1 引言(Introduction)

随着湖泊富营养化问题的加剧, 蓝藻水华问题日益突出, 受到社会的广泛关注.蓝藻水华暴发最直接的影响是水体生态环境, 使水质变差, 水生生态平衡遭到破坏.蓝藻向水体中分泌有毒化合物, 其中微囊藻毒素(Microcystins, MCs)产生的量最大, 危害最为严重(谢平, 2015).欧洲、美洲、亚洲、非洲等全球各地几乎都有MCs的分布(Preece et al., 2017).MCs是一组单环七肽化合物, 一般化学结构式为环(D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸).其中, Adda是一种特殊的氨基酸, 其结构为3-氨基-9-甲氧基-2, 6, 8-三甲基-10-苯基-4, 6二烯酸.X、Y为两种可变的L-氨基酸, 由于X、Y的不同而产生多种异构体, 其中存在最普遍、毒性较大的是MC-LR、MC-RR和MC-YR, L、R和Y分别为亮氨酸(Leucine)、精氨酸(Arginine)和酪氨酸(Tyrosine)(姜锦林等, 2011).

目前大多数研究都集中于MCs对水生生物的影响, 包括沉水植物、鱼类等(Wu et al., 2017; Wang et al., 2018).然而, MCs通过一些途径也会进入土壤中, 如用含有藻毒素的水农田灌溉、直接用蓝藻作为肥料施用农田及河岸渗滤等措施(Chen et al., 2006; 操庆等, 2016).进入土壤中的MCs不仅对陆生植物的生长造成不良影响, 还可能通过生物富集作用进入食物链, 从而对人体健康造成威胁(Machado et al., 2017).研究表明, 用含有MCs的自然水体灌溉生菜、萝卜、白菜等作物后, 其可食部位累积的MCs会对人类健康造成潜在威胁(Mohamed et al., 2009; Cao et al., 2018a).Xiang等(2019)的研究发现, 我国南方蓝藻污染水体周边的农田普遍受到MCs污染, 农田土壤中MCs总含量为0.5 ~ 186.3 μg·kg^-1, 且受污染农田种植的蔬菜中MCs的检出率高达90.9% ~ 100%, 蔬菜中MCs的含量为0~381.4 μg·kg^-1.蓝藻污染地区菜地中微囊藻毒素污染对人类健康造成了潜在威胁.

进入土壤的MCs会被土壤颗粒吸附, 土壤性质决定了土壤颗粒对MCs的吸附能力, 一般土壤中有机碳和粘土含量高的土壤其去除MCs的效率也高(Morris et al., 2000；Miller et al., 2001).关于MCs在土壤中的降解的研究目前仍不多, 一般认为土壤中MCs的降解作用主要是微生物降解, 其降解半衰期是6~18 d(Chen et al., 2006；Cao et al., 2018b).目前, 土壤中还未被降解的MCs要如何降低其生物有效性还缺乏研究.考虑到凹凸棒石、蒙脱石等天然粘土矿物对溶液中的MCs有很好的吸附作用(Liu et al., 2019), 且绿色无污染、价格低廉, 也常被用来修复重金属和有机污染物污染的土壤, 减少污染物的生物有效性(王宝琳等, 2013; 张金秀等, 2019).因此, 本研究采用土壤添加的方法, 探究不同比例的3种天然粘土矿物添加剂对土壤中MCs的生物富集作用.研究结果以期为土壤-作物系统中MCs的潜在风险的预防提供科学指导.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 供试材料和试剂

供试作物为生菜种子购于北京绿东方农业技术研究所, 品种属于意大利全年耐抽薹生菜(Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.).MC-LR标准溶液购于台湾藻研有限公司(纯度＞95%), 使用前贮存于-40 ℃冰箱.

