2020, Vol. 40
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2. 辽宁大学环境学院, 沈阳 110036;
3. 中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院, 北京 100083
2. College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036;
3. School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, Beijing 100083
抗生素制药废水主要来源于抗生素生产过程中的结晶液、废母液、洗涤废水和冷却水(刘昔等, 2018), 其水质成分复杂、污染物含量高, 并且含有大量无机盐和难降解有机物, 处理难度大(张昱等, 2018).在生化处理过程中, 废水中的抗生素类污染物对生化处理系统中的微生物具有很强的抑制作用, 导致废水处理效能降低, 二级生化出水中往往残留一定浓度的污染物.此外, 抗生素类物质进入水环境中还会引发微生物产生耐药基因, 对生态环境安全危害极大, 近年来引起了广泛的关注(Aubertheau et al., 2017).
目前, 对抗生素制药废水的研究主要集中在高级氧化、水解等强化预处理, 以及耐药基因控制等方面(吴锡峰等, 2017；张昱等, 2018；陈宇溪等, 2018).陈尧等(2015)采用Ti催化臭氧化预处理酸性难降解制药废水, 废水COD去除率达到56.13%, 生物毒性大幅降低, 废水B/C比由0.199升至0.297, 可生化性明显提高.物化预处理虽然可以降低污染负荷、改善废水的可生物降解性, 但缺少选择性, 处理成本也相对较高, 处理后的出水仍需进一步的生化处理(张昱等, 2018).曝气生物滤池(BAF)是一种高效的废水深度处理技术, 以颗粒状填料及其附着生长的生物膜为主要处理介质, 不但具有物理吸附和生物降解的作用, 还能实现反应器内食物链的分级捕食(从丛等, 2009), 提高废水的处理效率, 常被用于废水的深度处理(刘玮等, 2018).
本研究针对某制药厂抗生素废水二级生化处理出水, 采用臭氧催化氧化-BAF组合工艺开展废水深度处理技术研究, 考察组合工艺对废水的处理效能, 分析废水中有机物的荧光变化特征, 并对不同运行阶段反应器内微生物菌群结构的动态变化特征进行分析, 以期为抗生素废水处理和工艺改进提供理论依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 水质条件试验用水为某抗生素制药企业废水生化处理出水, 水质如下：COD为203~262 mg · L-1, BOD5为23~43 mg · L-1, TOC为79~101 mg · L-1, NH4+-N为9~14 mg · L-1, pH为6.5~7.5, BOD5/COD(B/C)为0.04~0.15.试验用模拟废水组成如表 1所示.
| 表 1 模拟废水组成 Table 1 Simulated wastewater composition |
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臭氧预处理单元采用自制铈负载改性天然沸石催化剂, 天然沸石取自某沸石矿, 纯度大于93%, 粒度为200目, 采用浸渍法进行负载, Ce负载量为4%.臭氧催化氧化反应器出水进入BAF进行生化处理, BAF反应器内填充有粒径为3~5 mm的火山岩填料, 呈蜂窝多孔状, 有效高度为80 cm, 水力停留时间(HRT)为4 h, 气水体积比为4 : 1.接种污泥取自北京某污水处理厂MBR池好氧污泥, 经过驯化成熟后活性污泥浓度约为5000 mg · L-1, 试验装置示意图如图 1所示.
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| 图 1 组合工艺装置示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the combined process |
COD、NH4+-N、TN、SS均采用标准方法测定(国家环保总局, 2002)；BOD5采用5 d培养法测定；TOC采用TOC仪(Analytik Jena Multi N/C 2100, 德国)测定；溶液pH采用pH计(OHAUS Starter 3C, 美国奥豪斯)测定.其它分析方法如下所示.
