环境科学学报  2020, Vol. 40 Issue (8): 2690-2699
引用本文
袁林江, 马切切, 赵杰. 2020. 宏组学方法及在污水生物处理系统研究中的应用[J]. 环境科学学报, 40(8): 2690-2699.
Yuan L J, Ma Q Q, Zhao J. 2020. Meta-omics and its application in biological wastewater treatment system[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 40(8): 2690-2699.
宏组学方法及在污水生物处理系统研究中的应用    [PDF全文]
袁林江, 马切切, 赵杰    
西安建筑科技大学, 陕西省环境重点实验室, 西北水资源环境与生态重点实验室, 西安 710055
收稿日期: 2020-01-19; 修回日期: 2020-04-13; 录用日期: 2020-04-13
基金项目: 国家自然科学基金项目（No.51878538）
作者简介: 袁林江(1966-), 男, 教授(博士), E-mail:yuanlinjiang@xauat.edu.cn
摘要：近年来随着测序、质谱等技术的高速发展，基于核酸分子信息为基础的包含宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白组学与代谢组学等核心内容的生物分子宏组学方法逐渐成熟，成为揭示污水生物处理系统中的关键微生物菌群结构和功能特征的有力工具，也在检测污水系统中多种ARGs以及探究其传播机制上发挥出无法替代的巨大优势，在污水生物处理研究中应用宏组学，对于深化认知污水处理系统本质、提高污水处理效率以及控制ARGs在环境中的传播具有重要指导意义.本文对宏组学方法进行了简单的介绍，着重综述了其在污水生物脱氮、强化生物除磷及探究抗生素抗性基因等方面的进展，并展望了其在污水生物处理系统中的广泛应用前景.
关键词：污水处理    宏组学    菌群结构    脱氮除磷    抗生素抗性基因    
Meta-omics and its application in biological wastewater treatment system
YUAN Linjiang, MA Qieqie, ZHAO Jie    
Key Laboratory of Northwest Water Resources, Environmental and Ecology, Ministry of Education, Key Laboratory of Environmental Engineering of Shaanxi Province, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055
Received 19 January 2020; received in revised from 13 April 2020; accepted 13 April 2020
Abstract: In recent years, with rapid development of sequencing and mass spectrometry technologies, molecular meta-omics based on nucleic acid molecular information including metagenomics, metatranscriptomics, metaproteomics and metabonomics gradually establishes up, and becomes an important tool to reveal the structure and function characteristics of key microbial community of biological wastewater treatment system. It also plays an irreplaceable role in detecting various ARGs and exploring their transmission mechanism, which is of importance for deepening recognition of the essence of biological wastewater treatment system, improving treatment efficiency and controlling ARGs spreading in environment. This paper introduces the development of meta-omics approaches and summarizes its applications in biological denitrification, enhancement of biological phosphorus removal and exploring ARGs, and looks forward to its more application prospects in biological treatment system in the future.
Keywords: biological wastewater treatment    Meta-omics    microbial community structure    nitrogen and phosphorus removal    antibiotics resistance gene    
1 引言(Intoduction)

污水生物处理技术的核心是利用生物处理系统中微生物生命代谢活动分解、转化污水中的污染物, 从而降低污染物浓度(Chen et al., 2014)；其本质是微生物在复杂生态系统中发挥功能性工程化应用过程, 其中关键微生物决定了污染物的去除与功能的实现关系, 因此对系统中的微生物菌群结构进行深入探究对污水处理厂生物处理系统设计、净化效能的提升具有重要指导意义.同时, 污水生物处理系统作为一个连接人类活动和自然生态系统的重要节点, 汇聚了来自人类生活、医疗、工业和养殖等多种污水, 是抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)巨大储存库以及转移热区, 对污水生物处理系统中ARGs进行深入探究, 了解其特征以及传播机制有益于控制ARGs在环境中的传播, 降低其对人类健康的威胁.

人类对于污水生物处理系统中微生物菌群结构以及ARGs的认知随着研究方法的发展逐步深入.传统培养方法只能检测到其中1%~15%的微生物(Zhu et al., 2007), 但随着一系列基于免培养的分子生物学技术的出现, 生物处理系统中菌群的复杂性和多样性以及ARGs的种类和特征以惊人的速度被人们认知.近年来, 基于以DNA、RNA、蛋白质等生物大分子作为研究对象的宏组学技术(meta-omics)成为探究污水生物处理系统有效技术之一, 各组学技术的长足发展以及联合使用赋予了污水生物处理技术新的内涵, 在全局的角度从不同水平对污水生物处理系统中的微生物进行分析, 为揭示复杂污水生物处理系统体系内群落结构、功能多样性及二者之间的关系、发掘未知的功能基因/物种、检测多种ARGs等方面提供了强有力的工具.本文对宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白组学及代谢组学等宏组学方法进行了介绍, 综述了近年来宏组学方法在揭示污水生物处理系统污水生物脱氮、强化生物除磷菌群以及抗生素抗性基因等方面的研究进展, 展望了宏组学方法在污水生物处理系统的应用前景及面临的一些挑战.