供试土壤采自太湖滨湖荒地表层(0~15 cm), 土壤无MCs接触历史.采集土壤后带回实验室去除石块等杂物后混匀, 过筛(2 mm).一部分土壤在室温下自然风干后用于测定土壤理化性质, 剩余的土壤保存于4 ℃冰箱.供试土壤为砂壤土, 基本理化性质如下：pH为7.05；有机质含量为9.26 g·kg^-1；总氮含量为0.74 g·kg^-1；碱解氮含量为61.8 mg·kg^-1；速效磷含量为18.3 mg·kg^-1；速效钾含量为118 mg·kg^-1；阳离子交换量为(Cation-exchange capacity, CEC)112 mmol·kg^-1；砂粒含量43.2%, 粉粒含量46.2%, 黏粒含量10.6%.

供试粘土矿物, 凹凸棒石(Attapulgite)、蒙脱石(Montmorillonite)、沸石(Zeolite)分别产自江苏盱眙、河南信阳和浙江安吉, 其理化性质如表 1所示.供试粘土矿物磨碎后过筛(100目)待用.

2.2 实验方法

挑选籽实饱满且大小一致的生菜种子, 用次氯酸钠溶液(0.5%, W/V)对种子进行消毒, 随后用去离子水洗净.取消毒后的种子播撒于含有泥炭土的托盘, 播种7 d后选取长势一致的生菜幼苗作为供试作物.

实验以盆栽的方式进行, 分别将供试的3种粘土矿物以2.5%和5%(质量分数)的比例加入到6 kg土壤中, 充分混匀后装盆, 随后加入适量的水(田间最大持水量的60%)平衡.实验共设置8个处理(表 2), 分别为：空白处理(CK), 不加入粘土矿物；添加2.5%和5%凹凸棒石处理(AT 2.5%, AT 5%)；添加2.5%和5%蒙脱石处理(MO 2.5%, MO 5%)；添加2.5%和5%沸石处理(ZE 2.5%和ZE 5%)；质控处理(QC), 不加入粘土矿物, 也不灌溉MC-LR溶液.每个处理3个平行, 共24盆.所有花盆随机摆放, 置于恒温(25 ℃)玻璃温室中.试验期间每3 d随机调整一次盆栽位置, 使生菜能够获得均匀光照.每盆施肥量保持一致, 混合装盆时一次性添氮(N)0.30 g·kg^-1、磷(P₂O₅)0.18 g·kg^-1、钾(K₂O)0.24 g·kg^-1.

待平衡完毕, 将生菜幼苗移栽到各处理的花盆中, 每盆种植3株, 待生长20 d后间苗至2株.生长期间用含有10 μg·L^-1MC-LR的去离子水灌溉生菜(质控处理灌溉等量去离子水), 每日灌溉量为300 mL, 各处理灌溉水用量保持一致.培养期间各处理之间的其他田间管理保持一致, 每周进行一次除草.生菜种植50 d后收获, 采集生菜的叶片和根系, 用去离子水冲洗干净、擦干后置于-40 ℃保存；植物收获后, 各盆的土壤混匀后取约50 g收集, 置于-40 ℃冰箱中保存.

2.3 测试与分析方法 2.3.1 植株生物量测定

生菜地上和地下部生物量, 待收获后用去离子水洗净, 擦干后用电子秤称量.

2.3.2 植物中MC-LR的测定

采用Bittencourt-Oliveira等(2016)的方法提取生菜组织中的MC-LR.取约1 g新鲜生菜组织用70%甲醇(V/V)研磨, 最终加入15 mL 70%甲醇制成匀浆.匀浆液在超声5 min后离心15 min(4 ℃, 10000 r·min^-1).重复此提取步骤2次, 收集3次离心的上清液, 将其通过HLB萃取柱(200 mg, Oasis, Waters, USA), 随后用100%甲醇淋洗萃取柱, 淋洗液用旋转蒸发仪蒸干.最后用300 μL 70%的甲醇溶解毒素, 保存于-40 ℃冰箱待测.最后采用ELISA试剂盒(Beacon)测试植物中的MC-LR含量, 具体操作步骤按试剂盒说明书进行.本文实验结果所指生菜中MC-LR含量均为鲜重.