2.3.1 溶解性有机物(DOM)荧光光谱分析处理前后废水中DOM的荧光特性采用三维荧光分析仪(HITACHI F-7000型, 日本)表征, 方法如下：①设定仪器测定参数为激发波长λEx=200~450 nm, 发射波长λEm=260~550 nm, 两波长的狭缝宽度均为5 nm, 步长均为5 nm, 扫描速度为2400 nm · min-1, 光电倍增管电压700 V；②样品经0.45 μm膜过滤, 再稀释10倍后装入1 cm石英样品池, 扫描废水样品的激发-发射光谱；③用Origin软件绘制色谱的二维等值图, 运用平行因子分析法分析水样中DOM的组成成分及其变化.
2.3.2 微生物菌群结构分析DNA提取和PCR扩增：好氧污泥微生物DNA提取参照Tiangen® soil DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech, 北京).PCR扩增细菌16S rDNA, 扩增引物为338F/806R, 即ACTCCTACGGGAGGCAGCAG与GGACTACHVGGG TWTCTAAT.采用20 μL反应体系：包括4 μL 5×Buffer, 2 μL 2.5 mmol · L-1 dNTPs, 0.8 μL前向引物, 0.8 μL反向引物, 0.4 μL FastPfu聚合酶(KAPA Biotech, 波士顿), 0.2 μL BSA, 10 ng模板DNA, 补ddH2O至20 μL, 放入PCR仪(ABI GeneAmp® 9700型, 美国).PCR扩增条件为：95 ℃解链3 min, 55 ℃退火30 s, 再72 ℃延伸10 min.每个样品的扩增均做3次重复.
Illumina MiSeq测序：从1.5%琼脂糖凝胶中回收扩增子, 参照MinElute DNA Gel Extraction Kit说明书进行纯化(Qiagen, 德国), 再用QubitTM (Invitrogen, 美国)进行定量.将纯化后的扩增子等量混合, 然后根据平台的标准流程进行双端(2×250 bp)测序, 比对Genbank数据库中序列.对所测序列按97%相似性划分为不同操作单元(Operational Taxonomic Units, OTUs), 进行后续数据分析.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 组合工艺处理效果 3.1.1 组合工艺处理效果分析在进水COD平均值为232 mg · L-1, NH4+-N平均浓度为12 mg · L-1, 进气臭氧浓度为50 mg · L-1, 臭氧进气量为600 mL · min-1, 催化剂用量为1 g · L-1, 水力停留时间(HRT)为4.0 h, 气水体积比为4 : 1的条件下, 选取模拟废水(Ⅰ阶段)、模拟废水与实际废水体积比为1 : 1(Ⅱ阶段)、模拟废水与实际废水体积比为1 : 2(Ⅲ阶段)、模拟废水与实际废水体积比为1 : 4(Ⅳ阶段)和实际废水(Ⅴ阶段)5种工况条件进行试验, 每个条件运行约15 d, 考察不同运行阶段组合工艺处理效果, 结果如图 2所示.由图 2可以看出, 经臭氧预处理后, 废水平均COD由232 mg · L-1降至132 mg · L-1, 臭氧催化氧化对水中污染物去除效果显著.这是因为臭氧催化氧化反应中, Ce改性沸石催化剂具有很强的催化活性, 能引发臭氧分解的链反应产生大量强氧化性· OH, 有效提升了废水中有机物的氧化去除效果.对废水的可生化性分析显示, 臭氧预处理后废水B/C由0.12升至0.28, 废水的可生化性得到显著提高.臭氧预处理单元出水进入BAF进行生化处理, BAF出水COD平均值为46 mg · L-1, 出水NH4+-N平均浓度为4.1 mg · L-1.在组合工艺运行后期, 进水全部为实际废水时, 氨氮去除效率略有降低, 主要原因是实际废水中污染物组分复杂, 对生物脱氮过程产生了一定的抑制作用, 但组合工艺出水水质可稳定达到《发酵类制药工业水污染物排放标准》(GB21903—2008).