2 宏组学方法(Meta-omics) 2.1 宏基因组学

宏基因组(metagenome, 也称元基因组)是由Handelsman等(1998)于1998年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”, 即生境中全部微小生物遗传物质的总和.而宏基因组学(metagenomics)则是研究宏基因组的一门新兴学科, 它将环境中的所有微生物看作一个整体, 在基因组的水平和微生物群落的层面上, 利用分子生物学的技术进行统一的检测和分析来研究微生物群落组成和多样性、微生物群落功能、以及微生物与环境的相互作用等内容(邓晔等, 2016).目前, 该组学方法已经广泛应用于海洋环境(王丹等, 2018; 冯晓远等, 2019)、人类健康(王原飞, 2018；李旺等, 2018)、生物修复(薄明森, 2018；王启全, 2019)和资源开发(安迎锋, 2018)等多个领域.本文主要对其在污水生物处理系统中的研究进行了阐述, 展示其污水处理系统广泛的应用前景.

宏基因组学分析流程如图 1所示(Quince et al., 2017), 主要包括以下步骤：①样品的收集处理和测序.目前, 宏基因组学中的微生物高通量检测方法主要有2种, 即高通量测序技术和基因芯片技术.在高通量测序技术里, 罗氏454测序技术和Illumina测序技术是目前应用最为广泛的技术.②数据评估与质控.数据评估是指对原始数据质量值等信息进行统计, 并使用FastQC、MultiQC等软件对样本的测序数据质量进行可视化评估.质控指测序得到的原始数据, 里面含有带接头的、低质量的序列.为了保证信息分析质量, 必须对原始数据过滤, 得到Clean数据, 在该过程中经常使用Trimmomatic、Khmer等软件进行数据处理.③序列分析.基于组装的序列分析可以构建多个全基因组, 且可以解析没有序列亲源的全新生物基因组, 也可以通过完全组装的基因组将代谢与系统发育联系起来, 但该方法仅适用于具有足够覆盖的生物体以进行组装和分箱且在复杂的群中, 只有一小部分基因组可以通过组装来解决.基于读长的序列分析可以提供功能群落或结构的汇总图但仅基于有效比对到参考数据库的部分读长.该方法可以高效执行, 实现大型荟萃分析, 但无法解析无近亲生物的基因组, 通常可以仅解决群落的聚合代谢, 并且只有在已知参考基因组的背景下才能与系统发育相关联(Quince et al., 2017).该步骤根据实验目标采取其中一种或者两者相结合的方法进行分析.④统计和后处理分析.⑤验证：高维生物学数据的结论易受研究驱动的偏差影响, 因此后续验证至关重要.

图 1 宏基因组分析流程概述(Quince et al., 2017) Fig. 1 Summary of a metagenomics workflow
2.2 宏转录组学

1997年, Velcuescu等(1997)在研究酵母基因表达时提出转录组这个概念, 即特定的细胞在某一功能状态下全部表达的基因总和, 代表一个基因的遗传信息和表达水平.宏转录组学(metatranscriptomics)则是一门利用近年发展起来的RNA-Seq技术在整体水平上研究某一特定环境、特殊时期微生物群落中全基因组转录情况及转录调控规律的学科.作为一种新的研究方法, 其利用全部基因的表达调控、蛋白质功能等信息来解决生物学问题, 将基因组学研究带入了一个高速发展的时代.

利用RNA-Seq技术进行宏转录组研究分析时, 主要包括以下几个步骤(王楚彪等, 2014)：①样品总RNA的提取和mRNA的富集.②利用纯化的mRNA反转录构建cDNA片段文库, 目标mRNA被随机打断并反转录成cDNA或者先进行反转录后再随机打断, 之后在文库各片段两端加上测序接头, 进行高通量测序.③测序数据分析：一般包括对原始数据进行质量控制, 获取可用于下游分析的高质量序列；对高质量序列进行宿主RNA和细菌的核糖体RNA序列剔除, 得到mRNA的转录本序列集；对每个样本进行基因预测, 对序列进行物种、功能注释, 获得种及种以下精细水平的物种组成谱以及各功能类群的丰度图谱并进行差异比较、聚类、物种组成、代谢通路富集等分析.

2.3 宏蛋白组学和代谢组学

2004年, Rodriguez-Valera等(2004)根据宏基因组学的概念提出了宏蛋白质组学(metaproteomics, 或称元蛋白质组学), 认为宏蛋白组学指环境混合微生物群落中所有生物的蛋白质组和.该组学主要阐明生物体中所有蛋白质的表达和功能模式, 分析细胞内动态变化的蛋白成分、表达水平与修饰状态, 了解其相互之间的作用和联系.随着液相色谱和高分辨率质谱技术的发展, 宏蛋白组学方法广泛应用于多个方面, 使研究人员能够解决一系列问题(图 2(Kleiner et al., 2019))：①宏蛋白组学是研究微生物群落时空表征的有效方法之一, 借助一个精确的蛋白质序列数据库, 人们可以知道这些蛋白质属于哪个物种(或者更高级的分类群, 如属、科等), 并进一步理解群落中不同成员的功能角色和相互作用.②由于蛋白质是维持细胞功能的直接效应子, 检测它们的丰度有助于分子水平上解析细胞的表型信息.③蛋白质组数据除了可用于识别不同人工或自然环境下单个基因表达的变化, 还可以通过计算每个成员的生物量来分析群落结构.此外, 宏蛋白质组学方法产生的高分辨率质谱数据也可以用来分析某个蛋白质和物种的同位素含量等.