2.3.3 土壤中MC-LR的测定

土壤中MC-LR总量和有效态含量按Wu等(2012)的方法处理.有效态MC-LR的提取：①将冷冻干燥后约2 g土壤样品用研钵碾碎, 随后用30 mL 30%甲醇和0.1 mol·L^-1 EDTA-0.1 mol·L^-1 Na₄P₂O₇混合溶液(pH≈3)超声10 min, 离心10 min(4 ℃, 5000 r·min^-1)后收集上清液, 重复2次, 合并上清液；②上清液通过Sep-Pak C₁₈(500 mg)萃取柱, 用10 mL 20%的甲醇洗脱杂质, 再用10 mL 100%甲醇洗脱富集柱, 将收集的洗脱液用氮吹仪吹干；③残留物用60%甲醇溶解, 保存于-40 ℃冰箱待测.总MC-LR的提取：①与有效态提取的前两步相同, 收集氮吹仪吹干的残留物；②收集前一步中离心后的土壤, 并用烘箱60 ℃烘干；③将①的残留物和②的土壤分别用50 mmol·L^-1 KMnO₄和100 mmol·L^-1 NaIO₄(pH≈9)在20 ℃氧化1 h；④将氧化后的溶液通过Sep-Pak C₁₈(500 mg)萃取柱, 用10 mL 20%的甲醇洗脱杂质, 再用10 mL 100%甲醇洗脱富集柱, 将收集的洗脱液用氮吹仪吹干；⑤残留物用60%甲醇溶解, 保存于-40 ℃冰箱待测.最后采用ELISA试剂盒(Beacon)测试土壤中的MC-LR含量, 具体操作步骤按试剂盒说明书进行.

2.3.4 估计每天摄入量的计算

估计每天摄入量(Estimated Daily Intake, EDI)=植物组织中的MC-LR含量(μg·kg^-1)×每日植物组织摄入量(kg)÷摄入者体重(kg).其中, 假设一个60 kg重的成年人每日摄入生菜40 g；一个25 kg重的儿童每日摄入生菜10 g(Lee et al., 2017; Levizou et al., 2017).健康风险评估是将EDI数值与WHO推荐的每日允许摄入量(Tolerable Daily Intake, TDI)限值(0.04 μg·kg^-1·d^-1)(WHO, 1998)相比较.

2.4 统计分析

用Excel 2013和SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析.结果采用单因素方差分析(One way ANOVA)和Duncan多重比较进行分析处理.p < 0.05则有显著性差异.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 不同粘土矿物添加对生菜根系和叶片生物量的影响

与质控处理相比, 灌溉10 μg·L^-1的MC-LR的空白处理, 以及凹凸棒石、蒙脱石和沸石在2.5%和5%两种添加量时, 对生菜根系和叶片的生物量均无显著影响(图 1).对于MCs对植物的影响, 不同的研究结果相差较大.李慧明等(2009)研究表明用含有8 μg·L^-1 MC-LR的水灌溉青菜即会显著降低其根长和株重.Zhu等(2018)的研究表明, 用10 μg·L^-1及以上浓度的MC-LR水灌溉后, 黄瓜株重、叶面积等生长指标都显著降低.与之相反, 本课题组之前的研究表明, 用含有浓度50 μg·L^-1及以下的MC-LR水培养生菜, 其根长、株重均未受到显著影响(Cao et al., 2018c).Azevedo等(2013)的研究也表明78 μg·L^-1及以下浓度的MC-LR对水稻株重无显著影响.不同研究所得结果不同一方面是由于种植的作物品种, 另一方面是由于种植的条件不同.此外, 本实验结果还表明添加2.5%和5%的粘土矿物对生菜生物量无显著影响, 因此无需担心添加粘土矿物对生菜产量造成影响.

