2020, Vol. 40
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随着城市水环境综合治理的大力推进, 城市河湖水系的景观功能越来越受到人们的重视.然而, 由于自净能力较差且易受到人类活动的影响, 城市景观水体易成为耐药菌的汇聚地, 利于耐药基因的进化和散播.例如, 北京市河流中存在四环素类和磺胺类耐药基因(Xu et al., 2016)；西安的浐河和灞河中检出多种四环素类耐药基因(张崇淼等, 2015)；江苏阜宁金沙湖中分离出的114株大肠杆菌的大部分都对四环素、氨苄西林、链霉素耐药, 从这些菌株中检出了29种耐药基因(Wang et al., 2013).
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是指能水解并灭活含氧亚氨基β-内酰胺类抗生素(包括单环β-内酰胺类抗生素和第三代头孢菌素), 并可被β-内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸)所抑制的一类酶(Bradford et al., 2001；Bevan et al., 2017).β-内酰胺抗生素是现有抗生素中使用最广泛的一大类, 产ESBLs细菌的出现无疑给抗生素的应用带来了巨大挑战.事实上, 由于β-内酰胺类抗生素的大量使用, 临床中出现的产ESBLs菌的种类和数量都不断增多.因此, 目前有关产ESBLs菌的报道集中在临床研究上(Moghaddam et al., 2012; Raoudha et al., 2016；宫海燕等, 2017；蓝惠华等, 2017；Ali et al., 2018; 宁兴旺等, 2018).有研究者关注了城市污水(李晴等, 2017)、水产和畜禽养殖废水(Ma et al., 2012；Blaak et al., 2015)中的产ESBLs菌和耐药基因, 但却鲜有关于城市景观水体中产ESBLs菌的报道.
随着生活水平的提高, 亲水活动越来越受到人们的欢迎.已有报道发现城市景观水体中存在沙门氏菌、铜绿假单胞菌、鸟型分枝杆菌等致病菌的相关基因(Cui et al., 2017), 这些致病菌可能会与产ESBLs菌发生基因交流, 从而给人类健康造成更大威胁.因此, 研究城市景观水体中的产ESBLs菌的含量、种属分布和耐药特性, 对城市水环境中细菌耐药性传播控制具有重要意义.
本研究选取西安市4处典型景观水体进行产ESBLs菌的分离鉴定, 测定其对5种主要抗生素的耐药性及其携带的β-内酰胺类耐药基因和I类整合子, 为深入认识城市景观水体中的产ESBLs菌的特性提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 水样采集本研究选取西安市有代表性的4处城市景观水体:丰庆湖、兴庆湖、思源湖和桃花潭, 进行水样采集和样品分析.丰庆湖和兴庆湖都是位于公园内的景观湖, 前者使用再生水作为补给水源, 后者利用地表水补水.思源湖是使用校园再生水补给的小型景观湖, 桃花潭则是景观河段, 有城市污水处理厂尾水汇入.
使用预先灭菌的采样瓶, 在水面下0.5 m采集水样, 在每处景观水体的多个位置采集后混合.每处景观水体采集5 L水样, 4 h内运回实验室, 4 ℃条件下冷藏, 并于24 h内完成预处理.从2018年5月—2019年4月, 对这4处水体进行逐月采样, 共采集样品48份.
2.2 细菌学指标检测采用滤膜法(Novo et al., 2013)测定水中的异养菌和粪大肠菌群含量.异养菌计数:将水样梯度稀释后, 真空抽滤通过0.45 μm孔径的混合纤维素滤膜, 将滤膜细菌截留面向上紧密贴在PCA培养平板上, 30 ℃培养24 h, 对菌落数量为20~200的培养平板进行菌落计数, 每份水样做2个平行样.使用菌落数量的平均值计算出每100 mL水样中的异养菌数量.粪大肠菌群:采用MFC平板, 44.5 ℃培养24 h, 计数呈蓝色或蓝绿色的菌落.对于每份水样, 随机挑取PCA平板上若干个异养菌菌落, 进行平板划线分离, 纯化出单菌株, 保存备用.