图 2 宏蛋白质组学目前能够解决的问题(Kleiner et al., 2019) Fig. 2 Questions that can or will be addressed with metaproteomics

代谢组学(metabolomics)的概念是1999年由Nicholson等(1999)首次提出, 是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的一门新兴学科, 它以生物系统中的代谢产物(由于实际分析手段的局限性, 目前主要针对相对分子质量1000以下的小分子)分子为对象, 以核磁共振(Nuclear magnetic resonance, NMR)、液相色谱串联质谱(Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)和气相色谱串联质谱(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)等为手段来分析生物体系受刺激或扰动后代谢产物的变化规律或其随时间的变化规律(刘伟等, 2018).其主要研究策略有两种：靶向代谢组学和非靶向代谢组学, 前者具有高度特异性, 可以对预先选定的代谢物进行检测定量；后者是全面的、非特异性的, 允许对广泛的代谢物无偏检测, 旨在同时分析尽可能多的代谢物, 有助于揭示新的代谢途径或生物标志物(Patti et al., 2012).

3 宏组学在污水生物处理系统中的应用(Application of meta-omics in biological wastewater treatment system)

随着测序和质谱等技术的飞速发展, 宏组学方法成为研究复杂微生物群体的有力技术之一, 在污水生物处理领域的应用愈加广泛(近年来关于污水领域的宏组学文章发表数量及趋势见图 3, 案例见表 1).宏基因组学以特定污水生物处理系统中全部微生物的DNA为研究对象揭示物种的多样性及其基因潜力, 推动了污水治理领域研究的发展；宏转录组学以系统中总mRNA为研究对象揭示生物处理系统中微生物群落的基因表达与调控, 不仅限于认识微生物相关基因, 还可以认识微生物群落的代谢活动, 为污水生物处理系统中微生物群落研究带来了新的变革(崔凯等, 2019)；宏蛋白组学随着污水生物处理系统中微生物宏基因组数据库的逐步完善, 在污水生物处理工艺研究领域中的应用也日益广泛, 在鉴定功能性蛋白质/酶、揭示污染物生物降解机制、污水生物处理关键代谢途径、微生物群落的生态变化等研究方面起巨大作用(胡少达等, 2016)；代谢组位于基因表达调控的下游, 上游大分子物质(核酸, 蛋白质等)的功能性改变最终均体现在代谢层面, 所以代谢组提供的是生命活动的最终信息, 能够更加真实的反映功能水平上的改变(李霜等, 2018).

图 3 宏组学之污水处理领域近15年发表文章统计 Fig. 3 Publication statistics of meta-omics for wastwater in recent 15 years

表 1 宏组学在污水生物处理系统微生物群落研究中的应用 Table 1 Applications of meta-omics in investigation of biological wastewater treatment systems

另外, 当单一组学不能解释全部生物问题时, 学者们逐渐从整体的角度出发, 将多种组学相整合应用到科学研究和实际应用中去.多组学的联合使用, 可以从全局的角度对不同水平下污水生物处理系统微生物的群落结构及功能进行解析, 获得新的功能性微生物及功能性代谢产物资源, 并且可以深入了解ARGs的特征以及转移机制, 为污水处理的进一步发展提供新的研究动力和方向.例如, 将宏基因组和宏转录组学结合可能揭示微生物特定功能的过度表达或表达不足, 在某些情况下还可能揭示特定生物体的活动(Aguiar-Pulido et al., 2016).Yu等(2012)对香港某城市污水处理厂活性污泥的微生物进行研究时, 发现DNA和cDNA数据集之间微生物群落组成和基因表达存在差异；进一步以脱氮为重点的基因表达注释显示, 在DNA和cDNA数据集中, 脱氮相关基因序列均占主导地位, 而硝化基因也有相对较高的表达水平, 特别是氨单加氧酶和羟胺氧化酶的cDNA/DNA比值较高, 说明硝化活性较强.

Crovadore等(2017)基于Illumina HiSeq平台, 采用宏基因组学和宏转录组学研究了好氧污泥颗粒中微生物群落结构演替和氮代谢相关的7种酶对应编码基因的表达水平.研究表明, 宏转录组学可以提供功能代谢信息并识别优势活菌, 与宏基因组学信息互补.目前研究还表明将宏基因组学、代谢组学相结合可以使人们深入了解微生物群落的成员之间以及与环境之间的相互作用, 并有可能将基因表达的功能变化归因于微生物群落中的特定成员(Aguiar-Pulido et al., 2016).通过多组学数据集成、建模分析等方法也为挖掘未知的物种、基因提供了可能性.Muller等(2013)指出通过组学数据集成分析将会得到基因表达、代谢物丰度和其他功能属性的动态伴随模式, 从而有助于发现以前未知的特定微生物群落成员的特征.Roume等(2015)基于建模分析组学数据方法开发了一个重建群落代谢网络框架, 通过构建的复杂微生物系统的代谢网络来整合结构和功能测量, 从而识别关键功能的基因, 而这些基因又可以与重要的功能物种联系起来.这些潜在的‘Keystone基因’最终可以充当驱动节点, 来控制复杂的生物系统.本文主要介绍了宏组学方法在污水生物脱氮、强化生物除磷微生物种群以及抗生素抗性基因方面的研究进展.