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| 图 2 不同运行阶段废水COD和NH4+-N的去除效果 Fig. 2 The removal of COD and NH4+-N in different operation phases |
在进水平均COD为220 mg · L-1, 臭氧进气浓度为50 mg · L-1, 臭氧进气量为600 mL · min-1, 催化剂用量为1 g · L-1, 反应时间为120 min的条件下, 催化剂连续使用10次, 考察催化剂对抗生素制药废水COD的去除效果, 结果如图 3所示.由图 3可以看出, 制备Ce/NZ催化剂经过多次重复使用, COD平均去除率仍保持在43%左右, 处理效果没有明显降低, 这说明在试验条件下催化剂没有出现明显的失活现象, 催化剂的效果较为稳定.
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| 图 3 催化剂稳定性评价 Fig. 3 Evaluation of catalyst stability |
三维荧光光谱(EEMs)技术可以准确获取水体中DOM荧光组分的组成及浓度等信息(聂明华等, 2018), 与平行因子分析(PARAFAC)相结合可以把重叠的EEM光谱峰值反褶积到相应的独立分量中, 使每个分量成为具有相似荧光团的一类DOM, 从而实现对荧光组分的成分分解(Castillo et al., 2010), 具有快捷、不破坏样品结构、用量少、灵敏度高等优点(Nieto-Cid et al., 2006；虞杰等, 2018).
3.2.1 废水三维荧光光谱变化特征采用EEMs对工艺进水、臭氧预处理单元出水和BAF单元出水的光谱变化特征进行解析, 分析了不同样品的光谱峰位置、强度及荧光峰表征的物质, 结果如图 4所示.抗生素废水经臭氧催化氧化预处理后, 废水中A、B两个峰的荧光强度均大幅度下降；经BAF生化进一步处理后, 废水中A、B两个峰的荧光强度基本消失, 表明臭氧催化氧化和BAF组合工艺对废水中的荧光类有机物具有较好的去除效果.此外, 对单独BAF反应器处理抗生素废水时进水和出水的荧光光谱进行解析(图 5), 与组合工艺处理效果进行综合比对分析, 不同样品的峰位置、强度及荧光峰表征的物质结果如表 2所示.由表 2可以看出, BAF工艺出水荧光强度相较于组合工艺出水较强, 结果表明, BAF工艺的去除效率低于组合工艺.通过研究TOC值与A峰、B峰荧光强度的关系(图 6)发现, TOC值与A峰荧光强度的线性关系较强(R2=0.85), 高于B峰(R2=0.72), 这说明制药废水中TOC的降低与腐殖酸类物质的去除密切相关.
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| 图 4 进水(a)、臭氧单元出水(b)、BAF出水(c)三维荧光光谱图 Fig. 4 Three-dimensional fluorescence spectrum of the influent (a), effluent from ozone unit(b) and effluent of combined process(c) |
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| 图 5 进水(a)、BAF工艺出水(b)三维荧光光谱图 Fig. 5 Three-dimensional fluorescence spectrum of the influent (a) and the effluent(b) from independent BAF |
| 表 2 进水、臭氧单元出水和组合工艺出水三维荧光峰位置、强度及表征的物质 Table 2 The peak position, intensity and the representing substance by fluorescence peak |
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| 图 6 TOC值与荧光强度的关系 Fig. 6 Correlation between TOC and fluorescence intensity |
对样品进行平行因子分析, 共解析出3个荧光尖峰, 结果如图 7所示.组分1为腐殖酸和富里酸形成的混合物, 但未找出该荧光峰对应的确定荧光组分, 因为原水的EEM图谱中并未出现此峰, 此峰有可能是残留抗生素影响了荧光物质的表达或是前端生化处理过程中形成的中间产物.组分2(C2：λEx/λEm=245 nm/430 nm)反映了短波类腐殖酸的荧光性质, 且与富里酸类物质(λEx/λEm=220~250 nm/400~460 nm)接近(程庆霖等, 2014), 表明组分2主要是富里酸, 与多环芳烃等分子量大、芳构化程度高的难降解有机污染物有关.组分3(C3：λEx/λEm=335 nm/ 425 nm)反映了长波类腐殖质的荧光特性, 且与腐殖酸类物质(λEx/λEm=250~400 nm/380~500 nm)相似(黄廷林等, 2016), 表明组分3主要为腐殖酸(胡敏酸).