3.2 粘土矿物添加对土壤中MC-LR的总量和有效态含量的影响

生菜收获后, 土壤中MC-LR的总含量和有效态含量如图 2所示.质控处理土壤中未检测出MC-LR, 图中未标出.3种粘土矿物在2.5%和5%添加量时均对土壤中MC-LR的总含量无显著影响.当添加量为2.5%时, 3种粘土矿物土壤中MC-LR有效态含量较对照组均有所降低, 但影响不显著；当添加量为5%时, 凹凸棒石和蒙脱石处理土壤有效态MC-LR含量分别较空白降低了49.1%和40.7%；添加沸石处理有效态MC-LR含量也有所降低, 但较空白不显著.

由于结构、成分的不同, 不同粘土矿物对MCs表现出了不同的吸附性能.Liu等(2019)的研究表明, 表面积大的粘土矿物对MC-LR表现出了更大的吸附性, 蒙脱石对MC-LR的吸附性能要显著高于高岭石和伊利石.尽管本研究中所用的沸石的比表面积最大, 但在对MCs的吸附固定作用上却不及凹凸棒石和蒙脱石.这主要是因为pH值、有机质含量等其它外界因素也会影响粘土矿物对MCs的吸附(Liu et al., 2019a; 2019b).在土壤介质中粘土矿物对MCs的吸附、稳定化效果不仅仅取决于粘土矿物本身的吸附性能.土壤中粘土和有机质含量也会影响土壤颗粒对MCs的吸附性(Morris et al., 2000).Miller等(2001)的研究发现, 与砂质土相比, 有机碳和粘土含量最高的土壤其吸附MCs的效率也是最高的.MCs在土壤中吸附于粘土矿物的机理还有待深入研究.不同处理中微囊藻毒素总量之间差异不显著, 说明土壤中添加粘土矿物对微囊藻毒素的微生物降解作用无显著影响.此外, 通过分析土壤中有效态MC-LR的含量和生菜根系及叶片中MC-LR的富集量的关系(图 3)可知, 随着土壤中有效态MC-LR含量的增加, 生菜中MC-LR的富集量也呈增加趋势.这也说明土壤中有效态MC-LR含量的降低是生菜根系和叶片中MC-LR富集量降低的主要原因.

3.3 不同粘土矿物添加对生菜根系和叶片中MC-LR富集的影响

生菜收获后, 其根系和叶片中MC-LR的含量和总累积量如图 4所示.质控处理生菜根系和叶片均未检出MC-LR, 图中未标出.空白处理生菜根系和叶片中MC-LR含量和总累积量均为各处理最高, 叶片中MC-LR含量达到148 μg·kg^-1, 总累积量为7.03 μg；根系中MC-LR含量达到99.1 μg·kg^-1, 总累积量为1.51 μg.凹凸棒石在2.5%的添加量时显著降低了生菜根系中MC-LR的含量；而2.5%添加量下蒙脱石和沸石则无显著影响.当3种粘土矿物添加量为5%时, 三者均显著降低了生菜根系中MC-LR的富集, 分别降低了48.1%、43.8%和16.1%.而各处理根系中MC-LR的总累积量则均无显著差异.各处理生菜叶片中MC-LR的含量和总累积量趋势一致.2.5%添加量时, 只有凹凸棒石显著降低了叶片中MC-LR的富集, 而5%添加量时3种黏土矿物均显著降低了MC-LR在生菜叶片中的富集.5%添加量的凹凸棒石和蒙脱石处理中, 生菜叶片中MC-LR含量为43.6 μg·kg^-1和47.3 μg·kg^-1, 总累积量分别为3.41 μg和3.43 μg, 与空白处理相比均降低达50%以上.