3.1 在污水生物处理系统脱氮种群中的应用

氮含量超标是造成水环境污染的重要因素.如水体富营养化, 这不仅会降低水体中物种多样性及稳定性、还会危害人类生命安全、造成重大经济损失, 因此去除水体中的氮物质极为重要(赵贝贝等, 2018).生物脱氮(biological nitrogen removal, BNR)作为一种高效的生物处理方法, 相比于其他物理化学处理方法, 具有效率高、能耗低和运行费用少等优点(彭永臻等, 2019).随着分子生物学技术的发展, 宏组学方法成为研究污水生物处理系统中脱氮菌群的有力方法, 与依赖显微镜观察、培养分离或低通量的传统微生物学研究方法不同, 宏组学方法实现了对污水生物处理系统中脱氮微生物既全面又系统的认识, 从微生物层面为提高污水中氮的去除提供科学指导, 对水环境的改善具有重大意义(鞠峰等, 2019).

传统的污水生物脱氮主要通过硝化和反硝化作用来实现, 多样性的微生物种群参与氮的转化过程.Peng等(2019)为了探求复杂微生物群落对污水处理厂污水中污染物去除的重要作用, 在Illumina HiSeq 4000平台进行宏基因组测序分析, 探究了污水处理厂中生物脱氮系统中的微生物群落的多样性、功能菌种以及主要的代谢途径.研究结果表明污水生物处理系统中含有超过2135个属, 具有较好的物种多样性, 能较好地支撑污水处理厂处理的性能；Proteobacteria、Bacteroidetes、Nitrospirae等是微生物中主导的细菌门; Nitrosomonas、Nitrospira和Thauera是检测到的典型的AOB、NOB和反硝化菌, 同时检测到的其他反硝化功能菌Dechloromonas、Pseudomonas、Terrimonas较好地解释了BNR系统脱氮效果, 同时发现污泥中含有生物脱氮相关酶的功能基因和固氮酶功能基因, 对于理解活性污泥中氮代谢途径提供了数据支撑.厌氧氨氧化作为一种节能的污水脱氮技术受到广泛关注, 了解厌氧氨氧化菌的进化关系、生理特性及代谢途径对于Anammox技术应用非常关键.由于无法获得纯培养Anammox菌, 宏组学技术成为研究Anammox 菌功能基因和代谢特征的有效手段. Lawson等(2017)联合宏基因组学和宏转录组学研究了厌氧氨氧化系统, 获得了17个厌氧氨氧化菌和异养菌的基因组草图, 结合功能菌群的代谢重建及相关基因的表达揭示其潜在的生态作用和相互作用.Li等(2019)利用宏组学方法研究了大型城镇污水处理厂中缺氧—载体生物膜上厌氧氨氧化作用的脱氮机理, 以及厌氧氨氧化与反硝化作用之间的关系, 研究表明缺氧MBBR与AAO系统的结合使用有助于污水处理过程中厌氧氨氧化细菌的原位富集, 从而增加污水中氮素的去除效率, 为厌氧氨氧化工艺在城镇污水脱氮处理方面的应用提供了新的思路.Li等(2020)考察了两个厌氧氨氧化颗粒污泥反应器在典型的低NLR(0.8 kg·m-3·d-1)或高NLR(10.5 kg·m-3·d-1)条件下的运行情况.采用宏基因组学方法研究了脱氮性能与脱氮基因类型、丰度及相关基因在丰富基因组中的分布关系.对该群落的优势成员包括厌氧氨氧化细菌(AnAOB)和其他成员的分类学分布、丰度和基因型进行评估.利用这些信息评估了微生物群落与两个厌氧氨氧化反应器中氮转化性能之间的关系.这些结果为颗粒污泥厌氧氨氧化过程中负荷率如何影响性能和群落结构提供了更深层次的见解, 有助于开发先进的厌氧氨氧化过程操作技术.

3.2 在污水强化生物除磷种群中的应用

强化生物除磷(EBPR)系统因具有良好的除磷效果而广范应用于污水处理, 其效果受运行条件影响, 也与系统中微生物群落结构息息相关, 因此, 要想实现EBPR高效稳定运行需要深入了解系统内的主要功能微生物及其作用机制(成敏等, 2018).随着分子生物学技术不断发展, 人们能够对EBPR工艺中的除磷微生物群落及其在系统中的代谢活动与生态功能等进行研究.如采用PCR-DGGE、T-RFLP、FISH等技术, 深入研究EBPR系统中的生物群落及其间关系, 进而研究其代谢机理.但PCR-DGGE、T-RFLP只能分析系统中的少数优势菌群, 要对系统中所有微生物的种群结构进行分析还存在较大困难.FISH技术需要有特异性探针, 且探针价格昂贵, 要对大量微生物进行鉴定及对群落丰度变化进行研究, 其操作步骤麻烦, 数据统计较难, 定量不够准确(李俊基等, 2015).宏组学技术则可以在一定程度上弥补以上研究的不足, 其可以研究EBPR系统中的菌群结构, 并将微生物菌群研究精确到种, 同时可研究微生物在系统中相互作用, 深入了解微生物作用机制, 为EBPR系统稳定运行及高效除磷提供科学指导.