2.3 产ESBLs菌的确认和种属鉴定采用双纸片协同试验(周永年等, 2017；CLSI, 2018)进行产ESBLs菌的确认.使用大肠埃希氏菌ATCC25922作为质控菌株, 将分离得到的每株异养菌活化后, 均匀涂布在Mueller-Hinton琼脂(北京天根公司)平板上, 使用两种单独抗生素:头孢他啶(30 μg ·片-1)、头孢噻肟(30 μg ·片-1), 以及联合克拉维酸的复合制剂:头孢他啶/克拉维酸(30/10 μg ·片-1)、头孢噻肟/克拉维酸(30/10 μg ·片-1), 分别测定对每株菌的抑菌环直径.若任何一组复合制剂与单独抗生素的抑菌圈直径之差≥5 mm, 则判定为产ESBLs株, 否则为ESBLs阴性菌.
使用细菌基因组DNA小量纯化试剂盒(TaKaRa公司), 提取产ESBLs菌株的基因组DNA, 使用细菌通用引物27F:5′- AGAGTTTGATCCTG CCTCAG-3′和1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTA CGACTT-3′(Monika et al., 2018)对16S rDNA进行PCR扩增, 扩增产物纯化后送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 测序结果在NCBI中的GenBank数据库中进行序列比对, 确认其种属.
2.4 产ESBLs菌的耐药表型检测使用K-B纸片扩散法对产ESBLs菌进行药敏试验, 准确测量氨苄西林(AMP, 10 μg ·片-1)、四环素(TET, 30 μg ·片-1)、磺胺甲恶唑(SMZ, 300 μg ·片-1)、环丙沙星(CIP, 5 μg ·片-1)、头孢唑肟(CTZ, 30 μg ·片-1)产生的抑菌环直径, 根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)的标准(CLSI, 2018)进行耐药性判定.
2.5 耐药基因和I类整合子检测将提取的产ESBLs菌DNA作为模板, 利用PCR技术检测3种β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaCTX-M、blaSHV和I类整合酶基因intI.反应体系体积为25 μL, 其中模板DNA 2 μL, PCR Buffer 2.5 μL, dNTPs 2 μL, Taq酶0.2 μL(TaKaRa公司), 上下游引物各1 μL, 超纯水16.3 μL.PCR反应条件为:95 ℃预变性8 min, 95 ℃变性30 s, 退火30 s, 72 ℃延伸5 min, 总共循环30次, 扩增结束后, 使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测.各基因对应的引物和退火温度如表 1所示.
| 表 1 β-内酰胺类耐药基因和I类整合酶基因的引物、目的片段长度和退火温度 Table 1 Primer of β-lactamases resistance genes and class 1 integrase gene, the length of targeted fragment and annealing temperature |
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丰庆湖、兴庆湖、思源湖和桃花潭的异养菌含量均值分别为1.08×104、4.68×104、4.68×104和4.81×103 CFU · mL-1；粪大肠菌群含量均值分别为6.03×103、2.47×103、1.62×102和3.00×104 CFU · L-1(图 1).从时间上来看, 丰庆湖、兴庆湖和思源湖的异养菌含量都是在9月份之后开始升高, 至11月份达到峰值, 而桃花潭的异养菌含量未呈现出明显的季节性变化趋势.粪大肠菌群含量的变化较大, 且无统一的季节性变化规律.在桃花潭和思源湖中有多次未检出粪大肠菌群, 这可能与其接纳补给水的氯含量有关.