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| 图 7 PARAFAC模型识别出的3个不同的荧光组分 Fig. 7 three fluorescent components identified by the PARAFAC |
不同运行阶段污泥样品微生物菌群Alpha多样性指标如表 3所示.由表 3可知, 每个样品的Good′s coverage指数均在0.97以上, 表明高通量测序技术所建立的细菌文库可覆盖样品中绝大多数菌群.当BAF反应器中污泥处于Ⅰ阶段(模拟废水)时, Chao1指数、ACE指数、Shannon指数均较为接近, 说明在接种模拟废水时菌群的种类具有相似性.逐渐通入抗生素废水OTUs数明显下降, 微生物多样性指数有较为明显的降低趋势, 尤其在Ⅱ阶段(模拟废水与实际废水体积比为1 : 1)Shannon指数最低, 这说明在不同运行阶段废水中难降解有毒有机物对污泥影响较大, 造成Alpha多样性差异.此外, 对单独BAF工艺处理抗生素废水过程中群落特征进行分析, 结果显示微生物菌群结构未发生明显的变化.
| 表 3 不同污泥样品微生物菌群Alpha多样性指标 Table 3 Alpha diversity analysis of bacterial community structure in different sludge |
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试验采用聚类分析和主成分分析评估不同污泥样品微生物菌群结构的相似度, 即Beta多样性.不同运行阶段污泥样品微生物菌群结构聚类分析和主成分分析如图 8所示.由图 8可知, 不同污泥样品主要集中分布于3个象限, 其中, 阶段Ⅰ和Ⅲ的菌群结构集中于同一象限且距离较近, 阶段Ⅱ独自分布于一个象限, 阶段Ⅳ和Ⅴ中菌群结构集中在同一象限, 且阶段Ⅳ与Ⅰ的距离比其它阶段与Ⅰ的距离相比较远, 这说明随着实际废水比例的增多不同运行阶段菌群结构存在明显差异.
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| 图 8 不同阶段样品微生物菌群结构聚类分析(a)和主成分分析(b) Fig. 8 Microbial flora structure of sludge samples in different phases cluster analysis (a) and principal component analysis (b) |
不同运行阶段在门水平主要微生物菌群的相对丰度分布如图 9所示.从图 9可以看出, 在门水平共筛选出8个菌群, 其中, Proteobacteria(变形杆菌门)、Chloroflexi(绿屈挠菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)3个菌群为主要菌群(在抗生素废水中相对丰度>5%).Proteobacteria在不同运行阶段所占比例为63.25%~73.60%, 经实际废水驯化后污泥中Proteobacteria相对丰度增加了10.35%；在不同样品中Chloroflex和Firmicutes相对丰度之和为0.50%~28.04%, 接种实际废水后污泥中Firmicutes相对丰度增加了4.02%, Chloroflexi相对丰度下降了1.04%.