在最近几年的研究中, Gao等(2019)报道了EBPR生物处理系统中两个Clade IA和IC成员的菌株的基因组草图.Cheng等(2018)以SBR除磷反应器为研究对象, 采用宏组学方法解析了系统主导菌群, 对聚磷菌(PAOs)和聚糖菌(GAOs)等功能菌群的丰度组成和其与系统关系进行了研究, 并对稳定运行阶段系统中功能基因及其与功能菌群间关系进行分析, 探讨了功能菌群及其功能基因在污水生物除磷系统中的作用, 为提高EBPR系统的除磷稳定性提供理论基础. Zhang等(2019)对稳定运行400多天的DS-EBPR系统进行宏组学分析, 该系统能够实现稳定的硫驱动的反硝化除磷.在磷转化过程中, 多磷酸激酶(ppk1)和外多磷酸酶(ppx)分别参与Poly-P的聚集和降解, 系统发育分析发现在DS-EBPR系统中ppk1基因遍布于5个门中(Proteobacteria, Firmicutes, Chlorobi, Chloroflexi和Bacteroidetes).此外, 发现一些与硫转化相关的细菌富含ppk1基因, 如SOB(Thiobacillus和Chlorobium)和SRB(Desulfobacter和Geobacter), 表明它们也在Poly-P聚集中起作用.该研究为DS-EBPR系统在污水处理中的优化应用提供了污染物去除机理的依据, 阐释了S相关的PAOs之前不为人知的生态作用.

3.3 在污水生物处理系统抗生素抗性基因研究中的应用

抗生素自发现以来为人类防治细菌感染做出了重大贡献, 然而随着抗生素的长期大量使用和滥用, 抗生素耐药性问题日趋加剧, 不断威胁人类健康, 已经成为全球最严峻的公共卫生问题之一.ARGs已被广泛认为是一类新型环境污染物, 与传统化学污染物不同, 抗性基因污染属于生物污染, 不仅会在不同环境介质中持久性残留、转移和扩散, 而且具有暴发性的特征, 一旦失控, 将严重威胁公共安全(安新丽等, 2019).污水生物处理系统每天接收和处理成千上万吨来自于人类生活污水、医疗废水、工业废水和养殖废水等污水, 人类粪便、动物排泄物、制药厂出水以及医院出水中含有大量的ARGs, 这些污水汇聚到污水处理厂, 使污水生物处理系统成为巨大的抗性基因库, 同时也成为ARGs的转移热区, 因此对污水生物处理系统中ARGs进行深入探究十分必要.

污水生物处理系统中ARGs检测方法主要分为传统微生物培养法和分子生物学方法(胡海燕等, 2019).传统微生物培养法操作简单、成本低, 但通常是耗时、费人力的, 且其最大的局限在于复杂环境中仅有少量的微生物是可培养的, 经常存在一些假阴性和假阳性结果等, 因此该方法的应用越来越少(张怡淼等, 2019).分子生物学常用方法包括PCR、宏基因组学等方法.经过PCR技术改良的q-PCR在基因扩增的过程中, 通过对荧光信号进行追踪, 更直观的反映不同水体中ARGs的浓度、分布以及迁移传播等途径, 也因此成为检测ARGs最常用检测手段；但其与宏基因组方法相比只能用于检测已知序列基因的丰富度, 并且存在PCR扩增偏好性和引物偏好性高、引物依赖性高等缺点(王荣昌等, 2017).宏基因组学检测方法克服q-PCR等技术存在的缺点, 可以获得环境中所有抗性基因的序列信息, 能够探索和发现污水生物处理系统中更广泛的ARGs, 捕获更完整的ARGs图谱, 为研究ARGs的功能、预测未来可能出现的抗生素耐药性、研究新的抗生素以及寻找抗生素的替代品奠定了基础；并且与其他组学技术联用, 可以深入了解其转移机制, 对进一步优化污水生物处理系统操作参数、ARGs处理方式以控制其在环境中的传播具有重要指导意义(安新丽等, 2019).

在最近几年的研究中, Zhao等(2019)从华南地区市政污水生物处理系统取得SAS和废水, 启动间歇反应器并利用宏基因组学来研究AS过程中高浓度抗生素对微生物群和ARGs性能的影响.研究结果表明抗生素的存在显著降低了微生物多样性, 引起了微生物群结构的巨大变化, 并对潜在的抗生素抗性细菌的富集施加了选择性压力, 对控制ARB和ARGs的发展和传播提供了有益的指导.Ju等(2019)在瑞士的12个污水处理厂分别原位采集进水、反硝化池、消化池、出水的微生物样品并联合使用宏基因组和定量宏转录组的方法对其进行抗性基因组的定性和定量分析.研究结果表明12个污水处理厂所有工段均能检测到抗性基因, 其丰富度与细菌群落组成及生物量浓度密切相关；污水处理厂排放到环境中的抗性基因的绝对数量在很大程度上取决于出水中残留的细菌绝对生物量, 因此任何大幅度减少排放污水中细菌生物量的措施, 如适当延长二沉池的水力停留时间或生物膜处理工艺, 都将减少未来污水厂抗性基因的排放总量.同时研究还表明抗生素抗性基因和可移动遗传原件之间具有共线性关系, 大规模人类病原体参与了抗性基因的水平转移.Xia等(2019)研究表明芳香族化合物导致废水处理生物反应器中抗生素抗性基因丰度增加.Gianluca Corno等(2019)研究表明污水处理厂的废水促进了接收淡水水体中抗生素抗性基因的快速稳定.

