氟暴露时为抑制作用.雄激素参与雄性动物的性成熟、精子发生, 也参与了雌性动物的性分化等生理学过程, 雄激素要与胞液中的雄激素受体(AR)相结合才能发挥作用, 很多因素通过影响受体亲和力、受体数量、受体传递信息的能力对受体的效应产生影响(张文栋, 2003).本研究中低浓度氟暴露对Pgr基因的表达具有正调控的效应, 而在高浓度时呈现负调控效应.糖皮质激素受体研究发现, 氟暴露下雌性成年斑马鱼AR表达水平整体呈升高趋势, 雄性成年斑马鱼AR表达水平变化趋势则相反, 而这种趋势与睾酮含量变化的趋势相吻合, 提示氟暴露可能通过影响雄激素受体AR表达来影响睾酮的功能, 从而对生殖产生影响.CYP19能够催化睾酮、雄烯二酮不可逆地转化为雌激素, 是雌激素生物合成过程中的关键酶和限速酶(王慧等, 2010).雌激素在时间和空间上的平衡对动物行使正常功能至关重要, 而芳香化酶的表达及功能调节会对雌激素的生成产生影响(Ksenia et al., 2008).本研究发现氟暴露后雌性成年斑马鱼CYP19基因表达呈现下降趋势, 而雄性成年斑马鱼CYP19基因表达则呈上升趋势, 且这两种趋势都随着氟暴露浓度的增加和染毒时间的延长而更加明显, 结合前面氟暴露情况下性腺组织切片观察和激素水平测定的结果, 推测可能是因为CYP19能够催化睾酮转化为雌二醇, 当CYP19水平在一定范围内上升时, 必然会导致睾酮含量下降和雌二醇含量上升, 而在这个过程中存在着反馈机制, 即当雌二醇含量达到一定值后, 会反过来抑制芳香化物酶的表达(王慧等, 2010).因此, 推断在氟暴露情况下, 雌性斑马鱼CYP19基因表达水平下降可能导致雌二醇合成受阻, 并影响到卵巢组织的发育, 而雄性斑马鱼CYP19基因表达水平上升可能会促使睾酮合成雌二醇, 并影响到精巢的发育.
5 结论(Conclusions)氟可通过影响斑马鱼生殖相关基因的表达来干扰性腺激素的含量, 进而影响性腺的发育.研究结果可为进一步氟影响斑马鱼生殖毒性效应机制提供基础资料, 同时为更深层次探讨该类污染物的生态毒性效应及风险评估提供科学基础.
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