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| 图 1 城市景观水体的细菌学指标检测结果 Fig. 1 Results of bacteriological examinations in urban landscape waters |
从这4处景观水体共分离出385株异养菌, 其中产ESBLs菌19株, 占比为4.94%(19/385).每处景观水体都分离出90~100株异养菌, 产ESBLs菌占比为2.17%~9.47%(表 2).桃花潭中分离出的产ESBLs菌最多, 占比为9.47%；思源湖的产ESBLs菌占比最低, 仅有2.17%.
| 表 2 城市景观水体中的产ESBLs菌株 Table 2 ESBLs-producing isolates from the urban landscape waters |
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耐药表型分析见表 3, 结果显示, 这19株产ESBLs菌全部对CTZ耐药, 对AMP、TET和SMZ耐药的各有11株, 对CIP耐药的有6株.从耐药谱上看, 有7株菌仅对CTZ耐药, 5株菌对两种抗生素耐药, 11株菌对3种以上的抗生素耐药, 其中有5株对5种抗生素全部耐药.城市景观水体中分离出的产ESBLs菌中多重耐药菌占比高达57.89%(11/19).
| 表 3 19株产ESBLs菌株耐药谱 Table 3 Antibiotic resistance patterns of 19 ESBLs-producing isolates |
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这19株产ESBLs菌的种属鉴定结果如图 2所示, 共计6属10种, 具体为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、张洲芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)、扁平芽孢杆菌(Bacillus depressus)、异常嗜糖气单胞菌(Aeromonas allosaccharophila)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)和植生拉乌尔菌(Raoultella planticola).
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| 图 2 19株产ESBLs菌的种属和耐药表型 Fig. 2 The species and antibiotic resistant phenotypes of 19 ESBLs-producing isolates |
在这19株产ESBLs菌株中有8株都是大肠埃希氏菌, 且在5类抗生素耐药菌中均有出现.有5株来自芽孢杆菌属, 但它们集中在CTZ耐药菌中, 而大都对其他4种抗生素不耐药.肺炎克雷伯氏菌虽仅有1株, 但它对5种抗生素均耐药.
从丰庆湖分离出的5株产ESBLs菌是大肠埃希氏菌、植生拉乌尔菌、蜡状芽孢杆菌, 从兴庆湖分离出的3株产ESBLs菌是嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、乙酰微小杆菌, 从思源湖分离出的2株产ESBLs菌都是大肠埃希氏菌, 而在桃花潭分离出的产ESBLs菌数量和种类都是最多, 9株产ESBLs菌分别是大肠埃希氏菌、异常嗜糖气单胞菌、高地芽孢杆菌、张洲芽孢杆菌和扁平芽孢杆菌(图 3).
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| 图 3 各景观水体中的产ESBLs菌种属 Fig. 3 Species of ESBLs-producing isolates from urban landscape waters |
在本研究中, 3种β-内酰胺类耐药基因在大多数产ESBLs菌中都未检出.仅在从丰庆湖分离得到的1株产ESBLs植生拉乌尔菌中检出了blaTEM基因, 从兴庆湖分离出的1株产ESBLs肺炎克雷伯氏菌中检出了blaSHV基因.与之相反, I类整合酶基因intI在17株产ESBLs菌中都有检出, 检出率高达89.47%(17/19).
4 讨论(Discussion)在丰庆湖、兴庆湖和思源湖中的异养菌的含量均在9—11月出现了明显的增长, 这可能与持续多日的降雨有关, 有研究表明连续降雨形成的地表径流会冲刷路面和表层土壤, 将其中的细菌引入水体, 造成水体中异养菌含量升高(Young et al., 2013；Tornevi et al., 2014).然而, 在这段时期采集的上述景观水体水样中并未分离出产ESBLs菌, 这可能意味着景观水体中的产ESBLs菌与汇水区域的地表细菌并不存在必然联系, 但这还有待更深入的研究.每处景观水体中分离出来的产ESBLs菌种属不尽相同.丰庆湖、思源湖、桃花潭都分离出了产ESBLs的大肠埃希氏菌, 这些景观水体的补给水源都与污水有关(前二者都使用再生水补给, 桃花潭接纳污水厂尾水)；使用地表水作为补给水源的兴庆湖却未分离出产ESBLs的大肠埃希氏菌.景观水体中产ESBLs菌种属的差异可能与其补给水源有一定关系.