4 结论(Conclusions)

宏组学方法使我们对污水处理系统中的微生物群落结构、代谢基因、途径等有了更加深入的认识, 也是发现新的物种与代谢途径的有力工具之一, 极大地加深了我们对污水生物处理系统运行的理解；同时, 也使我们更清楚地认知了污水生物处理系统中ARGs的发生、进化、发展和扩散等特征, 为最大化去除污水中抗性基因奠定基础, 这对降低ARGs对人类健康的威胁具有重大意义.除了在污水生物脱氮、强化生物除磷菌群以及ARGs等方面的应用外, 宏组学方法在探究污水生物处理系统其他重要功能性微生物菌群(Zhang et al., 2019)、藻类(田美等, 2016；皮永蕊等, 2019)、以及病毒(Wang et al., 2018)等方面也得到了广泛的应用.

5 展望(Prospect)

宏组学方法在污水生物处理系统应用中面临着一些挑战, 如核酸提取作为宏组学研究的第一步, 其提取效果对后续的分析会产生重要影响, 污水样品的复杂性对DNA和RNA等的提取带来了一定挑战, 因此, 选择合适的提取策略在组学研究中十分重要；单个宏组学分析所产生的数据集在通量和质量上迅速提高, 使多组学研究具有可行性, 但随之而来的是海量的生物信息数据, 如何充分合理的利用这些数据来成为多组学技术的关键步骤.除宏组学以及其联合使用之外, 污水生物处理系统的新突破需要与微生物学其他方法相结合以及跨学科协同创新以加速新的发现, 这些学科包括环境科学、计算、高级成像、材料科学和工程学等.正如人类基因组计划跨越传统生物、物理、工程、社会科学领域得以开拓科学新领域和开发新技术一样, 下一代污水生物处理系统微生物研究的进步也需要进一步加强微生物学、生态学和工程领域传统视角、概念和方法学之间的交叉融合.