不同的作物对MCs的富集能力不同.Peuthert等(2007)研究表明, 大豆、豌豆、小麦、玉米等11种作物暴露于5 μg·L^-1的MC-LR 24 h后, 其茎叶中富集的MC-LR含量为4~44 μg·kg^-1(鲜重)不等, 与本研究结果不尽相同.Lee等(2017)用10 μg·L^-1的MC-LR灌溉生菜4周后, 其根系和叶片中富集的MC-LR含量分别约为102 μg·kg^-1(鲜重)和65 μg·kg^-1(鲜重), 均低于本实验的研究结果.MC-LR在植物中的富集, 一方面受暴露的MC-LR浓度、时间的影响, 一般来说, 暴露的MC-LR浓度越高、时间越长, 植物中累计的MC-LR含量越高(Machado et al., 2017)；另一方面, 受作物生长介质的影响, 一般水培条件下植物中MC-LR的积累量要远高于土培条件, 这主要是因为土壤作为生长介质固定了一部分进入土壤的MC-LR(Morris et al., 2000；Miller et al., 2001).尽管越来越多的研究开始关注土壤-作物系统中的MCs, 但目前仍无关于减轻MCs生物富集危害的报道.而以往的研究表明, 向土壤中添加粘土矿物通过降低重金属在土壤中的生物有效性和迁移性, 从而减少作物对重金属的吸收(Usman et al., 2005；任静华等, 2017).本研究借鉴土壤重金属修复的经验, 利用粘土矿物对MCs的吸附性, 研究发现土壤中添加粘土矿物能够减少生菜根系和叶片中MC-LR的富集.

3.4 粘土矿物对MC-LR每日估计摄入量的影响

不同粘土矿物添加对EDI的影响如表 3所示.对照处理中成人和儿童的EDI均超过了WHO的每日允许摄入量, 成人EDI高达0.066 μg·kg^-1·d^-1.与本研究结果一致, Lee等(2017)和Cordeiro-Araújo等(2016)也发现食用10 μg·kg^-1 MC-LR灌溉的生菜, 成人和儿童的每日估计摄入量均超过了WHO的TDI标准.本课题组先前的研究表明(Cao et al., 2018a), 即使用天然的蓝藻污染湖水灌溉, 收获后生菜叶片中累积的MCs含量也会超过WHO的TDI标准.MCs污染水体灌溉带来的健康风险不容忽视.

通过对添加粘土矿物处理的EDI分析发现, 添加量在2.5%时, 3种粘土矿物处理成人EDI有一定程度的降低, 但仍超过了TDI限值；儿童EDI则均降至TDI限值以下.凹凸棒石和蒙脱石添加量在5%时, 成人和儿童的EDI均降低至TDI限制以下；而添加5%沸石时儿童的EDI降低至TDI限制以下, 成人EDI则仍高达0.041 μg·kg^-1·d^-1.本研究结果表明, 添加5%凹凸棒石和蒙脱石处理生菜EDI均降低到TDI限值以下, 有效消除了食用MCs污染水体灌溉的生菜带来的潜在威胁.首次针对土壤-作物系统中MCs污染问题提出了有效的控制措施.不过不同土壤类型和培养条件下粘土矿物对于MCs的固定效果、粘土矿物参与下土壤中MCs的环境行为等问题还有待深入研究.

4 结论(Conclusions)

土壤中添加土壤重量2.5%和5%的供试粘土矿物均对生菜生物量无显著影响；添加粘土矿物对土壤中MC-LR的总含量无显著影响, 但显著降低了有效态MC-LR含量；5%添加量时3种供试粘土矿物均能显著降低生菜叶片中MC-LR的富集；5%的凹凸棒石和蒙脱石添加处理能够有效消除MC-LR水体灌溉带来的健康风险.本文的研究为土壤-作物系统中MCs的污染控制提供了解决思路和方法, 但是实际运用过程中还需要考虑成本问题.如果全部按5%的剂量添加会大大增加生产成本, 因此一方面需要根据农田土壤的实际污染情况调整添加剂用量和添加范围；另一方面今后还需要加强对粘土矿物改性和其他添加剂筛选的研究, 探索更适用于MCs污染农田的高效土壤添加剂.