从城市景观水体中分离出的产ESBLs菌对AMP、TET和SMZ的耐药率较高, 而对CIP的耐药率相对较低.对AMP普遍耐药这一特性与临床中分离出的产ESBLs菌相似(Ni et al., 2016;Amenech et al., 2019).值得注意的是, 这些产ESBLs菌中有一半以上都是多重耐药菌.参照美国临床与实验室标准协会关于肠杆菌科和非肠杆菌科固有耐药性的资料(CLSI, 2018), 这11株多重耐药的产ESBLs菌株中仅有肺炎克雷伯氏菌对AMP为固有耐药, 其余抗生素均不在这些菌种所有野生菌株中的耐药谱中.由此可见, 城市景观水体中产ESBLs菌的获得性耐药不容忽视.
作为重要的可移动遗传元件(mobile genetic elements), 整合子能利用位点特异性重组机制进行基因的捕获和转移, 在耐药基因的传播中占有重要地位.大多数耐药菌具有Ⅰ类整合子结构(吴劲松等, 2011；Zhang et al., 2019), 由5′端(含有编码整合酶的基因intI)、3′端和可高度变异的中心区组成, 中心区可带有不同数量的基因盒.目前已在I类整合子中发现超过80种耐药基因盒, 几乎涉及所有的临床常用药物.一个I类整合子可带有多个耐药基因盒, 从而使细菌产生多重耐药性.本研究从城市景观水体分离出的产ESBLs菌株中近90%都携带I类整合子, 考虑到大量菌株呈现多重耐药性, 故可以认为I类整合子在这些菌株的获得性耐药方面发挥着重要作用.
从城市景观水体分离得到的产ESBLs菌株中3种主要β-内酰胺类耐药基因检出率很低, 这与部分临床研究结果(左江华等, 2016；Ji et al., 2019)并不一致.根据临床研究的经验, blaTEM、blaCTX-M和blaSHV在产ESBLs菌株普遍存在(Dallenne et al., 2010), 但也有研究者发现blaOXA、blaPER、blaVEB、blaGES、blaSPO等β-内酰胺类耐药基因在临床分离出的铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌中常有检出(Jacoby et al., 2005).Monika等(2018)对从河流中分离的产ESBLs菌进行β-内酰胺类耐药基因检测, 结果表明blaOXA基因检出率远高于blaTEM、blaCTX-M和blaSHV基因.从城市污水厂分离出的产ESBLs大肠杆菌携带blaOXA、blaPER、blaIMP等多种类型的β-内酰胺类耐药基因(Aristizábal et al., 2019).水环境与临床环境有明显差异, pH、温度等环境因素会对耐药基因的进化和散播产生影响(郭业彬等, 2010).因此, 城市景观水体中的产ESBLs菌株携带的耐药基因的确可能与临床环境中的有较大区别.
5 结论(Conclusions)1) 四处景观水体共分离出19株产ESBLs菌, 在异养菌中的占比为4.94%.各景观水体分离出的产ESBLs菌株共计6属10种, 以大肠埃希氏菌为主.
2) 景观水体中的产ESBLs菌大都对氨苄西林、四环素和磺胺甲恶唑耐药, 多重耐药菌占比高达57.89%.近90%的产ESBLs菌株携带I类整合子, I类整合子可能在产ESBLs菌株的获得性耐药方面具有重要作用.
3) 临床中常见的blaTEM、blaCTX-M和blaSHV基因在这19株产ESBLs菌中的检出率很低, 景观水体中产ESBLs菌株携带的主要β-内酰胺类耐药基因与临床产ESBLs菌有明显区别.
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