参考文献
Abram F, Enright A M, O'reilly J, et al. 2011. A metaproteomic approach gives functional insights into anaerobic digestion[J]. Journal of Applied Microbiology, 110(6): 1550-1560.
Aguiar-Pulido V, Huang W, Suarez-Ulloa V, et al. 2016. Metagenomics, metatranscriptomics, and metabolomics approaches for microbiome analysis: supplementary issue: bioinformatics methods and applications for big metagenomics data[J]. Evolutionary Bioinformatics, 12: EBO. S36436 https://www.onacademic.com/detail/journal_1000040119133810_9541.html
安新丽, 苏建强. 2019. 活性污泥抗生素抗性基因研究进展[J]. 微生物学通报, 46(8): 2069-2079.
安迎锋, 王虹玲. 2018. 宏基因组技术在新型生物燃料生产酶制剂开发中的应用[J]. 微生物学杂志, 038(005): 1-8.
薄明森. 2018.石油污染土壤中芳香烃双加氧酶基因多态性及宏基因组测序[D].乌鲁木齐: 新疆大学 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10755-1018833774.htm
崔凯, 吴伟伟, 刁其玉. 2019. 转录组测序技术的研究和应用进展[J]. 生物技术通报, 35(7): 1-9.
Chen S X, Wang L, Han Z Y. 2014. Applications of metaproteomics in the study of wastewater biotreatment process[J]. The Journal of Applied Ecology, 25(10): 3056-3066.
陈亚松. 2019.综合污水处理厂深度脱氮的优化运行与微生态机理研究[D].南京: 南京大学
成敏. 2018.高效除磷活性污泥中功能菌解析及其除磷基因组学基础研究[D].西安: 西安建筑科技大学 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10703-1018861537.htm
Corno G, Yang Y, Eckert E M, et al. 2019. Effluents of wastewater treatment plants promote the rapid stabilization of the antibiotic resistome in receiving freshwater bodies[J]. Water Research, 158: 72-81.
Crovadore J, Calmin G, Chablais R, et al. 2017. Metatranscriptomic and metagenomic description of the bacterial nitrogen metabolism in waste water wet oxidation effluents[J]. Heliyon, 3(10): e00427.
Dai H, Wu Y, Peng L, et al. 2017. Effects of calcium on the performance, bacterial population and microbial metabolism of a denitrifying phosphorus removal system[J]. Bioresource Technology, 243: 828-835.
邓晔, 冯凯, 魏子艳, 等. 2016. 宏基因组学在环境工程领域的应用及研究进展[J]. 环境工程学报, 10(7): 3373-3382.
Deng Y, Ruan Y, Ma B, et al. 2019. Multi-omics analysis reveals niche and fitness differences in typical denitrification microbial aggregations[J]. Environment International, 132: 105085.
冯晓远, 王风平. 2018. 宏基因组学分析揭示深古菌Bathyarchaeota B242的代谢特征[J]. 微生物学通报, 45(1): 11-18.
Feng Y, Zhao Y, Guo Y, et al. 2018. Microbial transcript and metabolome analysis uncover discrepant metabolic pathways in autotrophic and mixotrophic anammox consortia[J]. Water Research, 128: 402-411.
Fresia P, Antelo V, Salazar C, et al. 2019. Urban metagenomics uncover antibiotic resistance reservoirs in coastal beach and sewage waters[J]. Microbiome, 7(1): 1-9.
Gao H, Mao Y, Zhao X, et al. 2019. Genome-centric metagenomics resolves microbial diversity and prevalent truncated denitrification pathways in a denitrifying PAO-enriched bioprocess[J]. Water Research, 155: 275-287.
Ghosh S, Love N G. 2011. Application of rbcL based molecular diversity analysis to algae in wastewater treatment plants[J]. Bioresource Technology, 102(3): 3619-3622.
Guo J, Li J, Chen H, et al. 2017. Metagenomic analysis reveals wastewater treatment plants as hotspots of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements[J]. Water Research, 123: 468-478.
Handelsman J, Rondon M R, Brady S F, et al. 1998. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes:a new frontier for natural products[J]. Chemistry & Biology, 5(10): R245-R249.
Hendriksen R S, Munk P, Njage P, et al. 2019. Global monitoring of antimicrobial resistance based on metagenomics analyses of urban sewage[J]. Nature Communications, 10(1): 1-12.
胡海燕, 刘慧敏, 孟璐, 等. 2019. 宏基因组学在微生物抗生素抗性基因检测中的应用[J]. 微生物学通报, 46(11): 3110-3123.
胡少达, 郭锦, 邹少兰, 等. 2016. 宏蛋白质组学在活性污泥研究中的应用[J]. 应用与环境生物学报, 22(4): 725-731.
Huang W, Gong B, Wang Y, et al. 2020. Metagenomic analysis reveals enhanced nutrients removal from low C/N municipal wastewater in a pilot-scale modified AAO system coupling electrolysis[J]. Water Research, 173: 115530.
Ju F, Beck K, Yin X, et al. 2019. Wastewater treatment plant resistomes are shaped by bacterial composition, genetic exchange, and upregulated expression in the effluent microbiomes[J]. The ISME Journal, 13(2): 346-360.
鞠峰, 张彤. 2019. 活性污泥微生物群落宏组学研究进展[J]. 微生物学通报, 46(8): 2038-2052.
Kleiner M. 2019. Metaproteomics:Much More than Measuring Gene Expression in Microbial Communities[J]. mSystems, 4(3): 36-42.
Law Y, Kirkegaard R H, Cokro A A, et al. 2016. Integrative microbial community analysis reveals full-scale enhanced biological phosphorus removal under tropical conditions[J]. Scientific Reports, 6(1): 1-15.
Lawson C E, Wu S, Bhattacharjee A S, et al. 2017. Metabolic network analysis reveals microbial community interactions in anammox granules[J]. Nature Communications, 8: 15416.
Li J, Peng Y, Zhang L, et al. 2019. Quantify the contribution of anammox for enhanced nitrogen removal through metagenomic analysis and mass balance in an anoxic moving bed biofilm reactor[J]. Water Research, 160: 178-187.
李金龙. 2018.基于Fe基质生物载体的低C/N比污水自养反硝化脱氮研究[D].北京: 北京交通大学
李俊锋. 2015.基于16S rRNA和宏基因组高通量测序的微生物多样性研究[D].北京: 清华大学
李霜. 2018.基于代谢组学的数据标准化方法的综合评价[D].重庆: 重庆大学
Li W, Zhuang J, Zhou Y, et al. 2020. Metagenomics reveals microbial community differences lead to differential nitrate production in anammox reactors with differing nitrogen loading rates[J]. Water Research, 169: 115279.