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| 图 9 不同运行阶段在门水平主要微生物菌群相对丰度分布 Fig. 9 Relative abundance distribution of Phylum level in samples with different water quality conditions |
Proteobacteria是主要的细菌群落, 占Reads的60%以上.革兰氏阴性变形菌包含多种好氧、厌氧和兼性细菌, 能降解多种有机污染物(Yang et al., 2015；Song et al., 2017).据NCBI中细菌来源得知, Chloroflexi在污泥厌氧条件下高度富集, 其主要降解多糖和氨基酸等细胞物质(Zhang et al., 2018), 同时在污泥水解酸化过程中降解蛋白(Song et al., 2019).随着运行条件的改变, Firmicutes相对丰度从0.54%(阶段Ⅰ)增加至5.42%(阶段Ⅴ), 这是由于Firmicutes可以产生芽孢, 能够抵抗外部极端环境, 并且Firmicutes及其附属菌群能够分泌一种降解废水中有机污染物的细胞外酶, 如纤维素、脂肪酶和蛋白酶, 水解污水中难降解有机物.此外, 本研究还发现了Chlorobi和Bacteroidetes菌门.Chlorobi相对丰度从3.25%(阶段Ⅰ)降至0.013%(阶段Ⅱ), 这说明Chlorobi受底物基质影响明显(Rotaru et al., 2010), 外部环境改变造成Chlorobi相对丰度下降.Bacteroidetes能够降解蛋白质、淀粉和纤维素等大分子有机物, 其相对丰度从15.50%(阶段Ⅰ)降低至5.49%(阶段Ⅱ).在门水平上, 不同运行阶段Actinobacteria(放线菌门)和Acidobacteria(酸杆菌门)菌群也被发现, 这两种菌群的相对丰度变化不大.
不同运行阶段在纲水平主要微生物菌群的相对丰度分布如图 10所示.由图 10可知, 在纲水平共筛选出12个菌群, 不同运行阶段主要类群(在抗生素废水中相对丰度>5%)包括：Gammaproteobacteria(γ-变形杆菌纲)、Alphaproteobacteria(α-变形杆菌纲)、Thermomicrobia(热微菌纲)、Flavobacteriia(黄杆菌纲)和Betaproteobacteria(β-变形杆菌纲).
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| 图 10 不同运行阶段在纲水平主要微生物菌群相对丰度分布 Fig. 10 Relative abundance distribution of Class level in samples with different water quality conditions |
不同运行条件下Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria所占相对比例分别为45.00%~56.20%、6.54%~12.32%和0.97%~10.50%.随着水质条件变化三者呈现出相反的变化趋势, 通入实际废水后Gammaproteobacteria的相对丰度增加16.20%, 占据Reads的55%以上, 不同水质运行单元Gammaproteobacteria均占主导地位, 这是因为Gammaproteobacteria能够生存在含盐环境, 且对PAHs具有降解作用(李慧星等, 2011).据此推测Gammaproteobacteria具有较强抗毒害作用.Betaproteobacteria的相对丰度增加9.67%, Sara等(2018)利用原液和废液中活性污泥提取3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯聚合物时发现, Betaproteobacteria是积累PHA的优势菌纲, 对PHA耐受性较强, 而本研究采用好氧模式驯化污泥, 大部分Betaproteobacteria适于在无氧条件下生存, 因此在长期选择过程中Betaproteobacteria相对丰度增加, 但无法成为系统中优势菌纲.Flavobacteriia(黄杆菌纲)是Bacteroidetes(拟杆菌门)下的重要功能微生物, 主要起水解作用(张楠等, 2016).通入制药废水后Flavobacteriia的相对丰度从12.97%降至0.69%, 说明随着反应器运行条件的改变对参与水解酸化过程中Flavobacteriia的菌群产生了一定的抑制作用.相对Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria而言, Alphaproteobacteria、Thermomicrobia(热微菌纲)和Flavobacteriia的相对丰度随水质条件改变总体呈现出降低趋势.总之, 在纲分类水平上, 随着系统中有机污染物浓度增多不同阶段污泥菌群结构及其相对丰度均发生了明显的变化.
本研究在属水平上采用heatmap图比较了接种抗生素废水前后前50个丰度相对较大菌群结构的差异(图 11).由图 11可知, 不同运行微生物菌群结构在属水平之间存在明显差异, 这说明微生物菌群结构受水质冲击影响较大.
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| 图 11 接种抗生素废水前后污泥样品在属水平上的heatmap图 Fig. 11 Head map of the genus level in sample with different water quality conditions |
在不同运行阶段, Thiothrix(发硫菌属)、Thermomonas、Pseudoxanthomonas(假黄单胞菌属)和JG30_KF_CM45为优势菌属(在抗生素废水中相对丰度均＞5%).Thiothrix均为有机好养降解菌(张楠等, 2016), 对多数有机污染物有良好的降解效果.经抗生素废水驯化后, Thiothrix的相对丰度达到最大值(36.04%), 这说明该运行条件下适合Thiothrix代谢.Pseudoxanthomonas的相对丰度从8.02%(阶段Ⅰ)增至10.04% (阶段Ⅱ), 对制药废水中的高毒有机物表现出一定的抗性, Wannarak等(2013)在采用Pseudoxanthomonas固定化RN402物种去除柴油的研究中发现, Pseudoxanthomonas能够通过生物膜稳定附着于材料表面表面, 主要降解正十四烷和正十六烷等高分子有机物.属于Proteobacteria(变形杆菌门)的Thermomonas主要是降解硝酸盐类物质(陆玉等, 2018；Bae et al., 2007), 其相对丰度从13.26%(阶段Ⅰ)降低至7.42%(阶段Ⅱ).本研究中, 不同运行阶段下Caldineaceae、Sphingopyxis(发酵单细胞菌属)、Comamonas(丛毛单胞菌属)、Flavobacterium(黄杆菌属)、Pseudomonas(假单胞菌属)、Bdellovibrio(蛭弧菌属)、Chryseobacterium(产吲哚金黄杆菌属)、Cloacibacterium、OPB-56及Sediminibacterium(沉积杆菌属)等菌属均有发现.刘充等(2015)研究发现, 在降解焦化废水中难降解有毒有机物(苯酚、吲哚、喹啉和吡啶)过程中, Pseudomonas是起主要作用的核心菌属.据此推测本研究中Pseudomonas参与了难降解有毒有机物方面的降解过程.Flavobacterium、Cloacibacterium、Chryseobacterium和Sediminibacterium均属于Bacteroidetes(拟杆菌门), 其中, Flavobacterium具有还原硝酸盐的能力且适宜在低温环境中进行新陈代谢作用, 随着水质条件的改变, 这些菌群无法适应新的水质环境导致相对丰度大幅下降甚至被淘汰.
4 结论(Conclusions)1) 采用臭氧催化氧化-BAF组合工艺处理抗生素制药废水, 在最佳运行条件下, 废水COD平均值由232 mg · L-1降至46mg · L-1, NH4+-N平均浓度由12 mg · L-1降至4.1 mg · L-1, 出水水质可稳定达到《发酵类制药工业水污染物排放标准》(GB21903—2008).
2) 荧光光谱分析结果表明, 试验用抗生素废水的三维荧光光谱中主要存在3种荧光峰, 分别为腐殖酸(C1：λEx/λEm=335 nm/425 nm)、富里酸(C2：λEx/λEm=245 nm/430 nm)和上述两种物质组成的混合物, 臭氧催化氧化可以显著去除废水中荧光类物质, 经组合工艺处理后荧光峰的强度基本消失.
3) 不同反应阶段, BAF反应器中微生物种群群落多样性和丰度存在较大差异.在门水平上, Proteobacteria(变形杆菌门)、Chloroflexi(绿屈挠菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)为优势菌门；在纲水平上, Gammaproteobacteria(γ-变形杆菌纲)、Alphaproteobacteria(α-变形杆菌纲)、Thermomicrobia(热微菌纲)、Flavobacteriia(黄杆菌纲)和Betaproteobacteria(β-变形杆菌纲)是不同水质条件下主要种群；在属水平上, Thiothrix(发硫菌属)、Thermomonas、Pseudoxanthomonas(假黄单胞菌属)和JG30_KF_CM45为优势菌属.
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