李旺, 倪萍, 周成林. 2018. 丙型肝炎患者血清病毒宏基因组学研究[J]. 检验医学与临床, (12): 13.
刘伟, 寇国栋. 2018. 代谢组学研究技术及其应用概述[J]. 生物学教学, (9): 2-4.
Mao Y, Yu K, Xia Y, et al. 2014. Genome reconstruction and gene expression of "Candidatus Accumulibacter phosphatis" Clade IB performing biological phosphorus removal[J]. Environmental Science & Technology, 48(17): 10363-10371.
Makowska N, Philips A, Dabert M, et al. 2020. Metagenomic analysis of β-lactamase and carbapenemase genes in the wastewater resistome[J]. Water Research, 170: 115277.
Miao Y, Liao R, Zhang X X, et al. 2015. Metagenomic insights into salinity effect on diversity and abundance of denitrifying bacteria and genes in an expanded granular sludge bed reactor treating high-nitrate wastewater[J]. Chemical Engineering Journal, 277: 116-123.
Muller E E L, Glaab E, May P, et al. 2013. Condensing the omics fog of microbial communities[J]. Trends in Microbiology, 21(7): 325-333.
Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. 1999. 'Metabonomics':understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica, 29(11): 1181-1189.
Patti G J, Yanes O, Siuzdak G. 2012. Innovation:Metabolomics:the apogee of the omics trilogy[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 13(4): 263.
皮永蕊, 吕永红, 柳莹, 等. 2019. 微藻-细菌共生体系在废水处理中的应用[J]. 微生物学报, 59(6): 1188-1196.
彭永臻, 钱雯婷, 王琦, 等. 2019. 基于宏基因组的城市污水处理厂生物脱氮污泥菌群结构分析[J]. 北京工业大学学报, 45(1): 95-102.
Quince C, Walker A W, Simpson J T, et al. 2017. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis[J]. Nature Biotechnology, 35(9): 833-844.
Rodríguez-Valera F. 2004. Environmental genomics, the big picture?[J]. FEMS Microbiology Letters, 231(2): 153-158.
Roume H, Heintz-Buschart A, Muller E E L, et al. 2015. Comparative integrated omics:identification of key functionalities in microbial community-wide metabolic networks[J]. npj Biofilms and Microbiomes, 1: 15007.
Tian H, Hu Y, Xu X, et al. 2019. Enhanced wastewater treatment with high o-aminophenol concentration by two-stage MABR and its biodegradation mechanism[J]. Bioresource Technology, 289: 121649.
田美, 刘汉湖, 申欣. 2016. 基于新一代测序技术的A2O与BIOLAK活性污泥宏基因组比较分析[J]. 环境科学, 37(2): 638-646.
Tian M, Zhao F, Shen X, et al. 2015. The first metagenome of activated sludge from full-scale anaerobic/anoxic/oxic (A2O) nitrogen and phosphorus removal reactor using Illumina sequencing[J]. Journal of Environmental Sciences, 35: 181-190.
Velculescu V E, Zhang L, Zhou W, et al. 1997. Characterization of the yeast transcriptome[J]. Cell, 88(2): 243-251.
王楚彪, 卢万鸿, 林彦, 等. 2018. 转录组测序的发展和应用[J]. 桉树科技, 35(4): 27-33.
王丹, 吴冬梅, 刘嘉佩, 等. 2018. 海洋细菌SAR86研究进展[J]. Marine Sciences, 42(9): 135.
王启全. 2019.生物炭及降解菌剂对污染土壤微生物及功能基因的影响[D].哈尔滨: 东北农业大学 https://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&filename=1019180089.nh
王荣昌, 王超颖, 曾旭. 2017. 污水处理过程中抗生素抗性基因的检测及其水平转移机制的研究进展[J]. 环境化学, 36(12): 2567-2573.
Wang Y, Jiang X, Liu L, et al. 2018. High-resolution temporal and spatial patterns of Virome in wastewater treatment systems[J]. Environmental Science & Technology, 52(18): 10337-10346.
Wang Y, Niu Q, Zhang X, et al. 2019. Exploring the effects of operational mode and microbial interactions on bacterial community assembly in a one-stage partial-nitritation anammox reactor using integrated multi-omics[J]. Microbiome, 7(1): 1-15.
王原飞. 2018.风湿性心脏病肠道菌群宏基因组学分析[D].昆明: 昆明医科大学 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10678-1018289360.htm
Wang Z, Zhang X X, Lu X, et al. 2014. Abundance and diversity of bacterial nitrifiers and denitrifiers and their functional genes in tannery wastewater treatment plants revealed by high-throughput sequencing[J]. PloS One, 9(11): e113603.
Xia J, Sun H, Zhang X, et al. 2019. Aromatic compounds lead to increased abundance of antibiotic resistance genes in wastewater treatment bioreactors[J]. Water Research, 166: 115073.
Yang Y, Li B, Zou S, et al. 2014. Fate of antibiotic resistance genes in sewage treatment plant revealed by metagenomic approach[J]. Water Research, 62: 97-106.
Yang Y, Pan J, Zhou Z, et al. 2020. Complex microbial nitrogen-cycling networks in three distinct anammox-inoculated wastewater treatment systems[J]. Water Research, 168: 115142.
Yu K, Zhang T. 2012. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of microbial community structure and gene expression of activated sludge[J]. PloS One, 7(5): e38183.
赵贝贝. 2018. 水体富营养化成因及危害[J]. 山西农经, (9): 69.
Zhao R, Feng J, Liu J, et al. 2019. Deciphering of microbial community and antibiotic resistance genes in activated sludge reactors under high selective pressure of different antibiotics[J]. Water Research, 151: 388-402.
Zhang Y, Hua Z, Lu H, et al. 2019. Elucidating functional microorganisms and metabolic mechanisms in a novel engineered ecosystem integrating C, N, P and S biotransformation by metagenomics[J]. Water Research, 148: 219-230.
张怡淼. 2019. 抗性基因在水环境中的检测手段和去除技术[J]. 中国新通信, 21(1): 223-224.
Zhu H, Chen H, Zhang D, et al. 2007. Development in research methods of activated sludge bacterial community[J]. Acta Ecologica Sinica, (01): 314-322.